Summary

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Published: October 11, 2013
doi:

Summary

Вируса болезни Ньюкасла (NDV) была тщательно изучена в последние несколько лет, чтобы развить новые векторы для вакцинации и терапии, среди других. Эти исследования стало возможным благодаря методов по спасению рекомбинантный вирус из кДНК, таких, как мы описываем здесь.

Abstract

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), член прототип Avulavirus рода семьи Paramyxoviridae 1, является несегментированная, отрицательной смысл, одноцепочечной, окутан РНК вируса (рис. 1) с потенциальными приложений в качестве вектора для вакцинации и лечение заболеваний человека. В глубокое исследование этих приложений стало возможным только после установления обратных методов генетики, чтобы спасти рекомбинантных вирусов из плазмид, кодирующих их полных геномов как кДНК 2-5. Вирусный кДНК может быть удобно модифицировать в пробирке с помощью стандартных процедур клонирования, чтобы изменить генотип вируса и / или включить новые транскрипционные единицы. Спасение таких генетически модифицированных вирусов представляет собой ценный инструмент, чтобы понять факторы, влияющие несколько этапов инфекции, а также позволяет для развития и совершенствования векторов для экспрессии и доставки антигеновдля вакцинации и терапии. Здесь мы опишем протокол для спасения рекомбинантных NDVs.

Introduction

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), птичий парамиксовирус, принадлежащая к роду Avulavirus 1, является экономически актуальны и таким образом широко исследованы и прослушивала зоонозных агент, который может серьезно повлиять на птицеводство по всему миру. Хотя это и не человеческий патоген, НДВ также хорошо изучены за пределы поля ветеринара и как модели парамиксовируса и из-за его высокой интересных, природных онколитических свойств 6. Исследование NDV большую пользу от развития обратных методов генетики для одноцепочечными, несегментированная отрицательной смысловой РНК вирусов, впервые описанных для вируса бешенства по Конзельманн и Вашии коллегами 2. Разнообразие генетически модифицированных NDVs, проведение чужеродных генов или модификации их дикого типа генома были широко изучены до сих пор. Работа с этих рекомбинантных вирусов имеет решающее значение для характеристики различных факторов вирулентности не только NDV но и другой соответствующей Хуман патогенов, таких как вируса гриппа А 7 – или возникающих Нипах вируса 8. Кроме того, ряд различных исследований исследовали использование этих методов для улучшения врожденную противоопухолевую активность NDV 6,9,10, в основном путем повышения иммуностимулирующие свойства вируса. Другая соответствующая область исследований на рекомбинантных NDVs было поколение вакцин-кандидатов против других вирусных заболеваний, таких как грипп 5,11,12, 13 ВИЧ кори 14, 15 SARS, или что вызвано дыхательных sincytial вируса (RSV) 16. Среди различных примечательных преимуществ, предоставляемых по NDV являются отсутствие существовавшие ранее иммунитета в человеческих популяциях, стабильность иностранных генетических вставок, отсутствия recombinatory деятельности и общих высоким профилем безопасности в сочетании с вышеупомянутым естественных иммуностимулирующих свойств 17. Стоит также отметить, потенциальное использование рекомбинантных двухвалентных вакцин в рoultry, защищает от обоих NDV и высокопатогенного гриппа птиц вирусы 11,12. Это может быть отличным способом, чтобы уменьшить шансы последнего распространяется от дикой к домашним животным, таким образом, также помогает предотвратить возможную межвидовой скачок страшного птичьего гриппа для человека. Наконец, репортер-выражения NDV были использованы для оценки врожденных иммунных реакций, а также идентификации интерферона антагониста, кодируемого нескольких вирусов 18-27.

Спасение процесс рекомбинантной несегментированная, вирус отрицательной мель РНК в основном состоит на искусственно заставляя вирусную цикл репликации в производящей клетки путем трансфекции кДНК, кодирующей минимальный инфекционный молекулярные машины, известной как рибонуклеопротеидных или RNP (рис. 2). В RNPs состоять из вирусной полимеразы (P и L белков), нуклеопротеина (NP) и полной длины антигеномного РНК вируса. Эта РНК + antigenome-йэ шаблон необходим для генерации дополнительных РНК-геномов, которые, также связанных с остальной частью белков вирусной RNP, повторяет тот же инфекционный комплекс, который естественным вирус бы выпустить на цитоплазме клетки при инфекции (рис. 2А ). От этого шага года, вирусная цикл может продолжаться естественным и рекомбинантные вирионы, encapsidating измененные геномы, будет генерироваться (рис. 2б). Примечательно, что трансфекции геномной кДНК вместо антигеномного кДНК значительно ухудшает или полностью отменяет эффективности спасательных 2,28-30. Даже когда антигеномного кДНК трансфицируют, эффективность капсидировани рекомбинантного РНК в РНП в трансфицированных клетках, вероятно, очень низка. Из-за этого, спасательные протоколы для NDV часто включают в себя различные шаги для амплификации нескольких вирусных частиц, выпущенных из первоначально трансфицированных клеток на сокультивировани их разрешающих клеток и / илиинфекция в яйцах с зародышем.

