Summary
결핵 및 말라리아는 인간과 열대 빈곤 인구의 사망률과 사망의 주요 원인에서 가장 널리 감염의 두 가지입니다. 우리는 감염의 자연 경로를 통해 두 병원체 공격 후 마우스에서 말라리아 결핵 동시 감염의 결과를 연구하는 실험 모델 시스템을 구축.
Abstract
Coinfections 자연적으로 인해 병원체의 고유 한 유형의 지리적 중복으로 발생합니다. 동시 감염은 대부분 각각의 단일 병원체에 각각의 면역 반응을 조절함으로써 병인과 질병의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. Coinfected 환자는 항 감염 개입에 차별적으로 응답 할 수 있습니다. 마이코 박테리아 및 사하라 사막 이남의 아프리카의 많은 지역에서 coendemic 둘 중 말라리아 기생충 변형체,,에 의해 발생으로 결핵 사이의 동시 감염은 자세히 연구되지 않았습니다. 과학적으로 말라리아와 결핵의 동시 감염의 변조한다 호스트의 면역과 각 질병의 과정, 우리는 우리가 coinfected 호스트에 두 병원체 유발 면역 반응을 해부 할 수있는 실험 쥐 모델을 구축하는 방법을 임상 적으로 관련성이 높은 문제에 도전하지만 접근하기 위해 . 참고로, 가장 정확하게 모방 자연적으로 획득 한 인간 감염하기 위해, 우리는 실험 수행각각 감염의 자연 경로, 즉 에어로졸 및 모기에 물린에 의해 모두 병원균과 생쥐의 감염.
Introduction
인간의 인구는 거의 하나의 병원체에 노출되지 않습니다. , 특히 사하라 사막 이남의 아프리카와 같은 감염의 높은 발생률과 지역에서 coinfections이 주요하지만 매우 과소 공중 보건 문제를 나타냅니다. 결핵 및 말라리아는 각각 인간에서 가장 널리 세균 및 기생충 감염이며, 열대의 빈곤 인구의 사망률과 사망의 주요 원인이 될 것을 계속한다. 동시 감염의 위험이 결핵 및 말라리아 및 개인의 많은 사이의 넓은 지리적 중복에도 불구하고, 거의 동시에 coinfected 개인의 말라리아 기생충과 결핵균에 대한 유도 다양하고 종종 대항하는 면역 규제와 이펙터 사이의 상호 작용에 대해 잘 알려져 있습니다.
혼합 감염의 설치류 모델은 따라서 상호 influ에 빛을 흘리는, 하나의 호스트에 서로 다른 병원균에 대한 차등 면역 반응의 특성을 수또한 치료와 예방을위한 새로운 권고를 식별하는 데 도움이 될 것입니다 변조 병리 및 개별 질병의 임상 결과를, 화상 으. 우리는 같은 호스트 1에서 결핵균 (Mtb의)와 동시 감염에 의한 파급 효과 및 설치류 변형체 종을 조사하기 위해 우리를있게 실험 쥐 모델을 설립했다. 중요한 것은, 최대한 자연스럽게 인수 인간의 감염을 에뮬레이션하기 위해, 우리의 모델은 모두 병원균에 의해 사용되는 감염의 자연 경로를 구현합니다. 결핵은 따라서 주로 폐에 명시 공기 감염이다. 그들이 기침이나 재채기를하는 동안 전염성 에어로졸 방울을 추방 할 때 원인 물질은 Mtb의는 에어로졸 경로를 통해 활성 질환을 가진 사람에 의해 전달된다. 따라서, 에어로졸 감염은 자연 감염을 모방하는 선택의 방법입니다. 상기 Mtb 포함될 부유 입자의 생성은 사용에 의해 달성 될 수있다흡입 노출 시스템. 이 전신 노출 챔버는 전염성 에어로졸 방울 감염이 시작됩니다 폐의 폐포에 흡입된다 (그림 1) Mtb의이 함유에 실험 동물을 노출 할 수 있습니다.
반면에 말라리아는 자연스럽게 여성 Anopheline 모기에 물린 상처에 의해 전송되는 원생 동물, apicomplexan 기생충 원충에 의한 벡터 매개 질병입니다. 혈액 식사 중에 감염성 포자 소체가 숙주의 피부 아래에 증착되고이어서 혈류를 통해 간암을 도달한다. 간세포 내에있는 개발하고 신속하게 간 단 schizonts에 곱합니다. 결국, 성숙 schizonts 파열 그들은 적혈구 침입, 복제, 적혈구 파열 및 reinvasion 3의 진보적 인 사이클을 시작할 위치를 혈류로 병원성 첫 번째 세대 merozoites의 수천을 놓습니다. 변형체 수명주기 콘틴일부 merozoites 등의 단말은, 성적 기생충 단계로 혈액 식사하는 동안 모기에 의해 흡수 될 수있는 남성과 여성의 생식 모세포를 개발. 모기에 변형체 포자 소체는 모기의 중장에 거주하는 접합자에서 개발하고 결국 다른 호스트 3,4에 이후 전송 침샘으로 이동한다.
