Newcastlevirus (NDV) har studerats under de senaste åren för att utveckla nya vektorer för vaccinering och behandling, bland annat. Dessa studier har varit möjlig på grund av tekniker för att rädda rekombinant virus från cDNA, såsom de som vi beskriver här.
Newcastlesjukevirus (NDV), prototypen medlem av Avulavirus släkte av familjen Paramyxoviridae 1, är en icke-segmenterade, negativ-sense, single-stranded, omsluten RNA-virus (fig 1) med potentiella tillämpningar som en vektor för vaccination och behandling av mänskliga sjukdomar. Fördjupad undersökning av dessa ansökningar har bara blivit möjlig efter införandet av omvänd genetik att rädda rekombinanta virus från plasmider som kodar för sina kompletta genom som cDNA 2-5. Viral cDNA kan enkelt modifieras in vitro genom användning av standardklonings-förfaranden för att ändra genotypen av viruset och / eller att inkludera nya transkriptionsenheter. Räddning av sådana genetiskt modifierade virus utgör ett värdefullt verktyg för att förstå faktorer som påverkar multipla stadier av infektion, såväl som möjliggör utveckling och förbättring av vektorer för expression och tillförsel av antigenerför vaccinering och behandling. Här beskriver vi ett protokoll för att rädda rekombinanta NDVs.
Newcastlevirus (NDV), en avian paramyxovirus tillhör Avulavirus släktet 1, är en ekonomiskt relevant och därmed allmänt forskat och övervakade zoonotiska smittämnet, som allvarligt kan påverka fjäderfäuppfödning runt om i världen. Även om inte en mänsklig patogen, NDV har också studerats ingående utanför veterinär området både som modell paramyxovirus och på grund av sin mycket intressanta, naturliga oncolytic egenskaper 6. Forskning om NDV stor nytta av utvecklingen av omvänd genetik för enkelsträngade, icke-segmenterade negativ-sense RNA-virus, först beskrivna för rabiesvirus från Conzelmann och coleagues 2. En mängd genetiskt modifierade NDVs, bär främmande gener eller modifieringar av deras vildtyp genomet har studerats sedan dess. Arbetet med dessa rekombinanta virus har varit avgörande för att karakterisera olika virulensfaktorer inte bara av NDV utan också av andra relevanta human patogener som influensa A-virus 7 – eller den framväxande nipahvirus 8. Dessutom har ett antal olika studier undersökte användningen av dessa tekniker för att förbättra den inneboende antitumöraktivitet av NDV 6,9,10, främst genom att öka den immunstimulerande egenskaper av viruset. Annan relevant område av forskning på rekombinanta NDVs har varit alstringen av vaccinkandidater mot andra virala sjukdomar såsom influensa 5,11,12, HIV 13 mässlings 14, SARS 15, eller den som orsakas av det respiratoriska sincytial virus (RSV) 16. Bland de olika anmärkningsvärda fördelar som NDV är bristen på redan existerande immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten i de utländska genetiska insatser, brist på recombinatory aktivitet och övergripande en hög säkerhetsprofil i kombination med de ovan nämnda naturliga immunstimulerande egenskaper 17. Det är också anmärkningsvärt att potentiella användningen av rekombinanta bivalenta vacciner i poultry, virus skydd mot både NDV och högpatogen aviär influensa 11,12. Detta kan vara ett utmärkt sätt att minska risken för de senare sprids från vilda till tama djur, vilket också bidrar till att förhindra en eventuell interspecifik hoppa av den fruktade fågelinfluensan för människor. Slutligen reporter uttrycker NDV har använts för utvärdering av medfödda immunsvar samt identifiering av interferon antagonist kodas av flera virus 18-27.
Räddningsprocessen av en rekombinant, icke-segmenterade, negativ-strängat RNA-virus består i princip på ett konstlat sätt tvingar en viral replikationscykeln i en producerande cell genom att transfektera cDNA som kodar för den minimala infektiösa molekylära maskineri, som kallas ribonukleoprotein eller RNP (Figur 2). De RNPs bestå av det virala polymeraset (P-och L-proteiner), varvid nukleoprotein (NP) och fullängds-antigenomiskt RNA av viruset. Denna RNA + antigenom är the-mall som krävs för att generera de komplementära RNA-genom, som, även i samband med resten av proteinerna i den virala RNP, rekapitulerar samma smitt komplex som en naturlig virus skulle släppa på cellens cytoplasma vid infektion (Figur 2A ). Från detta steg framåt, kan den virala cykeln vidare naturligt och rekombinanta virioner encapsidating de modifierade genomen, kommer att genereras (Figur 2B). Anmärkningsvärt, transfektion av den genomiska cDNA istället för den antigenomiska cDNA försämrar kraftigt eller upphäver räddnings effektivitet 2,28-30 helt. Även när antigenomiskt cDNA transfekteras, är effektiviteten av inkapsling av det rekombinanta RNA in RNP i transfekterade celler antagligen mycket låg. På grund av detta, räddnings protokoll för NDV innehåller ofta olika steg för amplifiering av de få virus-partiklar som frigörs från de ursprungligen transfekterade celler genom samodling av dem med permissiva celler och / eller av deninfektion i embryonerade ägg.