До спасения, кДНК можно манипулировать с помощью стандартных процедур клонирования в целях получения желаемых изменений. Хотя конкретные мутации различных генных продуктов и регуляторных последовательностей вируса может быть прямо достигается таким образом, многие из опубликованных работ с участием рекомбинантных NDV потребовало добавление нового единицы транскрипции в геном NDV. Как и другие члены семейства парамиксовирусов, геном НДВ кодирует восемь различных белков в шести транскрипционных единиц, которые по-разному выраженных в зависимости от их местонахождения относительно 3 'конца в убывающей градиентом критической для жизненного цикла вируса 1. Из-за этого, расположение нового транскрипционной единицы внутри генома должны быть тщательно подобраны, чтобы достичь баланса между экспрессии трансгена и ухудшение вирусной репликации. Вносимые между Р и М генов был использован самый, тHough другие сайты также были протестированы 13,31.

Какой бы ни была вставка, клонирование в НДВ кДНК необходимо следовать некоторым правилам, чтобы генерировать rescuable конструкцию: (I) любой новый ген, которые будут включены в геном NDV должен находиться под контролем соответствующих сигналов для вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы. Эти последовательности должны быть добавлены перед новой открытой рамки считывания (ORF), так полимераза может распознать конец предыдущей гена (GE) и началом нового трансгена (GS), расположенных на одной нуклеотидной межгенной последовательности (Ig) . Добавление действительного Козак (К) последовательности, чтобы улучшить эукариотической перевод рибосомальную также рекомендуется для лучшего выражения инородного белка 32; (II) эффективное тиражирование NDV, как и для большинства членов семьи Paramyxoviridae, зависит от длины генома быть кратна шесть 33, поэтому любая вставка в NDV должен следовать этому "правилу шести". При необходимости REQuired дополнительные нуклеотиды могут быть добавлены по потоку новый ORF, и (III) последовательность трансген должен быть проверен, чтобы найти можно GE и GS, такие как последовательности, которые могут ухудшить эффективность спасательных, экспрессию трансгена и / или вирусов жизнеспособность. Если присутствуют, эти последовательности должны быть удалены немого мутагенеза. Генерация рекомбинантного кДНК полной длины следующей вышеупомянутые правила является первым шагом для того, чтобы эффективно производить генетически модифицированного NDV как подробно здесь.

В системе все конструкции ДНК находятся под контролем полимеразы Т7 РНК промотора (рис. 3). Это цитоплазматический полимеразы приведена в транс по ко-инфекции с рекомбинантным модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA-Т7) 34. Фиг.3А показывает pNDV-B1 плазмиду, кодирующую полноразмерную кДНК антигеномного 5. Фиг.3В показывает Ptm1 плазмидами, кодирующими NP, P и L ОРС. Плазмиды pCITE-GFP, который кодирует, UNDER промотор Т7, зеленый флуоресцентный белок (GFP), и pCAGGs GFP 18, который кодирует ту же самую ORF под курица бета промотор актина 35, используют в качестве контрольной группы. В этом протоколе мы покажем процедуру, чтобы спасти рекомбинантный NDV из кДНК со сниженной вирулентностью НДВ штамм Hitchner B1 5 (рис. 4).

Protocol

1. Подготовка клетках млекопитающих (фиг. 4А, день 1) Сплит Нер-2 или А549 за день до трансфекции в 6-луночных планшетах. Плотность клеток должна достичь 80-90% слияния на следующий день. Как правило, сливающийся 100 мм блюдо можно разделить на 8 скважин (около 1 × 10 6 клеток на лу…

Representative Results

Спасение NDV является хорошо установленный порядок, регулярно проводится в лабораториях, которые имеют доступ к полному кДНК вируса. Тем не менее, внутренний стохастический характер метода делает его трудно достичь 100% эффективность помощь. Мониторинг ранние этапы процесса, специально …

Discussion

Несколько факторов должны быть рассмотрены для достижения хороших результатов во время спасения NDV. Во-первых, кДНК полной длины конструкция для использования должна быть разработана, чтобы позволить функциональное включение новых модификаций / трансгенов в геном NDV. Это означает, как…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить бывшие и нынешние участники в лабораториях доктора. Питер Палезе и Адольфо Гарсия-Састре для развития NDV обратной генетики методы и для оказания технической помощи. Исследования в вируса болезни Ньюкасла в AG-S лаборатории частично финансируется NIAD предоставить R01AI088770 и Министерства национальной науки и технологий безопасности Центра повышения квалификации для развивающихся и Болезни Зоонозных животных (CEEZAD, награда номер 2010-ST-061-AG001). Исследования в LM-S лаборатории финансируется грантами NIH РВЫХ1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, то NIAID центров передового опыта по борьбе с гриппом исследований и надзора (HHSN266200700008C) и Университета Рочестера Центр Biodefense иммунной моделирования (HHSN272201000055C) .

Materials

DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. . Fields Virology. , 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Play Video

Cite This Article
Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

View Video