실험 동물 모델에서 에어로졸 때문에 대부분의 관련 경로를 통해 결핵균의 배송은 매우 일반적인 있지만, 말라리아 결핵 동시 감염 5-7에 대한 연구 등 많은 실험 쥐의 변형체 감염 연구는 상승을주는, 기생 적혈구와 마우스를 감염에 의해 수행되었습니다 임상 침묵 간 단계의 단계를 제외하면서 혈액 단계 말라리아 감염. 그러나, 간 단계는 안티 plasmodial 면역 8-11에 대한 감염과 관련 중에 필수 단계입니다. 우리는 간 산도를 포함하는 것이 것이 중요 고려말라리아 전송 각각 말라리아 말라리아와 결핵의 동시 감염, 모두의 연구에서 유지 보수의 ASE. 또한, 자연적으로 전송 포자 소체 대신 격리 된 침샘 파생 포자 소체를 주입 물린 모기에 의해 말라리아 감염을 설정하는 우리를 묻는 메시지가 바늘 감염 (12)을 통해 전송되는 것보다 더 전염성이 것으로 나타났습니다. 말라리아 기생충의 자연 전송 감염 모기를 얻을 수있는 유일한 방법은 척추 호스트 (여기에 마우스) 및 모기 벡터에서 모두 기생충의 전체 라이프 사이클을 유지하는 것입니다. 따라서, 기생충 유지에 insectary 액세스가 물린 상처에 의해 천연 전송을 수행하기 위해 불가피하다.
여기에 설명 우리의 프로토콜은 변형체와 동시 감염은 만성 결핵 1에 미치는 영향을 포자 소체 방법을 조사하기 위해 개발되었다. 이렇게하려면, 마우스는 에어로졸 M.에 감염되어 결핵 및 40일 후, 때 M. 결핵 감염은 쥐가 말라리아 감염 모기에 노출되어, 만성 단계에 도달했습니다. coinfected 동물 말라리아 및 결핵 모두의 결과는 각각 조직에서 혈액 기생충과 세균 부하를 모니터링하여 다음에 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 자연 감염 경로와 방법을 성공적으로 병원체의 전송을 확인하는 방법 모두를 통해 병원균과 쥐를 감염하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리 손에 실험 모두 감염 일반적으로 달성 감염률은 100 %입니다. 이러한 프로토콜은 가장 도전적인 인간의 전염성 질환의 두 가지 사이에 동시 감염을 모델링하고 공부하는 우리가 별도로 감염이나, 모두를 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 모델은이 프로토콜에 설명 된 것 이외에 다른 진균 및 설치류 변형체 종에 적용 할 수있다.
Protocol
안전 대책 및 윤리 정책
제시된 연구는 여기에 인간의 병원체 Mtb의 및 설치류 말라리아 기생충 변형체 berghei (P. berghei)와 함께 작업을 포함한다. Mtb의 (변형 H37Rv)와 P. 실험 berghei 적절한 바이오 안전성 조건 하에서 수행되어야합니다. 바이오 안전성 레벨 (BSL) 2 실험실은 같은 피와 같은 설치류 말라리아 기생충에 필요한 따라서 berghei과 Mtb의를위한 BSL 3는 모든 동시 감염 연구를 위해 여기에 설명. 참고 : Mtb의에 감염된 쥐가 바로 인근에 다른 마우스에 (우리 자신의 관찰을) 감염이 확산되지 않습니다. 실험에 확산 때문에 제외 될 수 있지만 적절한 보호 복은 항상 BSL 3 실험실 안에 착용해야합니다. 우리의 규칙에 따르면, 실험자는 외부 하나가 언제에게 폐기가되는 외과 수술, 헤어 네트, 일회용 호흡기, 장갑 두 쌍을 착용RMS는 캐비닛에서 제외됩니다. 새로운 다시 장에 들어가기 전에 배치됩니다. 두 개의 컨테이너, 2 % Buraton 한 (주 : Mtb의 불 활성화가 승인 다른 소독제가 승인 된 농도로 사용할 수 있습니다) 액체 및 감염성 폐기물과 표면 오염 제거를위한 하나, 실험 전에 준비 캐비닛 내부에 배치됩니다. 또한, 비닐 봉투는 고체 감염성 폐기물에 사용됩니다. 독일어 규칙에 따르면, Mtb의에서 파생 된 MTB 자전거 문화 또는 조직의 취급 및 처리를 포함한 모든 작업은 마우스 BSL3 실험실 내에서 2 등급 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 감염. 마이코 박테리아를 처리하는 동안, 대책은 항상 에어로졸의 생성을 피하도록주의해야한다.
