Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Abstract

Newcastle disease virus (NDV), het prototype lid van de Avulavirus geslacht van de familie Paramyxoviridae 1, is een niet-gesegmenteerde negatieve-sense, enkelstrengs, omhuld RNA-virus (Figuur 1) met potentiële toepassingen als vector voor vaccinatie en behandeling van menselijke ziekten. Een grondige verkenning van deze toepassingen is pas na de oprichting van reverse genetics technieken om recombinante virussen van plasmiden die hun volledige genoom als cDNA 2-5 te redden mogelijk geworden. Virale cDNA kan gemakkelijk worden gemodificeerd in vitro met gebruikmaking van standaard klonering procedures om het genotype van het virus te veranderen en / of nieuwe transcriptie-eenheden omvatten. Redding van dergelijke genetisch gemodificeerde virussen een waardevol hulpmiddel om factoren die verschillende stadia van de infectie, en maakt de ontwikkeling en verbetering van vectoren voor de expressie en afgifte van antigenen begrijpenvoor vaccinatie en therapie. Hier beschrijven we een protocol voor de redding van recombinant NDVs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus 1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen 6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor hondsdolheid virus door Conzelmann en coleagues 2. Een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde NDVs, dragen vreemde genen of aanpassingen van hun wild-type genoom zijn uitgebreid bestudeerd sinds die tijd. Werken met deze recombinante virussen is cruciaal geweest om verschillende virulentiefactoren karakteriseren niet alleen van NDV, maar ook van andere relevante human ziekteverwekkers zoals influenza A virus 7 - of de opkomende Nipah virus 8. Voorts zijn verschillende studies het gebruik van deze technieken voor de aangeboren antitumorale activiteit van NDV 6,9,10 verbeteren, meestal door het verbeteren van de immunostimulerende eigenschappen van het virus onderzocht. Andere betrokken onderzoeksgebied op recombinante NDVs heeft de generatie van kandidaat-vaccins tegen andere virale ziekten zoals influenza geweest 5,11,12, 13 HIV, mazelen 14, SARS 15 of dat door de respiratoire sincytial virus (RSV) 16. Tussen de verschillende opmerkelijke voordelen van NDV zijn het gebrek aan reeds bestaande immuniteit in humane populaties, de stabiliteit van het vreemde genetische inserts, weinig recombinatory activiteit en de hoge veiligheidsprofiel combinatie met de bovengenoemde natuurlijke immunostimulerende eigenschappen 17. Opvallend is ook het potentiële gebruik van recombinant bivalente vaccins in poultry, beschermend tegen zowel NDV en hoogpathogene aviaire influenza virussen 11,12. Dit kan een uitstekende manier om de kansen van de laatste verspreiding van wilde naar gedomesticeerde dieren, ook als bijdrage aan een mogelijke inter-specifieke sprong van de gevreesde vogelgriep bij de mens te voorkomen te verminderen zijn. Ten slotte heeft reporter expressie NDV gebruikt voor de evaluatie van aangeboren immuunresponsen evenals de identificatie van interferon antagonist gecodeerd door meerdere virussen 18-27.

Het proces van terugwinning van een recombinant, niet-gesegmenteerde negatieve RNA virus bestaat hoofdzakelijk op kunstmatig dwingen een virale replicatiecyclus in een producerende cel door transfectie van cDNA dat codeert voor de minimale infectieuze moleculaire machinerie, bekend als ribonucleoproteïne of RNP (figuur 2). De RNP's bestaan ​​uit het virale polymerase (P en L eiwitten), de nucleoproteïne (NP) en de volledige lengte antigenoom RNA van het virus. Dit RNA + antigenoom the template nodig voor het genereren van de complementaire RNA-genomen, die ook samen met de rest van de eiwitten van het virale RNP, recapituleert hetzelfde infectieuze complex dat een natuurlijk virus zou vrijgeven aan het cytoplasma van de cel na infectie (Figuur 2A ). Vanaf deze stap verder, kan de virale cyclus natuurlijk doorgaan en recombinante virions, inkapselen de gemodificeerde genomen, worden gegenereerd (Figuur 2B). Opmerkelijk, transfectie van de genomische cDNA in plaats van het antigenome cDNA sterk vermindert of volledig afschaft redding efficiëntie 2,28-30. Zelfs wanneer antigenome cDNA getransfecteerd, de efficiëntie van de inkapseling van recombinante RNA in RNP's in getransfecteerde cellen is waarschijnlijk erg laag. Hierdoor redding protocollen voor NDV bevatten vaak verschillende stappen voor de amplificatie van het aantal virale deeltjes die vrijkomen uit de oorspronkelijk getransfecteerde cellen door coculturing hen permissieve cellen en / of deinfectie van bebroede eieren.