Före räddnings kan cDNA manipuleras genom standardkloningsförfaranden i syfte att alstra de önskade modifieringar. Även om specifika mutationer av olika genprodukter och regulatoriska sekvenserna av virus kan rättframt uppnås på detta sätt, många av det publicerade arbete som involverar rekombinant NDV har krävt tillägg av en ny transkriptionsenhet in i NDV-genomet. Liksom andra medlemmar av paramyxovirus familjen, kodar NDV genomet åtta olika proteiner i sex transkriptionsenheter, som differentiellt uttrycks beroende på deras placering i förhållande till 3 'änden på en minskande gradient avgörande för virusets livscykel 1. På grund av detta måste platsen för den nya transkriptionsenheten inom genomet väljas omsorgsfullt för att uppnå en balans mellan uttrycket av transgenen och nedskrivning av viral replikation. Insättning mellan P-och M-gener har använts mest, tHough andra platser har också testats 13,31.
Oavsett insatsen, kloning i NDV cDNA måste följa vissa regler för att generera en rescuable konstruktion: (i) varje ny gen som ska ingå i NDV genomet måste vara under kontroll av lämpliga signaler för den virala RNA-beroende-RNA polymeras. Dessa sekvenser måste tillsättas uppströms om ny öppen läsram (ORF) så polymeraset kan känna igen slutet av föregående genen (GE) och början av den nya transgenen (GS), åtskilda av en enda nukleotid intergeniska sekvensen (IG) . Tillägg av en giltig Kozak (K) sekvens för att förbättra eukaryota ribosomala översättning rekommenderas också för bättre främmande proteinuttryck 32, (ii) effektiv replikering av NDV, som för de flesta medlemmar av Paramyxoviridae familjen är beroende av genomet längd är multipel av sex 33, varför någon insättning i NDV har att följa den här "regeln om sex". Om nödvändigt required ytterligare nukleotider kan läggas nedströms den nya ORF, och (iii) bör kontrolleras sekvensen av transgenen för att hitta möjliga GE och GS som sekvenser som kan inverka räddnings effektivitet, transgen uttryck och / eller virus livskraft. Om det finns, måste dessa sekvenser avlägsnas genom tyst mutagenes. Alstring av rekombinant fullängds-cDNA efter ovannämnda reglerna är det första steget för att effektivt framställa en genetiskt modifierad NDV som beskrivs här.
I det system som alla DNA-konstruktioner är under kontroll av T7-RNA-polymeras-promotorn (Figur 3). Detta cytoplasmiska polymeras tillhandahålles i träns genom saminfektion med en rekombinant modifierad vaccinia-Ankara-viruset (MVA-T7) 34. Fig. 3A visar pNDV-B1 plasmiden, vilken kodar för fullängds-antigenomiskt cDNA 5. Figur 3B visar pTM1 plasmider kodar NP, P-och L-ORF. Plasmider pCITE-GFP, som kodar, under T7-promotorn, grönt fluorescerande protein (GFP), och pCAGGS GFP-18, som kodar samma ORF under kyckling beta aktin-promotorn 35, används som kontroller. I detta protokoll visar vi det förfarande för att rädda rekombinant NDV från cDNA av den lentogena NDV-stammen Hitchner B1 5 (Figur 4).
Flera faktorer ska beaktas för att uppnå bra resultat samtidigt rädda NDV. Först den fullängds cDNA-konstruktion som ska användas måste utformas så att den funktionella införlivandet av nya transgener / ändringar i NDV genomet. Detta innebär, enligt ovan, att (i) lämplig gen end (GE), intergen (IG) och gen start (GS) sekvenser är att läggas till vid behov, (ii) det inte finns några förmodade GE eller GS-sekvenser i den utländska gen, och (iii) den fullständiga rekombinanta genomet följer den "reg…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i laboratorier Dr. Peter Palese och Adolfo García-Sastre för utveckling av NDV omvänd genetik och för tekniskt stöd. Forskning i Newcastlevirus i AG-S laboratorium är delvis finansierat av NIAD bevilja R01AI088770 och av Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence för nya och Zoonotic djursjukdomar (CEEZAD, utmärkelse nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratorium finansieras av NIH bidrag RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700008C), och The University of Rochester Centrum för Biodefense Immunmodeling (HHSN272201000055C) .
DMEM | CORNING Cellgro | 10-013-CV | Any supplier |
OptiMEM | GIBCO | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
35% Bovine Albumin (BA) | Sigma | 232-936-2 | Any supplier |
Trypsin-EDTA | CORNING Cellgro | 25-052-CI | Any supplier |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | CORNING Cellgro | 30-002-CI | Any supplier |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | Any supplier |
Cell lines |