6~8주 세 사이의 여성 C57BL / 6 마우스 (찰스 리버는) 모든 동시 감염 실험에 사용 BSL의 특정 장벽 조건 3 시설에서 유지되었다. 동물 보호 및 실험은 PE했다농업, 환경, 슐레스비히 - 홀슈타인의 국가의 농촌 지역에 대한 정부의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 rformed
말라리아 모기 단계를 얻기 위해, NMRI 생쥐는 찰스 리버 연구소, Sulzfeld, 독일에서 구입 한 및 대학 하이델베르크 동물 시설 (IBF) 내에서 무균 조건 하에서 유지. 모든 동물 실험은 유럽의 규정에 따라 수행 바덴 뷔 르템 베르크 주 (Regierungspräsidium 카를 스루에)의 상태 당국에 의해 승인되었습니다.
1. GLAS-골 에어로졸 챔버를 사용하여 Mtb의와 마우스의 에어로졸 감염
Mtb의와 실험 동물의 에어로졸 감염을 표준화하는 가장 좋은 방법은 알려진 CFU 역가와 냉동 주식에서 마이코 박테리아를 사용하는 것입니다. 주식의 문화를 준비하려면, 미들 7H9 국물 문화 Mtb의는 OADC (올레 보충산, 알부민, 덱 스트로스, 카탈라제) 농축 중형 및 0.05 % 트윈 80, 마이코 박테리아에 대한 탄소 공급원과 동시에 세균의 응집을 방지하기 위하여 측정한다. 문화는 수확시에 외경 ≤ 1이 있어야합니다. 높은 OD에서, 박테리아의 응집이 증가하고 생존 능력 감소. C. ° -80에서 보관 1 ㎖ 분량 씩 0.5 % 글리세롤, 1g / L 아스파라긴 보충 7H11 한천 접시에 세 가지 독립적 인 유리 병의 10 배 희석 시리즈를 도금하여 냉동 주식에 단위 (CFU)를 형성 가능한 식민지의 수, OADC을 결정하고 4 후 식민지를 열거 37 ° C에서 배양 주 아래에 설명 된대로 에어로졸 감염을 수행합니다.
- 신중하게 해동 MTB 자전거 알려진 CFU 역가의 주식과는 27 G 바늘 장착 된 1 ML의 주사기를 사용하여 세균 덩어리를 분산하기 위해 서스펜션 다섯 번 섞는다. 에어로졸의 생성을 피할 수 있습니다.
- 원하는 감염 량에 따라, 마이코 박테리아에 콘텐츠의 볼륨을 전송 필요멸균 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브. 최종 부피는 10 ㎖의입니다. NOTE :이 현탁액에, 미생물의 수를 조절함으로써, 에어로졸 방울 베어링 박테리아의 비율이 변화된다. 우리는 일반적으로 폐 (저용량 감염) 당 100 가능한 균의 이해를 목표로하고 있습니다. 우리의 경험이 5.5 ㎖를 분무하는 6 ML의 총 부피의 1 ~ 2 × 10 6 Mtb의 / ㎖ (아래 참조)이 필요합니다. 그것은 당신의 감염에 대한 최적의 조건을 찾기 위해 박테리아의 다른 농도로 실험 에어로졸 도전하는 일련의 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 최대 5000 미코 박테리아와 고용량 감염 5 박테리아 적게 성공적 에어로졸로 생쥐에 감염하는 데 사용될 수있는 한, 감염성 과정을 가속화하기 위해 수행 될 수있는 반면. 감염 속도는 일반적으로 100 %입니다.
- 접종 역가를 결정하는 도금을 위해 (필요한 최종 부피를 초과 준비) 충분한 볼륨을 제거, 우리가 일반적으로 기술 삼중를 플레이트에 500 μl를 제거합니다.
- 에 동물을 배치복실 메쉬 원형 에어로졸 챔버 내의 바스켓 (바구니 당 하나의 마우스) 및 에어로졸 챔버의 뚜껑을 닫습니다. 주 : 다른 모델이 20 쥐를 수용 할 수있는 각각의 다섯 각각의 구획으로 구성 원형 모양의 바구니를 갖추고 있습니다.
- 세 스테인리스 소켓 조인트 벤 투리 - 분무기 장치를 연결합니다.
- 18 G 무딘 바늘로 장착 된 10 ㎖ 주사기로 50 ML 튜브에서 마이코 박테리아 현탁액을 제거하고 밀폐 된 운송 상자에 에어로졸 챔버에 주사기를 수행한다.
- 분무기 장치의 나사 캡을 제거하고 조심스럽게 분무기로 마이코 박테리아 현탁액을 주사. 에어로졸의 생성을 피하십시오. 2 %를 함유 Buraton 미강 용기에 주사기를 버린다. 스크류 캡으로 분무기를 밀봉.
- 주 전원 스위치와 UV 램프를 전환합니다. 제어 키패드 디스플레이는 "GLAS-콜기구 협력"을 보여줍니다.
- 프로그램의 스위치를 켭니다. 디스플레이 의지보여 "분무기가 준비 됐나요?" "바구니가 장착되어 있습니까?"준비가되면 Enter 키를 누르십시오. " Enter 키를 누르십시오.
- 디스플레이는 "예열 시간 900 입력"을 보여준다이 900 초입니다 (배출 공기를 decontaminates) 소각로의 예열 시간을 의미한다. Enter 키를 누르십시오.