Vóór de redding, kan het cDNA worden gemanipuleerd met standaard kloneringswerkwijzen om de gewenste wijzigingen genereren. Hoewel specifieke mutaties van de verschillende genproducten en regulerende sequenties van het virus onomwonden worden bereikt Zo veel gepubliceerde werk recombinant NDV is de toevoeging van een nieuwe transcriptie-eenheid vereist in het NDV genoom. Net als andere leden van de familie paramyxovirus, het NDV-genoom codeert acht verschillende eiwitten in zes transcriptionele eenheden die differentieel uitgedrukt afhankelijk van hun locatie ten opzichte van het 3'-uiteinde in een dalende helling kritiek voor de virale levenscyclus 1. Hierdoor moet de locatie van de nieuwe transcriptie-eenheid in het genoom zorgvuldig worden gekozen om een ​​evenwicht tussen expressie van het transgen en aantasting van virale replicatie te bereiken. Insertie van P en M-genen is het meest gebruikt, though andere sites zijn ook getest 13,31.

Ongeacht het inzetstuk, het klonen in NDV-cDNA moet een aantal regels om een ​​rescuable construct gegenereerd: (i) nieuwe gen worden opgenomen in de NDV-genoom onder controle van de geschikte signalen voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase. Deze sequenties moeten stroomopwaarts van de nieuwe open leesraam (ORF) worden toegevoegd zodat de polymerase kan het einde van de vorige gen (GE) en het begin van de nieuwe transgen (GS) herkent, gescheiden door een nucleotide sequentie intergene (IG) . Toevoeging van een geldige Kozak (K) sequentie eukaryotische ribosomale translatie verbeteren wordt ook aanbevolen voor een betere vreemde eiwit expressie 32, (ii) de efficiënte replicatie van NDV, zoals voor de meeste leden van de familie Paramyxoviridae, is afhankelijk van de lengte genoom wordt veelvoud zes 33, daarom elke inbrengen in de NDV heeft deze "regel van zes" te volgen. Eventueel required extra nucleotiden kunnen stroomafwaarts worden toegevoegd de nieuwe ORF, en (iii) de volgorde van de transgen moet worden gecontroleerd om te vinden mogelijke GE en GS achtige sequenties die redding efficiëntie, transgene expressie en / of levensvatbaarheid virus zou kunnen schaden. Indien aanwezig moet deze sequenties worden verwijderd door stille mutagenese. Het genereren van recombinant volledige lengte cDNA volgende genoemde regels is de eerste stap om efficiënt produceren genetisch gemodificeerde NDV zoals hier beschreven.

In het systeem alle DNA constructen onder controle van de T7 RNA polymerase promoter (Figuur 3). Deze cytoplasmatische polymerase in trans door co-infectie met een recombinant gemodificeerd Vaccinia Ankara virus (MVA-T7) 34. Figuur 3A tonen de pNDV-B1 plasmide, dat de volledige lengte antigenome cDNA 5 codeert. Figuur 3B toont pTM1 plasmiden die NP, P en L ORF. Plasmiden pCITE-GFP, dat codeert, under de T7-promoter, het Green Fluorescent Protein (GFP) en pCAGGS GFP 18, die dezelfde ORF codeert onder de kippen beta-actine promotor 35, worden gebruikt als controles. In dit protocol tonen we de procedure te redden recombinant NDV uit het cDNA van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 5 (figuur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bereiding van zoogdiercellen (Figuur 4A, dag 1)

Split HEp-2-cellen of A549 de dag voor transfectie in platen met 6 putjes. Dichtheid van de cellen moet 80-90% confluentie bereikt de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm schaal worden verdeeld in 8 putjes (ongeveer 1 x 10 6 cellen per well). Voor elk virus worden gered, moet 2-4 verschillende bronnen zijn mogelijk en 2 extra bronnen voor de besturing pCAGGS-GFP en pCITE-GFP 18, gericht op transfectie en MVA-T7 infectie-efficiënties bewaken, respectievelijk.

2. Infectie van zoogdiercellen met de recombinante Modified Vaccinia Ankara virus dat het bacteriofaag T7 RNA polymerase (MVA-T7) (Figuur 4A, Dag 2)

  1. Warmen PBS 1x/BA/PS en media bij 37 ° C.
  2. Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Infect gekweekte zoogdiercellen met het MVA-T7 virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) Van 1 pfu / cel in een eindvolume van 200 ul in PBS / BA / HS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  4. Tijdens virale infectie incubatie bereiden de transfectie mix zoals beschreven in 3.

3. Transfectie van zoogdiercellen (Figuur 4A, Dag 2)

  1. Bereiding van Lipofectamine: Meng 1-2 ug LPF2000 met 250 ul per OptiMEM reddingspoging en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  2. Voorbereiding van DNA: Maak een plasmide cocktail voor elke redding in 50 ul van OptiMEM. Voeg 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P en 0,2 ug pTM1-L per buis. Voeg 1 pg van de volledige lengte cDNA kloon van NDV worden gered aan elke buis. Bereiden ook twee controle transfecties, een met 2 ug pCAGGS-GFP (tot transfectie-efficiëntie te controleren) en de andere met 2 ug pCITE-GFP (om te controleren T7 polymerase gedreven expressie door de MVA-T7).
  3. Na de LPF2000-OptiMEM oplossing werd 5 min voorgeïncubeerd (stap 3.1), voeg 250pl van de oplossing van het DNA buizen (stap 3.2) en incubeer gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Na incubatie met MVA-T7, verwijder de virusinoculum door aspiratie en te vervangen door de DNA-LPF2000 transfectiemengsel (stap 3.3).
  5. Voeg 1 ml DMEM 10% FBS / PS elk gerecht.
  6. Incubeer de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen gedurende 6-8 uur (of overnacht) bij 37 ° C, 5% CO2 en vervang de transfectie media met 1,5 ml vers DMEM 10% FBS / PS.
  7. Op 24 uur na transfectie, kan controleputjes onder een fluorescentie microscoop worden waargenomen transfectie efficiëntie (pCAGGS-GFP) en T7 polymerase activiteit (pCITE-GFP) (figuur 5A) beoordelen. Ga verder met de co-cultuur van de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen met aviaire fibroblasten zoals hieronder beschreven.

4. Co-cultuur van zoogdiercellen met vogelcellen (Figuur 4A, Dag 3)

Meestal een confluente 100 mm weefselkweek schotel van kip (CEF) or eend (DEFS) fibroblasten wordt gebruikt per twee getransfecteerd putten. Zorg ervoor dat u voor te bereiden, op voorhand, genoeg 100 mm weefselkweek gerechten van vogelcellen per alle reddingspogingen. Voor doeltreffende redding van het virus wordt DMEM 10% FBS / HS medium aangevuld met 5% van allantoïsvloeistof en 30 mM MgCl2. Op dit moment, 24 uur pi, zoogdiercellen kan beginnen met cytopathisch effect (CPE) door MVA-T7 infectie asevident in figuur 5A.

  1. Warmen PBS 1x en media tot 37 ° C.
  2. Was zoogdiercellen, 2x met 1 ml PBS 1x.
  3. Trypsinize zoogdiercellen met 0,2 ml EDTA-trypsine tot ze losgemaakt. Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en overbrengen in een 100 mm weefselkweekplaat. Voeg 3 ml van dezelfde media.
  4. Was vogelcellen, tweemaal met 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinize aviaire cellen met 1 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C tot cellen los. Hersuspenderen the cellen toevoegen van 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en 4 ml van de cellen getrypsiniseerd de zoogdiercellen in de co-gekweekt 100 mm weefselkweekplaat een totaal volume van 8 ml (4 ml zoogdieren, 4 ml vogelcellen).
  6. Schud de hand van de co-gekweekte cellen in de 100 mm schaal teneinde een gelijkmatige en dan weer in de incubator bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen. De criteria voor het infecteren eieren 3 of 4 dagen na co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen afhankelijk van hoeveel cytopathisch effect (celronding, dood, loslating van het oppervlak, enz..) Waargenomen in het MVA-T7 virale infectie.