- 디스플레이는 표시 "Nebulizing 시간 1,800 입력"을 것이다이 nebulizing 시간은 기본적으로 1800 초 설정을 의미합니다. nebulizing 시간을 연장하기 위해, "2400"을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 참고 : nebulizing 사이클 동안, 압력 공기가되어 결핵균을 포함하는 작은 에어로졸 방울을 생성, 현탁액을 분무. 주 공기 흐름,이 액적 (크기는 약 2-5 μM)는 에어로졸 챔버로 운반된다.
- 디스플레이는 표시 "CD 시간 1,800 입력"을 것이다이 붕괴 사이클이 1,800 초 소요 것을 의미한다. "2400"를 입력하고 Enter를 누르십시오로 설정합니다. 참고 :이주기 동안, 클라우드하는 u에게 내장 된nebulizing주기 동안 에어로졸 챔버 p는 부패 할 수 있습니다. 작은 물방울은 실험 동물에 흡입된다.
- 디스플레이는 "12 월 시간 (900)를 입력합니다"가 표시됩니다, 이것은 자외선 살균주기가 900 초를 취할 것을 의미합니다. Enter 키를 누르십시오. 기계는 예열, nebulizing, 클라우드 부패와 UV 살균을 통해 순환하기 시작합니다.
주의 :; 및 사이클 시작 nebulizing 때 압축 공기 유량계 10입방피트 / 시간이 (점검, 따라서 공기 제어 밸브를 조정 진공 유량계 (필요한 경우 진공 조절 밸브를 조절 예열 사이클이 시작될 때 선택) 60입방피트 / 시간을 표시해야 ). - 사이클이 완료되면 키패드는 "프로세스 완료 - 표본을 제거"보여줄 것이다. 프로그램, UV 및 주 전원 스위치를 끄십시오.
- 미코 박테리아 현탁액을 분무하고 완전하지 않을 경우, 정중 장착 적절한 주사기와 서스펜션을 제거하여 남은 볼륨을 기록 하였는지 확인18 G 무딘 바늘. 나머지 볼륨 이상 1 ㎖이어야한다.
- 관절에서 분무기를 제거하고 2 시간의 최소 2 % Buraton가 들어있는 냄비에 배치, 보통 소독은 O / N.에게 수행 그 후, 새로운 팬에 분무기를 전송하고 물로 깨끗이 헹군다. 공기 건조에 분무기를 남겨주세요.
- 에어로졸 챔버를 열고 자신의 새장에 동물을 반환합니다. 오토 클레이브 가방과 오토 클레이브 가방 바구니. . 안전을 위해 전원이 공급되는 공기 정화 호흡기가이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다 : 2 % Buraton 주와 에어로졸 챔버의 내부 표면을 닦아냅니다.
- 7H11 한천 플레이트에 기술 세중 (3 × 100 μL)의 접시 10 배 희석 (단계 1.3 참조) 마이코 박테리아 현탁액의 나머지 500 μl를 사용.
2. 폐에 원하는 CFU의 이해를 확인
실험 동물의 에어로졸 감염 후 어느 날 세균 LO를 결정원하는 CFU의 이해를 확인하기 위해 지정된 제어 동물의 폐에있는 광고. 참고 : 우리는 보통 하루에 1 CFU 결정을위한 3-5 마우스의 별도의 그룹을 지정합니다.
시간 경과의 mtb 감염 과정을 모니터링하기 위해, 마이코 박테리아 티슈 부담 CFU 검지 전체 장기 균질의 일련의 희석액을 도금에 의해 검사 될 수있다. 폐 결핵의 질병 증상에 대한 기본 사이트 그러나 비장, 간, 림프절은 보통 따라 분석이다. 도금 될 희석 조직뿐만 아니라 행 기관 및 시점에 다른 세균 부하를 일으킨다 초기 접종 (고용량 대 저용량)에 따라 기관의 예상 미코 박테리아 하중에 의존 분석. 저용량 감염되면, 폐 Mtb의 H37Rv의 세균 부하는 일반적으로 하루에 25 ~ 30 사이의 고원에 도달한다.
- CO 2 질식 또는 : 안락사 동물 (안락사를 배치터미널 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 해부 보드에 흡수 종이에 마취), 70 % 에탄올로 마우스를 소독. 참고 : 70 % 알코올은 표면의 오염 제거 용으로 Mtb의를 죽일 수 없습니다.
- 복부의 중간에 작은 절개를하고 머리 위에 마우스 피부를 후퇴.
- 수술 가위로 복부와 흉부 케이지를 열고 폐 액세스 할 수 있도록 흉부 벽을 제거합니다.
- 폐를 제거하고 균질화 버퍼 (멸균 / 1 %의 v / V 트윈 1분의 80 중량 % / V 알부민)과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 작은 배양 접시에 100 ㎛의 체를 통해 5 ML의 주사기 변형 폐의 플런저를 사용.
- 세척 체를 여러 번 장벽 팁을 탑재 한 1 ㎖ 피펫을 사용하여 8 한천 플레이트 사이에 폐 균질 배포 (CA 250 μL / 판;. 있는지 그들은 잘 건조 된 표면을 가지고 있는지 확인).
- 조심스럽게 2 %에 버려진 일회용 살포기를 사용하여 샘플을 접시Buraton.
- 캐비닛 내부 건조 한천 플레이트를 남겨주세요. , 파라 필름으로 모든 단일 플레이트를 밀봉 알루미늄 호일에 싸서 적어도 4 주 동안 37 ° C에서 똑바로 품어.
3. 탈출 방지 모기 케이지 건설
설치류 변형체 균주는 인체에 유해하지 않습니다. 그러나, Mtb의 감염된 생쥐는 기생충과 작업받는 사람이기 때문에이 BSL 3 조건에서 이루어집니다,주의 사항은 자신의 새장을 탈출하는 모기를 방지하기 위해 필요합니다. 계획 감염의 처방에 따라, 고압 멸균 및 금속 프레임 케이지 또는 직접 만든 일회용 케이지 재사용을 사용할 수 있습니다. 실험 동물의 물린 감염에 의해 마우스 당 모기의 정의 수에 의해 수행 될 것을 요구되는 경우에 후자의 사람을 권장합니다. 자체 제작 케이지가 필요한 경우, 모기와 실험실의 안전 보건 등의 정확한 사양에 새장을 준비는 게 아무것도에 따라 달라집니다차 구조 (그림 2).
- 같은 반 파인트 아이스크림 상자 또는 종이 커피 컵 (그림 2)와 같은 상자를 가져 가라.
- 상자의 측면에 작은 구멍을 잘라 모기에 대한 보안 입구를 만들 수있는 각 조각으로 잘라 슬릿 라텍스의 두 층으로 커버. 참고 : 개방 2cm × 2 cm의 전체 크기를 가지고, 우리가 가지고 및 / 또는 테이크 아웃 모기를 위해 사용하는 튜브 (흡인기 장치)는 진공 펌프에 부착 된 수정 15 ML 팔콘 튜브이며, 따라서 역할 1.5 cm의 직경을 갖는 흡입기.
- 물감을 흡수하기 위해 상자의 안쪽 하단에 필터 종이를 테이프.
- 그물 (나일론 메쉬의 더블 레이어, 크기 1mm x 1 ㎜)과 아이스크림 컵을 닫고 테이프와 고무 밴드로 상자에 고정.
- 마우스 당 모기의 정의 번호가 필요 감염 실험을 위해, 15 감염된 모기에 새장을 준비하는 각 이상적으로 AV를 포함10,000 야생형 침샘 P.의 erage berghei의 포자 소체.
- 이상적으로, 이전에 혈액 식사를 수행하는 24 시간 동안 모기를 굶어.
4. 모기에 물린 상처에 의해 쥐의 말라리아 감염
여기에 사용되는 설치류 말라리아 기생충은 P.입니다 berghei 그러나 또한 다른 설치류 변형체 균주가 사용될 수있다. 감염 모기를 얻으려면 포자 소체 전송을 위해 기생충의 전체 수명주기는 척추 호스트 (마우스)와 모기 벡터에서 모두 유지됩니다. 기생충의 유지 보수 insectary에서 수행된다. 자연의 전송 실험을 위해, 침샘 당 포자 소체의 최소 수는 더 적은 10,000 이상이어야한다. 자세한 프로토콜의 기생충 관리에 우리는 여자 이름 등으로 말라리아 연구 방법을 참조하십시오., 2013.
- 순진 마우스 또는 케타민과 Mtb의와 40 일 동안 preinfected 동물을 마취시키다 (100 ㎎ / ㎏)복강 내 주사 (200 μL / 마우스)에 의해 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏) 솔루션입니다. 참고 : Mtb의 변형체와 감염 사이의 시간은 기본 연구 문제에 따라 조정할 수 있습니다. 마찬가지로, 병원체 도전 순서가 역전 될 수있다, 즉 마우스는 종래의 mtb 감염으로 감염성 모기에 물린에 노출 될 수있다.
- 모기 케이지 (마우스 비율 정의 모기 모기 케이지 당 하나의 마우스)의 그물에 마취 마우스를 놓고 모기가 10 ~ 15 분 동안 멤브레인을 공급 할 수 있습니다. 참고 : 모기 용기에있는 혈액의 존재는 먹이 때문에, 포자 소체 전송을 의미한다.
- 다시 자신의 새장에 마우스를 이동하고 마취에서 깨어 때까지 지속적으로 감독. 종이 수건이 아니라 침구 (질식의 위험)에 장소 마우스 및 (긴밀히 장소와 종이 타월로 몸을 커버)을 따뜻하게 유지 : 주.
- 순중량을 70 % 에탄올이나 다른 소독제로 살포하여 모기를 죽이케이지의 주입. 처분 할 수있는 사람이 사용 된 경우 오토 클레이브 케이지 및 폐기.