5. Infectie van de kip met embryo's Eieren (Figuur 4A, Dagen 6-7)

  1. Na 3-4 dagen co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen, verwijdert 1 ml van de weefselkweek supernatant en toevoegen aan een Eppendorf buis.
  2. Centrifugeer de weefselkweek supernatant gedurende 1 min bij 12.000 rpm in een benchtop centrifuge om cellulair afval te verwijderen.
  3. Kaars de eieren met behulp van een lichte candling box om de interface tussen de luchtzak en de allantoïsholte zien. Maak een merkteken op het raakvlak grens vermijden bloedvat lokalisatie. Spray 70% ethanol over de eieren om steriele omstandigheden vast te stellen. Maak voorzichtig een gat in de eierschaal op de gemarkeerde plaats en beënt 500 pl van de supernatant met een insuline (1 ml) spuit, richten de naald verticaal en direct in de allantoïsholte. (Figuur 4B).
  4. Dicht de nick in de eischaal met gesmolten was of paraffine.
  5. Incubeer de eieren gedurende 2-3 dagen bij 37 ° C.

6. Oogst van allantoïsvocht van besmette kip met embryo's Eieren (Figuur 4A, Dagen 8-10)

  1. Incubeer de besmette eieren 2-4 uur of overnacht bij 4 ° C om kippenembryo's te doden en stollen van het bloed.
  2. Spuit de eieren met 70% ethanol (tot steriele omstandigheden te handhaven).
  3. Tik op de apicale gedeelte van het ei, over de luchtspouw, met een lepel zorgvuldig. Zodra de eierschaal wordt gekraakt, verwijdert u de fragmenten met een tang en volledig het allantoïs membraan bloot.
  4. Expose de allantoïsholte door het uitsnijden van het allantoïs membraan met een tang en schaar, schade aan de bloedvaten en de dooier vermijden.
  5. Duw onderaan de embryo met een spatel en het verzamelen van de omhoog stromende allantoïsvloeistof (8-12 ml per ei) met een pipet 10 ml. Voorkom beschadiging van de dooier membraan. Breng de allantoïsvocht om een ​​15 ml centrifugebuis op ijs (gebruik een tube per ei).
  6. Verduidelijken allantoïsvloeistof door centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 rpm. Breng het supernatant naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren.
  7. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende 1 week, tot controle ervan aanwezigheid van NDV bij hemagglutinatie assay.

7. Hemagglutinatie (HA) Assay

De aanwezigheid van virus in de Allantoic vloeistof uit besmette eieren kunnen macroscopisch worden bepaald door hun vermogen om kalkoen rode bloedcellen (RBC) hemagglutinate. Bij NDV ongeveer 10 6 plaque vormende eenheden (pfu) per ml nodig zijn om een positief signaal in de HA test geven. HA assays zijn in V-bodem 96-putjes uitgevoerd. Negatieve (PBS 1x, niet-geïnfecteerde allantoïsvloeistof) als positief (allantoïsvocht van elke NDV virus) controlemonsters moet altijd worden opgenomen in een HA-test te valideren. Om een ​​HA-test uit te voeren:

  1. Pipetteer 50 ul PBS 1x per putje in een V-bodem 96-well plaat.
  2. Pipetteer 50 ul van de allantoïsvloeistof monsters in de putjes van de eerste kolom van de plaat. Voer 2-voudige seriële verdunningen door de rest van de plaat en de laatste extra 50 ul van putten in de laatste kolom verwijderen.
  3. Doseer 50 ul van 0,5% kalkoen RBC in PBS 1x per well. Schud de plaat door te tikken.
  4. Incubeer de plaat staan ​​bij 4 ° C (of ijs) fof 30-45 minuten of totdat een heldere pellet wordt gevormd in de negatieve controle wells.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Redding van NDV is een gevestigde procedure routinematig uitgevoerd in laboratoria die toegang tot de volledige cDNA van het virus. De intrinsieke stochastische aard van de methode maakt het moeilijk om 100% rescue efficiëntie. Controle op de eerste stappen van de werkwijze, speciaal de transfectie-efficiëntie en infectie met MVA-T7, helpt mogelijke problemen. Figuur 5A toont standaard transfectie en transfectie / infectie-efficiënties die genoeg om succesvol NDV redding zijn identificeren. Na het ronden van versterking in aviaire-zoogdieren co-culturen en bevruchte eieren, is de aanwezigheid van geredde virus gedetecteerd door positieve putten in de HA-test. NDV induceert haemagglutinatie door het koppelen van erytrocyten en voorkomt hun sedimentatie op de bodem van de put V-vormig. Daarom kan gebrek aan HA activiteit gemakkelijk worden onderscheiden door de vorming van een rode, ronde pellets van RBC (figuur 5B). Negatieve resultatenin de HA test kan te wijten zijn aan onvoldoende titer van virus in de allantoïs vloeistof: een minimum titer van ongeveer 10 6 pfu / ml is nodig om een positief HA resultaat. Lagere virale titers nog worden gedetecteerd door immunofluorescentie assay (IFA) met behulp van specifieke antilichamen tegen NDV. Een nieuwe passage op eieren voor verdere amplificatie van het virus in de eerste geënte eieren wordt aanbevolen in deze gevallen.

Figuur 1
Figuur 1. Organisatie van het genoom van de NCD-virus (NDV) De niet-gesegmenteerde, enkelstrengs negatieve RNA genoom van NDV is 15.186 nucleotiden (nt) lang en codeert acht verschillende polypeptiden in zes transcriptie eenheden:. NP, P, M, F, HN-en L plus V en W eiwitten ontstaan ​​na verschuivingen in het leesraam van de P ORF tijdens de transcriptie. Niet-coderende, regulerende sequenties flankerenhet genoom in zijn 3 '(leider) en 5' (trailer) eindigt. Verdere niet-coderende gen einde (GE), intergenische (IG) en gen start (GS) sequenties regelen de virale polymerase-activiteit tussen de verschillende ORF. Expressie niveaus van de verschillende genen op het virale genoom afhankelijk van hun relatieve locatie ten opzichte van het 3'-uiteinde (dwz NP transcripten zijn de meest voorkomende, L transcripties minst), waardoor effectief een gradiënt kritisch voor het virus levenscyclus 1.

Figuur 2
Figuur 2. Basis van NDV redding van gekloonde DNA. Schematische vergelijking tussen een natuurlijk (A) en de kunstmatig geïnduceerde (B) cyclus tijdens het back-upproces. (A) Na het bevestigen van de doelcel, het virus geeft zijn genomische inhoud in het cytoplasma encapsideerd in RNPs. Het RNA-polymerase transcribeert het RNA-genoom in de verschillende mRNAs van de virale eiwitten en in een complementaire, volledige antigenome RNA + blad, dat sjabloon voor de productie van meerdere kopieën van het originele genoom die in ontluikende virionen worden opgenomen. (B ) Tijdens de redding proces, de componenten van de RNP's (NP, P en L eiwitten, en een lengte, meestal aangepast antigenome RNA) worden door cDNA transfectie. Na reconstitutie van het antigenome RNP in het cytoplasma van de getransfecteerde cel, kunnen ze de complementaire recombinante genomische RNP's produceren en een hele cyclus kan dan opnieuw beginnen, eindigend met de afgifte van recombinante virussen.

Figuur 3
Figuur 3. T7-driven expressieplasmiden voor de productie van recombinant NDV. (A) Volledige lengte virale cDNA: The volledige lengte pNDV-B1 ampicilline resistentie plasmide de expressie van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 antigenoom onder de T7 promoter (P-T7) en de T7 terminator sequentie (T T7) met het hepatitis delta ribozym (HDR) splitsing. De pNDV-B1 werd oorspronkelijk ontworpen om buitenlandse inserts vervoeren tussen P en M-genen 5. Invoeging van een nieuw gen (XbaI-plaats) vereist de toevoeging van het regulerende gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen-start (GS) sequenties zijn functioneel herkenning mogelijk te maken door het virale polymerase. Expressie efficiëntie van het transgen kan worden verbeterd met de toevoeging van een Kozak (K) sequentie stroomopwaarts van de startcodon 32. De gehele cassette ingebracht in de NDV-cDNA heeft een totaal aantal nucleotiden deelbaar zijn door zes tot de "regel van zes" 33 die een efficiënte replicatie meeste paramyxovius genomen drives volgen (B) Eiwitten expressieplasmiden. Virale NP, P, en L ORF geflankeerdde T7 promoter (P T7), de UTR van het encephalomyocarditis virus (EMC) en de T7 terminator (T T7) sequenties werden gekloneerd in de pTM1 hoofdketen ampicilline resistentie vector 5,36.