5. 모니터링 기생충
- 빵꾸 꼬리는 매우 바늘로 종료하고 슬라이드의 각 끝 부분에 혈액 한 방울을 수집에서 정맥.
- 슬라이드의 길이의 절반 이상이 혈액 한 방울을 끌어 다른 슬라이드를 사용합니다. 제 스미어위한 다른 에지를 사용하는 확산기 위에 플립. 건조한 공기에 슬라이드를 둡니다.
- 지엠 사 (Giemsa) 염색
- 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입하고 절대 메탄올 간단한 침수에 의해 혈액 얼룩을 고정합니다. 참고 : 유리 도자기의 사용은 우리가 모든 솔루션을 폴리 프로필렌 큐벳을 사용하는 BSL 3 최소한으로 유지해야하기 때문에.
- 지엠 사 (Giemsa)의 번지 (탈 이온수 1:10)을 담가. 10 분 후, 여분의 얼룩을 멀리 씻어 탈 이온수로 몇 번 못 염색 큐벳에서 밖으로 슬라이드를 찍어.
- 마지막으로, 수직 위치에서 공기 건조 슬라이드.
- 대안 얼룩 : 라이트 & #180;의 얼룩
- 메탄올 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 라이트의 얼룩을 녹입니다.
- 사용하기 전에 접은 필터를 통해 필터링합니다.
- 염색 용액에 혈액 얼룩을 담그고 4 분 동안 배양한다 (참고 : 염색 액을 기준으로 메탄올 같이 얼룩의 메탄올 고정이 필요하지 않습니다).
- 상술 한 바와 같이 탈 이온수 세척 슬라이드로 세척하고 건조한 공기에 슬라이드를 둡니다.
- 지엠 사 (Giemsa) / 라이트의 기미가 완료되면, 부드럽게 Buraton 함유 폐기 냄비에 사용 된 모든 시약을 전송합니다.
- 혈액 얼룩 분석
- 기름 침수와 100 배의 배율로 광학 현미경에 의해 스테인드 혈액 얼룩을 분석합니다.
- 적혈구가 단층 배열되어 혈액 도말 표본의 영역에 감염되지 않은 감염된 적혈구 횟수.
- 잘 정의 기생충을 달성하기 위해서, 적혈구 단층 표시 뷰의 적어도 10 개의 다른 필드를 센다.
- calcul을적혈구의 수에 의해 기생 적혈구 수를 나누고 100을 곱하여 (% 단위)의 상대 기생충 먹었다.
Representative Results
Mtb의와 P.과 생쥐의 감염 자연적인 경로, 즉 에어로졸 및 모기에 물린 각각, 모든 동물 (표 1)의 일관성 및 재현성 감염의 결과를 통해 berghei 1. 우리는 성공적으로 감염과 혈액 각각 (P. berghei의 기생충) 및 다른 장기에 결핵균 부담의 초기 발생 (prepatency) 및 기생충의 수를 결정하여 말라리아와 결핵 모두의 과정을 모니터링 할 수 있습니다. 감염성 모기에 물린 상처에 의해 성공적인 말라리아 기생충 송신의 예를 표 1 및도 3에 도시된다. 4-5일 이상 (표 1 및 그림 3A) 혈액 단계 기생충의 존재에 의해 확인 된 각각의 마우스에 10 포자 소체에 감염된 모기의 먹이가 100 %의 감염률 결과. 중요한 것은, 우리는 같은 실험 GR의 개인 마우스의 혈액에서 유사한 기생충 번호를 찾을 수OUP, 일관되고 재현 감염 모기에 물린 결과로 그 포자 소체 전송을 나타낸다. Mtb의 - coinfected 동물의 그것과 순진 제어 생쥐의 prepatency을 비교함으로써, 우리는 prepatency 약간 Mtb의 (표 1, 그림 3B)와 preinfected했다 생쥐에서 지연 볼 수 있습니다 1. 우리가 이전에보고 한 것처럼 그림 (b)에 도시 한 바와 같이, 우리는 지엠 사 (Giemsa) 염색 혈액 도말 검사에서 매일 모니터링 기생충에 의해 말라리아의 코스에서 MTB 자전거 동시 감염의 영향을 확인할 수 있습니다.
개별적인 마우스 (도 4a) 간의 비교적 낮은 가변성과 폐의 박테리아의 성공적인 증착 흡입 노출 시스템의 결과를 이용하여 상기 Mtb 가진 마우스 감염. 우리는 폐와 CFU 결정에 의해 시간이 지남에 따라 관심의 다른 장기에 결핵균의 부하를 볼 수 있습니다. 의 폐에 결핵균 부하의 예MTB는 P.의 부재 또는 존재하에 C57BL / 6 마우스를 감염 berghei는 그림 (b)에 나타나있다.