Figuur 4
Figuur 4. Plasmide-gebaseerde reverse genetics technieken voor het genereren van recombinant Newcastle Disease Virus. (A) Viral rescue: A549 of HEp-2 cellen worden geïnfecteerd met de gemodificeerde vacciniavirus Ankara uiting van de bacteriofaag T7 polymerase (MVA-T7). Na virale infectie, cellen co-getransfecteerd met het expressieplasmide vereist voor replicatie en transcriptie van NDV virale genoom (NP, P en L), tezamen met de volledige lengte NDV-cDNA onder de T7 promoter. Vierentwintig uur post-infection/transfection, zoogdiercellen zijn samen gekweekt met kip of eend (CEF enDEF, respectievelijk). Drie tot vier dagen na co-cultuur, 8-10 dagen oude bevruchte kippen eieren geïnoculeerd met het weefsel kweeksupernatanten van de co-kweek cellen voor verdere amplificatie. Twee tot drie dagen na incubatie van 8-10 dagen oude eieren bij 37 ° C, wordt allantoïsvocht van de eieren geoogst en geanalyseerd op succesvolle redding van het recombinant virus door HA assay. Positieve (+) rescue virussen worden verder gekarakteriseerd op genomisch (RT-PCR) en eiwitten (bijv. immunofluorescentie assay (IFA) en Western blot (WB) niveaus Negatief (-.) HA resultaten kunnen te wijten zijn aan het ontbreken van voldoende virussen te . gedetecteerd door HA Reinfectie vers bevruchte kippen eieren aan het virus amplificeren aangegeven (B) Infectie van bevruchte kippen eieren. 8-10 bevruchte kippen eieren geschouwd aan het grensvlak tussen de luchtzak en allantoïsholte markeren met een insuline. (1 ml) spuit, eieren geïnfecteerd met de weefselkweek supernatant in de allantoïs spouwty, zoals aangegeven.

Figuur 5
Figuur 5. Representatieve resultaten. (A) Transfectie en MVA-T7 infectie-efficiënties: representatieve fluorescente (links) en lichte (rechter) gebied van A549 cellen die met pCAGGS-GFP (boven) of geïnfecteerd met MVA-T7 en getransfecteerd met pCITE-GFP (onder) zijn weergegeven . Constitutieve GFP-expressie aangedreven door pCAGGS is een indicator van transfectie-efficiëntie, dat T7-promoter gedreven GFP expressie door pCITE is controle voor MVA-T7 infectie en T7 polymerase activiteit. Cellen werden afgebeeld op 24 uur post-transfection/post-infection (B) hemagglutinatietest (HA): Aanwezigheid van virale deeltjes in allantoïsvloeistof induceert hemagglutinatie, waarin bij het ​​ontbreken van pellet op de bodem van een V goed gevormd. Afwezigheid virus maakt de vorming van een rode pellet op de bodem van ee ook. Figuur toont zowel de controles die nodig zijn voor een HA-test (negatief, schoon allantoïsvloeistof, positief, een reeds gekenmerkt NDV monster), en de resultaten van drie onbekende monsters verkregen na een redding, met twee positieve (+) en een negatieve (-) resultaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Verschillende factoren moeten worden beschouwd om goede resultaten te bereiken, terwijl het redden van NDV. Ten eerste, de volledige lengte cDNA construct voor gebruik moet worden ontworpen om de functionele integratie van de nieuwe transgenen / wijzigingen in het NDV genoom toestaan. Dat betekent, zoals hierboven vermeld, dat (i) geschikte gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen start (GS) sequentie worden toegevoegd indien nodig, (ii) er zijn geen vermeende GE of GS sequenties in de vreemde gen, en (iii) de volledige recombinante genoom volgt de "regel van zes".