표 1. Prepatency 모기에 물린 상처에 의해 포자 소체 전송 후. 모든 마우스는 P.의 자연 전송 후 혈액 단계 감염을 개발 berghei은 모기에 물린 상처에 의해 포자 소체. 1 PLoS 하나, 권한 7 (10), e48110에서 적응.
| 실험 군 마우스 (C57BL / 6) | 10 감염 모기에 물림에 의해 도전 | 그룹당 동물의 혈액 단계 긍정적 인 동물 / 호 번호 | 평균 prepatency [D] |
| 순진한 | P. berghei | 7분의 7 | 4,4 |
| MTB 감염 | P. berghei | 7분의 7 | 5,5 D> |
그림 1. 실험 절차의 전반적인 계획은. C57BL / 6 마우스는 GLAS-콜 에어로졸 챔버에서 Mtb의 함유 에어로졸 방울에 노출되어 있습니다. 어느 날 에어로졸 감염 후, 결핵균 이해는 폐의 CFU 분석에 의해 확인됩니다. (결핵에 감염된 생쥐에서 만성이되고있다) MTB 자전거 도전, 동물 P.에 노출되어 40 일 후에 berghei 모기를 감염. 성공적인 포자 소체 전송을 확인하고 변형체 감염의 과정을 따라, 기생충은 모기에 물린 후 3 일부터 지엠 사 (Giemsa) 염색 혈액 도말 검사에서 매일 모니터링합니다.
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그림 2. 모기 케이지의 스케치. 감염 모기는 같은 반 파인트 아이스크림 상자 같은 상자 내부에 포함되어 있습니다. 작은 구멍은 상자의 측면으로 절단하고, 모기에 대한 보안 입구를 만들 수있는 각 조각으로 잘라 슬릿 라텍스의 두 층으로 덮여있다. 필터 종이의 조각은 물감을 흡수하기 위해 상자의 안쪽 바닥에 녹화됩니다. 아이스크림 컵은 테이프와 고무 밴드로 상자에 고정 된 (나일론 메쉬) 그물 폐쇄됩니다.
그림 3. 기생 적혈구 (스케일 바, 20 & #을 보여주는 라이트`의 스테인드 혈액 얼룩의 혈액 기생충.) 예181;. 마우스의 혈액에있는 M) B) 기생충은 매일 지엠 사 (Giemsa) 염색 혈액 얼룩을 분석하여 모니터링 하였다. Coinfected 마우스는 변형체 단일 감염된 마우스 (N = 10)에 비해 감소 된 기생충을 가지고, 결과는 SD ± 의미로 표시됩니다 *** p <0.001. 1 PLoS 하나, 권한 7 (10), e48110에서 재판.
그림 4. 폐에 결핵균 검출은. C57BL / 6 마우스는 에어로졸 결핵균 100 CFU에 도전하고, P. 40 일 후, coinfected berghei 모기에 물린 상처에 의해.) 어느 날 에어로졸 감염 후 결핵균 원하는 수의 흡수가 CFU의 결정에 전체 폐 균질 도금에 의해 확인되었다. B) 박테리아동시 감염시 L로드는 CFU 분석 (d40/d0의 mtb)을 통해 3 마우스의 폐 용 해물에서 결정 하였다. 십이일 동시 감염 후 폐 해물 MTB 자전거 컨트롤의 변형체 동시 감염의 영향을 결정하기 위해 CFU 분석을 도금했다. 폐에 MTB 자전거 숫자는 P.에 동시 감염시 증가했다는 것을, 주 berghei NK65. X 축 라벨 : 동시 감염 후 MTB 자전거 -infection/time 후 시간. 1 PLoS 하나, 권한 7 (10), e48110에서 적응.
Discussion
우리는 쥐가 생산적으로 Mtb의와 P.에 감염 될 수있는 방법을 설명 감염의 자연 경로를 통해 berghei. 우리는 실험 결핵, 말라리아 13 또는 12를 연구하는 감염 프로토콜을 설립하고 최근에 마우스 모델 1 Mtb의와 변형체 사이의 동시 감염을 공부를 채택 적용됩니다.
성공적인 감염에 대한 가장 중요한 단계는 원하는 수의 양쪽 병원체의 전송이다. 그들은 시간이 지남에 따라 생존 능력을 상실하기 때문에 마이코 주식 2 세 이상하지 말아야하며, 주식의 원래 결정 역가가 가장 가능성이 더 이상 정확하지 않습니다. 결과적으로, 감염 량은 예상보다 훨씬 낮은 것이다. 따라서, 주식 문화의 CFU 역가는 몇 개월마다 결정되어야한다. 마찬가지로 중요한 첫 번째 장소에서 표준화 된 재배 및 MTB 자전거 주식의 세대입니다. 같은 배양 조건매체, 보조제, 시간 및 부피 MTB를 다른 재고품을 이용하여 실험 데이터를 비교할 수 있도록하기 위해 표준화되어야한다. 마이코 박테리아는 따라서 수확 박테리아 같은 성장 단계에서, 표준화 된 배양 조건을 유지하고 분취 동안 자주 재현 탁하는 것이 중요하다, 문화 중에 응집하는 경향이있다. 그렇지 않으면 CFU 역가와 감염의 결과에 다양한 변화가있을 수 있습니다.
균일 감염된 모기 배치의 생성은 또 다른 중요한 단계입니다. 다른 모기 각 마우스에 공급되므로, 한 감염 실험에 사용 모기 모두 동일한 배치에서 와서 모기의 90 % 이상이 감염들만 배치가 사용된다는 것이 중요하다.
현재의 모델은 하나의 감염된 호스트의 면역 반응과 비교하여 coinfected 호스트의 면역 반응과 면역 변조를 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 버지니아를 적용 할 수 있습니다이러한 조직 학적, 면역 조직 화학 염색, 면역 세포 집단의 세포 계측법 분석, 또는 그 조직이나 체액에 사이토 카인과 케모카인의 검출을위한 PCR과 ELISA로 rious 잘 설립 방법. 그런 마우스 모델 특정 제한이 있음을 유의해야한다. Mtb의 감염된 사람의 대부분은 임상 증상의 흔적과 잠재 감염을 개발하는 반면, 마우스는 진보적 인 폐 병리와 만성 질환을 개발합니다. 아직도, C57BL / 6 마우스는 MTB 자전거 감염에 상대적으로 저항하는 인간의 결핵 환자에서 관찰로 고전 육아종을 개발하지 않습니다. 결과적으로, 마우스에서 immunopathological 반응은 적절하게 어느 잠상 이용 인간 활성 결핵을 반영 않는다. 사람과 마우스의 잠재 및 만성 질환 사이의 차이에도 불구하고, 마우스는 광범위하게 MTB 자전거 감염을 통제하고 조사 할 가치있는 필수 도구입니다 호스트 요인을 파악하고 연구하는 데 사용되었습니다전염성 질병에 면역 반응. 중요한 것은, MTB 자전거 감염에 대한 감수성이 일반적으로 사용되는 근친 마우스 종자와 같은 DBA 또는 C3H으로 더 취약 변종 사이에 상당한 차이가 공동 및 단일 감염 연구에 포함 할 수 있습니다. 또한, 본원에 기재된 제외한 병원체 종, 또한 (예를 들어 임상 분리주) 임의의 다른 진균 종은 사용될 수있다. 단일 말라리아 모델은 인간의 질병 다른 마우스 모델의 모든 측면을 복제하지 않습니다 동안 마찬가지로, 밀접하게 자연적으로 획득 한 인간의 말라리아 감염의 다양한 측면을 닮은 않습니다. 예를 들어, P. berghei ANKA 및 P. yoelii YM/17XL 널리 P.으로, 인간 (P. falciparum의 유도) 중증 말라리아의 모델을 연구한다 berghei ANKA는 인간의 뇌 malari들 (14, 15)를위한 훌륭한 모델로 간주된다. P. berghei NK65는 hyperparasitaemia 급성 말라리아 빈혈을위한 훌륭한 모델, 그리고 최근에있다말라리아 관련된 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS MA-16)에 대한 실험적인 모델로 설명했다. 설명 동시 감염 모델을 사용하여, 우리는 최근에 보여줄 수있는 동시 P. berghei NK65 감염은 만성 결핵 1을 악화시킨다.
외에 다른 설치류 말라리아 기생충을 사용, 감염 사건의 순서와 타이밍은 기본 연구 문제에 따라 구성 될 수있다. 필드에 수반하는 변형체 감염은 MTB 자전거 감염시 현재 또는 이후에 취득 할 수있다. 두 경우 모두 Mtb의 및 변형체에 대한 면역 반응은 다르게 영향을받을 수 있습니다. 따라서, 마우스는 전이나 MTB 자전거 감염 후 하나 변형체 포자 소체에 감염 될 수있다. 또한, 마우스가 다른 시간에 도전 할 수있는 만성 급성 대에 변형체 유발 면역 반응의 영향을 평가의 mtb 감염을 남겨결핵. 말라리아 결핵 동시 감염을 연구 말라리아 기생충를 선택할 때 중요한 것은, 하나는 일부 설치류 변형체 변종은 특정 마우스 계통에 심각한 질병을 일으키는 원인과 Mtb의 만성 및 면역에 오래 지속되는 감염을 일으키는 동안 만 일 또는 주 이내에 감염에 굴복 알고 있어야합니다 마우스. 따라서, 동시 감염의 타이밍은 실험 동물의 조기 사망을 방지하기 위해 중요하다.
여러 병원체 종의 동시 감염에 의해 면역 작용의 변조는 제대로 이해 남아있다. coinfected 호스트의 면역 시스템과 Plasmodium의 상호 작용과 coinfections이 발병, 질병의 결과, 예방 접종, immunodiagnostics 및 치료에 영향을 미칠 수있는 방법을 우리의 이해에 기여할 것 - 우리의 실험 동시 감염 모델은 진균을 조사 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 모기의 번식을 위해 미리 암 에스테르에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 연구 센터 보르 스텔에서 사내 기금에서 지원하고 라이프니츠 센터 감염에 의해 자금 조달에 합류했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
| Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
| Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
| 24-slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
| Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
| Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
| Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
| Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
| Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |
References
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