Zoals voor de redding proces, kwaliteit van plasmide voorbereidingen, de MVA-T7 voorraden evenals een goed onderhoud van de cellen zijn kritisch. Voor de meeste gevallen standaard maxiprep zuivering van het plasmide-DNA is genoeg, maar moeilijk klonen en redden processen, door de omvang of aard van de transgenen kunnen worden verbeterd door het zuiveren van DNA door CsCl dichtheidsgradiënt centrifugatie. De transfectie efficiëntie met Lipofectamine is meestal voldoende voor een succesvolle rescue, hoewel andere transfectiewerkwijzen zoals nucleofection kunnen ook worden gebruikt. In elk geval is de verhouding van de verschillende plasmiden moet strikt worden gehandhaafd (0.4:0.2:0.2:1 voor NP-PL-pNDV respectievelijk). Als gevolg van de moeizame en een of andere manier stochastische karakter van de redding proces, moet minstens 2-4 verschillende putten worden getransfecteerd per construct worden gered, en verschillende klonen van hetzelfde construct moet worden getest.

In het protocol dat we hier beschreven, gebruiken we MVA-T7 om in trans de T7 polymerase vereist voor de expressie van de virale cDNA-constructen. Hoewel dit de standaardprocedure in ons laboratorium, is niet de enige mogelijke aanpak. Zo zijn andere groepen succes gered NDV en andere niet-gesegmenteerd negatieve streng RNA-virussen met behulp van cellijnen constitutief hoge T7 polymerase 4,37. De beschikbaarheid van een recombinante vectorof cellijn codering T7 polymerase, evenals de specifieke prestatie van beide benaderingen in een bepaald laboratorium, dient overwogen te worden bij de vaststelling opnieuw de redding voor NDV.

Na de bepaling van NDV aanwezigheid in de allantoïsvloeistof door HA verdere studies worden uitgevoerd om volledig karakteriseren van de nieuwe geredde virus, zoals RT-PCR, gevolgd door sequentiebepaling van het virale genoom, IFA en Western-blotting (WB) om expressie te bepalen van het vreemde gen (indien van toepassing). Afhankelijk van de aard van de wijzigingen die de recombinante virussen dragen, zouden andere soorten biochemische en functionele assays ook nodig zijn.

De redding van recombinant NDV uit cDNA is een nuttige techniek om verschillende redenen. Eerste en meest duidelijke, deze techniek de mogelijkheid om de biologie van NDV, een economisch relevante virus aviaire industrie analyseren experimenteel behoud van de genen en regulerende sequenties. NDV is een paramyxovirus nauw verwant aan humane pathogenen zoals mazelen, bof of respiratoir syncytieel virussen, alsmede de optredende, zeer pathogene Hendra en Nipah virussen, onderzoek op basis levenscyclus van deze familie van virussen is belangrijk om hun biologie begrijpen. Beyond fundamenteel onderzoek, recombinant NDVs hebben een groot potentieel als vaccin en oncolytic vectos die zowel de mogelijkheid van de uitvoering foreing genen in hun genoom met een goed beoordeelde bioveiligheid profiel. Om al deze redenen kan de NDV redding protocol een waardevolle aanwinst zijn voor vele laboratoria over de hele wereld die geïnteresseerd zijn in virus onderzoek, de ontwikkeling van vaccins en de behandeling van kanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Adolfo García-Sastre is een uitvinder van octrooien op recombinante NCD-virussen die eigendom zijn van de Icahn School van Geneeskunde bij de berg Sinaï.

Acknowledgments

Auteurs willen graag naar het verleden en de huidige leden te bedanken in de laboratoria van Drs. Peter Palese en Adolfo García-Sastre voor de ontwikkeling van NDV reverse genetics technieken en voor technische ondersteuning. Onderzoek in Newcastle disease-virus in AG-S laboratorium wordt gedeeltelijk gefinancierd door NIAD verlenen R01AI088770 en door het Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence voor opkomende en Zoonotic dierziekten (CEEZAD, award nummer 2010-ST-061-AG001). Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidies RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), en de Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).
Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter