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Immunology and Infection

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

Abstract

Virus della malattia di Newcastle (NDV), il membro prototipo del genere Avulavirus della famiglia Paramyxoviridae 1, è un non-segmentato, negativo-senso, a singolo filamento, avvolta virus RNA (Figura 1), con potenziali applicazioni come vettore per la vaccinazione e trattamento di malattie umane. L'esplorazione in profondità di queste applicazioni è diventato possibile solo dopo l'istituzione della genetica inversa tecniche per salvare i virus ricombinanti da plasmidi che codificano i loro genomi completi come cDNA 2-5. CDNA virale può essere convenientemente modificati in vitro utilizzando procedure di clonazione standard per alterare il genotipo del virus e / o di inserire nuove unità trascrizionali. Salvataggio di tali virus geneticamente modificati, fornisce un prezioso strumento per comprendere i fattori che incidono più fasi dell'infezione, così come consente lo sviluppo e il miglioramento di vettori per l'espressione e la consegna degli antigeniper la vaccinazione e la terapia. Qui si descrive un protocollo per il salvataggio di NDVs ricombinanti.

Introduction

Virus della malattia di Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviario appartenente al genere Avulavirus 1, è un agente di zoonosi economicamente rilevante e quindi ampiamente studiato e sorvegliato, che può influenzare fortemente l'allevamento di pollame in tutto il mondo. Pur non essendo un agente patogeno umano, NDV è stato anche studiato a fondo al di là del campo veterinario sia come modello paramyxovirus e grazie alle sue molto interessanti, proprietà naturali oncolitici 6. Ricerca su NDV notevolmente beneficiato lo sviluppo di tecniche di genetica inversa per, non segmentati virus a singolo filamento di RNA negativo-senso, in primo luogo descritti per virus della rabbia da Conzelmann e coleagues 2. Una varietà di NDVs geneticamente modificati, portatori di geni estranei o modifiche del loro tipo selvatico genoma sono stati ampiamente studiati da allora. Lavorare con questi virus ricombinanti è stato fondamentale per individuare i diversi fattori di virulenza non solo di NDV, ma anche di altri huma pertinenten agenti patogeni come virus dell'influenza A 7 - o l'emergente Nipah virus 8. Inoltre, diversi studi hanno esplorato l'uso di queste tecniche per migliorare l'attività antitumorale innata NDV 6,9,10, soprattutto migliorando le proprietà immunostimolanti del virus. Altro settore di ricerca sulla NDVs ricombinanti è stata la generazione di candidati vaccini contro altre malattie virali come l'influenza 5,11,12, 13 HIV, morbillo 14, SARS 15, o che ha causato dal virus sincytial respiratorio (RSV) 16. Tra i vari notevoli vantaggi forniti dal NDV sono la mancanza di immunità preesistente nella popolazione umana, la stabilità degli inserti estere genetiche, una mancanza di attività recombinatory e nel complesso un elevato profilo di sicurezza combinato con le suddette proprietà immunostimolanti naturali 17. E 'inoltre degno di nota il potenziale uso di vaccini bivalenti ricombinanti in poultry, l'influenza aviaria di protezione contro sia NDV e altamente patogeno virus 11,12. Questo può essere un ottimo modo per diminuire le probabilità di quest'ultimo diffusione da selvatici animali domestici, quindi anche aiutando a prevenire un eventuale salto inter-specifica della temuta influenza aviaria agli esseri umani. Infine, sono stati utilizzati reporter esprimere NDV per la valutazione della risposta immunitaria innata come pure l'identificazione di interferone antagonista codificata dal virus multipli 18-27.

Il processo di salvataggio di un ricombinante, non segmentato, virus RNA negativo filamento costituito essenzialmente da forzare artificialmente un ciclo di replicazione virale in una cellula che produce trasfettando cDNA codificanti il macchinario molecolare minimo infettiva, noto come ribonucleoproteina o RNP (Figura 2). Le RNP consistono polimerasi virale (P e proteine ​​L), la nucleoproteina (NP) e l'intera lunghezza antigenomic RNA del virus. Questo RNA + antigenome è ªe modello richiesto per la generazione dei genomi RNA complementari, che, associati anche con il resto delle proteine ​​della RNP virale, ricapitola stesso complesso infettiva che un virus naturale libererebbe il citoplasma della cellula dopo l'infezione (Figura 2A ). Da questo punto in poi, il ciclo virale può procedere in modo naturale e virioni ricombinanti, encapsidating i genomi modificati, verrà generato (Figura 2B). Sorprendentemente, trasfezione del cDNA genomico invece del cDNA antigenomic compromette notevolmente o abolisce efficienza salvataggio 2,28-30 completamente. Anche quando cDNA antigenomic viene trasfettato, l'efficienza del incapsidamento del RNA ricombinante in RNPs in cellule trasfettate è probabilmente molto bassa. A causa di questo, protocolli di salvataggio per NDV spesso includono diversi passaggi per l'amplificazione delle particelle virali pochi rilasciate dalle cellule trasfettate originariamente da essi coculturing con cellule permissive e / o dalinfezione di uova embrionate.

Prima del salvataggio, il cDNA può essere manipolato da procedure di clonazione standard per generare le modifiche desiderate. Mentre mutazioni specifiche dei diversi prodotti genici e sequenze regolatrici del virus possono essere direttamente raggiunti in questo modo, molti dei lavori pubblicati coinvolge ricombinante NDV ha richiesto l'aggiunta di una nuova unità trascrizionale nel genoma NDV. Come altri membri della famiglia paramyxovirus, il genoma NDV codifica otto proteine ​​differenti in sei unità trascrizionali, che sono differenzialmente espressi in funzione della loro posizione rispetto alla estremità 3 'in un gradiente critico per il ciclo di vita virale 1 discendente. A causa di questo, la posizione della nuova unità trascrizionale all'interno del genoma va scelto opportunamente per raggiungere un equilibrio tra l'espressione del transgene e compromissione della replicazione virale. Inserimento tra P e M geni è stato usato più, tHough altri siti sono stati anche testati 13,31.

Qualunque sia l'inserto, la clonazione in NDV cDNA deve seguire alcune regole per generare un costrutto salvabile: (i) qualsiasi nuovo gene da inserire nel genoma NDV deve essere sotto il controllo dei segnali appropriati per il virale RNA-dipendente-RNA polimerasi. Queste sequenze devono essere aggiunti a monte della nuova fase di lettura aperta (ORF) per la polimerasi possono riconoscere la fine del gene precedente (GE) e l'inizio del nuovo transgene (GS), distanziati di un singolo nucleotide sequenza intergenica (IG) . Aggiunta di un valido Kozak (K) sequenza di migliorare traduzione eucariotico ribosomiale è consigliato anche per una migliore espressione proteina estranea 32; (ii) replica efficiente di NDV, come per la maggior parte dei membri della famiglia Paramyxoviridae, dipende dalla lunghezza del genoma essere multiplo di sei 33, pertanto, qualsiasi inserimento nella NDV deve seguire questa "regola del sei". Se necessario, required nucleotidi possono essere aggiunti a valle della nuova ORF, e (iii) la sequenza del transgene dovrebbe essere controllata per trovare possibili GE e GS come sequenze che potrebbero compromettere l'efficienza di salvataggio, l'espressione del transgene e / o vitalità del virus. Se presente, queste sequenze devono essere rimossi mediante mutagenesi silenzioso. La generazione di cDNA ricombinante piena lunghezza seguenti norme suddette è il primo passo per produrre efficientemente un NDV geneticamente modificato come qui descritto.

Nel sistema tutti i costrutti di DNA sono sotto il controllo del promotore T7 RNA polimerasi (Figura 3). Questa polimerasi citoplasmatica è fornito in trans da coinfezione con un modificato vaccinia virus ricombinante Ankara (MVA-T7) 34. Figura 3A mostra il plasmide pNDV-B1, che codifica l'intera lunghezza cDNA antigenomic 5. Figura 3B mostra plasmidi codificanti pTM1 NP, P e L ORF. Plasmidi pCITE-GFP, che codifica, under il promotore T7, la proteina fluorescente verde (GFP), e pCAGGS GFP 18, che codifica lo stesso ORF sotto il promotore actina di pollo beta 35, sono usati come controlli. In questo protocollo mostriamo la procedura per salvare ricombinante NDV dal cDNA del lentogeno NDV ceppo Hitchner B1 5 (Figura 4).

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Protocol

1. Preparazione di cellule di mammifero (Figura 4A, 1 ª giornata)

Split HEp-2 o cellule A549 il giorno prima della trasfezione in piastre da 6 pozzetti. Densità delle cellule dovrebbe raggiungere il 80-90% di confluenza il giorno seguente. Di solito, un confluente 100 millimetri piatto può essere suddiviso in 8 pozzetti (circa 1 x 10 6 cellule per pozzetto). Per ogni virus di essere recuperata, 2-4 diversi pozzetti devono essere incluse, nonché 2 pozzetti supplementari per i controlli pCAGGS-GFP e pCITE-GFP 18, volti a monitorare trasfezione e MVA-T7 efficienza di infezione, rispettivamente.

2. L'infezione di cellule di mammifero con il virus del vaiolo vaccino ricombinante Modified Ankara Esprimendo il batteriofago T7 RNA polimerasi (MVA-T7) (Figura 4A, 2 ª giornata)

  1. Warm up PBS 1x/BA/PS e dei media a 37 ° C.
  2. Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS 1x/BA/PS.
  3. Infettare le cellule di mammifero coltivate con il virus MVA-T7 ad una molteplicità di infezione (moi) Di 1 pfu / cellule in un volume finale di 200 microlitri di PBS / BA / PS per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Durante l'infezione virale incubazione, preparare la miscela di trasfezione come descritto in 3.

3. Trasfezione di cellule di mammifero (Figura 4A, 2 ª giornata)

  1. Preparazione del Lipofectamine: Mescolare 1-2 mg di LPF2000 con 250 ml di OptiMEM per tentativo di salvataggio e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Preparazione del DNA: Fare un cocktail plasmide per ogni salvataggio in 50 ml di OptiMEM. Aggiungere 0,4 pg di pTM1-NP, 0,2 mg di pTM1-P, e 0,2 mg di pTM1-L per provetta. Aggiungere 1 mg del full-length cDNA clone di NDV essere salvato ad ogni provetta. Anche preparare due transfezioni di controllo, una con 2 mg di pCAGGS-GFP (per verificare l'efficienza di trasfezione) e l'altra con 2 mg di pCITE-GFP (per controllare T7 polimerasi guidato espressione del MVA-T7).
  3. Dopo che la soluzione LPF2000-OptiMEM è stato preincubato per 5 min (passo 3.1), aggiungere 250microlitri della soluzione ai tubi DNA (passo 3.2) e incubare per 20-30 min a temperatura ambiente.
  4. Dopo l'incubazione con MVA-T7, rimuovere l'inoculo del virus mediante aspirazione e sostituire con la miscela di trasfezione di DNA-LPF2000 (passo 3.3).
  5. Aggiungere 1 ml di DMEM 10% FBS / PS per ogni piatto.
  6. Incubare le cellule infette / transfettate per 6-8 ore (o tutta la notte) a 37 ° C, 5% CO 2 e quindi sostituire il supporto trasfezione con 1,5 ml di DMEM fresco 10% FBS / PS.
  7. A 24 ore dopo la trasfezione, pozzetti di controllo possono essere osservati sotto un microscopio a fluorescenza per valutare l'efficienza di trasfezione (pCAGGS-GFP) e l'attività della polimerasi T7 (pCITE-GFP) (Figura 5A). Procedere con la co-coltura delle cellule infette / trasfettate con fibroblasti aviaria come descritto di seguito.

4. Co-coltura di cellule di mammifero con le cellule aviaria (Figura 4A, 3 ª giornata)

Di solito, un confluente 100 millimetri di tessuto cultura piatto di pollo (CEFS) or duck (defs) fibroblasti di embrione viene utilizzato per due pozzi transfettate. Assicurati di preparare, in anticipo, abbastanza 100 millimetri di coltura tissutale piatti a base di cellule aviarie per tutti i tentativi di salvataggio. Per salvataggio efficiente del virus, DMEM 10% FBS / PS supporto è completato con 5% di liquido allantoidea 30 mM MgCl 2. A questo punto, 24 hr pi, cellule di mammifero possono iniziare a mostrare effetto citopatico (CPE) a causa di infezione MVA-T7, asevident in figura 5A.

  1. Warm up 1x PBS e media a 37 ° C.
  2. Lavare le cellule di mammifero, 2x, con 1 ml di PBS 1x.
  3. Trypsinize cellule di mammifero con 0,2 ml di EDTA-tripsina fino a quando non indipendente. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM 10% FBS / PS, 5% fluido allantoideo, 30 mM MgCl 2 e trasferimento in un piatto di coltura tissutale a 100 mm. Aggiungere 3 ml dello stesso supporto.
  4. Lavare le cellule aviaria, due volte, con 4 ml di PBS 1x.
  5. Trypsinize cellule aviarie con 1 ml di EDTA-tripsina e incubare per 1-2 minuti a 37 ° C finché le cellule si staccano. Risospendere thcelle e aggiungendo 8 ml di DMEM 10% FBS / PS, 5% fluido allantoideo, 30 mM MgCl 2 e aggiungere 4 ml delle cellule trypsinized alle cellule di mammifero in 100 mm al piatto di coltura tissutale co-coltura per un volume totale di 8 ml (4 ml di mammifero, 4 ml cellule aviarie).
  6. Agitare delicatamente a mano le cellule co-coltivate nel piatto a 100 mm in modo da avere una distribuzione uniforme e poi metterli in incubatore a 37 ° C per 3-4 giorni. I criteri per infettare uova 3 o 4 giorni dopo co-coltura di cellule di mammifero e aviarie dipende dalla quantità di effetto citopatico (arrotondamento cella, morte, distacco dalla superficie, ecc.) Si osserva nella infezione virale MVA-T7.

5. L'infezione di uova embrionate di pollo (4A, Giorni 6-7)

  1. Dopo 3-4 giorni di co-coltura di cellule di mammifero e aviaria, rimuovere 1 ml del supernatante di coltura tissutale e aggiungere in una provetta Eppendorf.
  2. Centrifugare il surnatante di coltura tissutale per 1 min a 12.000 rpm in un bancocentrifuga per rimuovere i detriti cellulari.
  3. Candela le uova utilizzando una scatola speratura luce per vedere l'interfaccia tra la sacca d'aria e la cavità allantoidea. Fare un segno sul confine interfaccia evitando la localizzazione dei vasi sanguigni. Spray etanolo al 70% sopra le uova per stabilire condizioni sterili. Fare delicatamente un foro nel guscio sul punto marcato e inoculare 500 ml di supernatante utilizzando un insulina (1 ml) siringa, puntando l'ago verticalmente e direttamente nella cavità allantoica. (Figura 4B).
  4. Sigillare il nick in guscio d'uovo con cera fusa o paraffina.
  5. Incubare le uova per 2-3 giorni a 37 ° C.

6. Raccolta di liquido allantoico da Infected uova embrionate di pollo (4A, giorni 8-10)

  1. Incubare le uova infette per 2-4 ore o tutta la notte a 4 ° C, al fine di uccidere l'embrione di pollo e coagulare il sangue.
  2. Spruzzare le uova con il 70% di etanolo (per mantenere condizioni di sterilità).
  3. Toccare attentamente la sezione apicale dell'uovo, sopra la cavità d'aria, con un cucchiaio. Una volta che il guscio è incrinato, rimuovere i frammenti con una pinza e pienamente esporre la membrana allantoidea.
  4. Esporre la cavità allantoica da asportare la membrana allantoico con le pinze e forbici, evitando di danneggiare i vasi sanguigni e il tuorlo.
  5. Spingere delicatamente verso il basso l'embrione con una spatola e raccogliere il liquido allantoico upflowing (8-12 ml per uovo) con una pipetta 10 ml. Evitare di danneggiare la membrana tuorlo. Trasferire il liquido allantoico ad un tubo da centrifuga da 15 ml sul ghiaccio (utilizzare un tubo per uovo).
  6. Chiarire il liquido allantoico mediante centrifugazione per 5 min a 1.500 giri. Trasferire il surnatante in una nuova provetta senza disturbare il pellet.
  7. Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di 1 settimana, fino a quando non controllando la presenza di NDV mediante test di emoagglutinazione.

7. Emoagglutinazione (HA) Assay

La presenza del virus nel allantfluido OIC da uova infette può essere determinata macroscopicamente dalla loro capacità di hemagglutinate tacchino globuli rossi (RBC). Nel caso di NDV, circa 10 6 unità formanti placca (pfu) per ml è richiesto di dare un segnale positivo nel saggio HA. Saggi HA sono effettuate in piastre da 96 pozzetti V-bottom. Negativo (PBS 1x, liquido allantoico infetto), così come positivo (liquido allantoico da qualsiasi virus NDV) campioni di controllo devono essere sempre inclusi in qualsiasi dosaggio HA per convalidarlo. Per eseguire un saggio HA:

  1. Pipettare 50 ml di PBS 1x per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti V-bottom.
  2. Pipettare 50 ml di allantoici campioni di liquido nei pozzetti sulla prima colonna della piastra. Effettuare diluizioni seriali di 2 volte per il resto del piatto ed eliminare l'ultimo, extra 50 microlitri dai pozzi nell'ultima colonna.
  3. Dispensare 50 ml di 0,5% tacchino RBC in PBS 1x per bene. Agitare delicatamente la piastra toccando.
  4. Incubare la piastra a 4 ° C (o ghiaccio) fo 30-45 minuti o fino a quando un pellet chiaro si forma nei pozzetti di controllo negativi.

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Representative Results

Salvataggio di NDV è una procedura consolidata, eseguita di routine nei laboratori che hanno accesso al cDNA completa del virus. Tuttavia, la natura intrinseca stocastico del metodo rende difficile raggiungere il 100% di efficienza salvataggio. Monitoraggio prime fasi del processo, specialmente l'efficienza di trasfezione e l'infezione con MVA-T7, aiuta a individuare eventuali problemi. Figura 5a mostra trasfezione standard ed efficienze di trasfezione / infezione che sono abbastanza per un successo salvataggio NDV. Dopo il giro di amplificazione in co-colture avicole mammiferi e uova embrionate, la presenza di virus salvato viene rilevato da pozzetti positivi nel test HA. NDV induce emoagglutinazione collegando eritrociti e quindi impedisce la sedimentazione sul fondo della V-shaped bene. Pertanto, la mancanza di attività HA può essere facilmente distinto dalla formazione di un pellet rosso rotondo di RBC (Figura 5B). Risultati negativinel saggio HA può essere dovuto ad un titolo insufficiente di virus nel fluido allantoideo: un titolo minimo di circa 10 6 pfu / ml è richiesto di avere un risultato positivo HA. Titoli virali inferiori possono ancora essere rilevati dai test di immunofluorescenza (IFA) con anticorpi specifici anti-NDV. Un nuovo passaggio sulle uova per un'ulteriore amplificazione del virus presente nelle prime uova inoculate è raccomandato in questi casi.

Figura 1
Figura 1. Organizzazione del genoma del virus della malattia di Newcastle (NDV) La non segmentato, negativo-sense genoma RNA a singolo filamento di NDV è 15.186 nucleotidi (nt) di lunghezza e codifica otto polipeptidi diversi in sei unità trascrizionali:. NP, P, M, F, HN e L plus V e W proteine, originate successivamente spostamenti della cornice di lettura della P ORF durante la trascrizione. Non codificante, sequenze regolatrici fiancheggianoil genoma nel suo 3 '(leader) e 5' (trailer) termina. Ulteriore non codificanti fine gene (GE), intergenica (IG) e di inizio gene (GS) sequenze di regolare l'attività della polimerasi virale tra i diversi ORF. I livelli di espressione dei vari geni sul genoma virale dipendono dalla loro posizione relativa rispetto alla estremità 3 '(cioè trascrizioni NP sono i più abbondanti, L trascrizioni meno), creando di fatto un gradiente critico per il virus' ciclo di vita 1.

Figura 2
Figura 2. Base di NDV soccorso dal DNA clonato. Confronto schematico tra un naturale (A) e la (B) ciclo artificialmente indotto durante il processo di salvataggio. (A) Dopo aver fissato alla cellula bersaglio, il virus rilascia il suo contenuto genomico nel citoplasma incapsidati in RNP. La RNA polimerasi trascrive l'RNA-genoma nelle diverse mRNA delle proteine ​​virali e in un complementare, piena lunghezza RNA antigenomic + copia, che è modello per la produzione di più copie del genoma originale che verranno incorporati in virioni nascenti. (B ) Durante il processo di salvataggio, i componenti delle RNP (NP, P e L proteine, così come un full-length, RNA antigenomic solito modificata) sono ottenute mediante cDNA trasfezione. Dopo la ricostituzione delle RNPs antigenomic nel citoplasma della cellula trasfettate, possono produrre complementare, RNP genomiche ricombinanti e un intero ciclo può poi ricominciare, che termina con il rilascio di virus ricombinanti.

Figura 3
Figura 3. T7-driven plasmidi di espressione per la generazione di NDV ricombinante. (A) Integrale cDNA virale: The piena lunghezza pNDV-B1 resistenza all'ampicillina plasmide guida espressione del lentogeno NDV ceppo Hitchner B1 antigenome sotto il promotore T7 (P T7) e la sequenza terminatore T7 (T T7) contenente l'epatite Delta Ribozyme (HDR) scissione. Il pNDV-B1 è stato originariamente progettato per trasportare inserti stranieri tra P e M geni 5. Inserimento di un nuovo gene (sito XbaI) richiede l'aggiunta di fine gene regolatore (GE), intergenica (IG) e inizio gene (GS) sequenze di consentire il riconoscimento funzionale dalla polimerasi virale. Efficienza espressione del transgene può essere migliorata con l'aggiunta di una sequenza di Kozak (K) a monte del codone di inizio 32. L'intero cassetto introdotto nel NDV cDNA deve avere un numero totale di nucleotidi divisibile per sei a seguire la "regola del sei" 33 che guida la replicazione efficiente della maggior parte dei genomi paramyxovius (B) plasmidi di espressione delle proteine:. Virale NP, P, e L ORF, fiancheggiatidal promotore T7 (P T7), l'UTR del virus dell'encefalomiocardite (EMC) e il terminatore T7 (T T7) sequenze sono stati clonati nel pTM1 backbone resistenza all'ampicillina vettore 5,36.

Figura 4
Figura 4. Basati su plasmidi genetica inversa tecniche per la generazione di ricombinanti virus della malattia di Newcastle. (A) virale di salvataggio: A549 o cellule HEp-2 sono infettati con il virus vaccinico Ankara modificato esprimere la T7 polimerasi del batteriofago (MVA-T7). Dopo l'infezione virale, le cellule vengono co-trasfettate con il plasmide di espressione necessaria per la replicazione e la trascrizione del genoma virale NDV (NP, P e L), insieme con la lunghezza NDV cDNA, sotto il promotore T7. Ventiquattro ore post-infection/transfection, cellule di mammifero sono co-coltura con pollo o anatra embrione fibroblasti (CEF eDEF, rispettivamente). Da tre a quattro giorni dopo le uova di co-coltura, 8-10 giorni di età embrionate di pollo vengono inoculati con i surnatanti di coltura tissutale delle cellule co-coltura per ulteriore amplificazione. Due-tre giorni dopo incubazione dei 8-10 giorni di età uova a 37 ° C, liquido allantoico dalle uova viene raccolto ed analizzato per il successo salvataggio del virus ricombinante mediante saggio HA. Positivi (+) virus soccorso sono ulteriormente caratterizzate a genomico (RT-PCR) e proteina (es saggio di immunofluorescenza (IFA) e western blot WB) livelli (negativo (-). HA risultati possono essere dovuti alla mancanza di sufficiente virus per essere . rilevato da HA reinfezione di pollo embrionate uova fresche per amplificare il virus è indicato (B) Infezione delle uova di pollo embrionate:. 8-10 uova embrionate di pollo sono candled a segnare l'interfaccia tra la sacca d'aria e la cavità allantoidea Con una insulina. (1 ml) della siringa, le uova sono infettati con il di coltura all'interno Cavi allantoideaty, come indicato.

Figura 5
Figura 5. Risultati rappresentativi. (A) Transfezione e MVA-T7 efficienza di infezione: fluorescente rappresentante (a sinistra) e luminose (a destra) settori delle celle A549 trasfettate con pCAGGS-GFP (in alto) o infettate con MVA-T7 e trasfettate con pCITE-GFP (in basso) sono illustrate . GFP espressione costitutiva guidato da pCAGGS è un indicatore di efficienza di trasfezione, mentre T7 promoter guidato espressione GFP da pCITE è un controllo per l'infezione MVA-T7 e l'attività della polimerasi T7. Le cellule sono state esposte a 24 ore post-transfection/post-infection (B) saggio emoagglutinazione (HA): La presenza di particelle virali nel liquido allantoideo induce emoagglutinazione, che è indicata da una mancanza di pellet nel fondo di una V ben modellato. Assenza di virus permette la formazione di un pellet rossa sul fondo di the bene. La figura mostra sia i controlli necessari per qualsiasi test HA (liquido allantoico negativo, pulito, positivo, un campione NDV già caratterizzato), ed i risultati di tre campioni sconosciuti ottenuti dopo un salvataggio, con due positivo (+) e uno negativo (-) risultato.

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Discussion

Diversi fattori devono essere considerati per ottenere buoni risultati, mentre il salvataggio NDV. In primo luogo, il costrutto intera lunghezza cDNA da utilizzare deve essere progettato per consentire l'integrazione funzionale dei nuovi transgeni / modifiche nel genoma NDV. Ciò significa, come detto sopra, che le sequenze (i) end appropriato gene (GE), intergenica (IG) e inizio gene (GS) devono essere aggiunti, se necessario, (ii) non vi sono sequenze putative GE o GS nel estera gene, e (iii) il genoma ricombinante completa segue la "regola del sei".

Per quanto riguarda il processo di salvataggio, la qualità delle preparazioni plasmidici, le scorte MVA-T7 e corretta manutenzione delle cellule sono critici. Per la maggior parte dei casi, purificazione maxiprep standard del DNA plasmidico è sufficiente, anche se i processi di clonazione e salvataggio difficili, a causa delle dimensioni o la natura dei transgeni, possono essere migliorate purificando DNA mediante centrifugazione in gradiente di densità CsCl. Efficienza di trasfezione usando Lipofectamine è di solito sufficiente per un salvataggio di successo, sebbene possano essere utilizzati anche altri metodi di trasfezione come nucleofection. In ogni caso, il rapporto tra i diversi plasmidi deve essere rigorosamente mantenuta (0.4:0.2:0.2:1 per NP-PL-pNDV, rispettivamente). A causa della natura laboriosa e in qualche modo stocastico del processo di salvataggio, almeno 2-4 diversi pozzetti devono essere trasfettate per costrutto di essere salvato, e diversi cloni dello stesso costrutto devono essere analizzati.

Nel protocollo che abbiamo descritto qui, usiamo MVA-T7 per fornire in trans polimerasi T7 necessario per l'espressione dei costrutti di cDNA virale. Mentre questa è la procedura standard nel nostro laboratorio, non è l'unico approccio possibile. Ad esempio, altri gruppi hanno salvato con successo NDV e altri non-segmentati, negativi virus filamento di RNA, utilizzando linee cellulari che esprimono costitutivamente alti livelli di T7 polimerasi 4,37. La disponibilità di un vettore ricombinanteo linea cellulare codifica T7 polimerasi, nonché prestazioni specifiche di entrambi gli approcci in un dato laboratorio, devono essere considerati quando si stabilisce nuovamente il sistema di salvataggio per NDV.

Dopo la determinazione della presenza NDV nel fluido allantoideo da HA, ulteriori studi devono essere eseguiti per caratterizzare completamente il virus appena salvato, come RT-PCR seguita da sequenziamento del genoma virale, IFA e Western blotting (WB) per determinare l'espressione del gene estraneo (se applicabile). A seconda della natura delle modifiche che i virus ricombinanti stanno portando, potrebbe anche essere necessario altro tipo di saggi biochimici e funzionali.

Il salvataggio di ricombinante NDV da cDNA è una tecnica utile per diverse ragioni. Primo e più evidente, questa tecnica fornisce la capacità di analizzare la biologia di NDV, un virus economicamente rilevante per l'industria aviaria, sperimentalmente alterando suoi geni e sequenze regolatrici. NDV è un paramyxovirus strettamente legato al patogeni umani come il morbillo, la parotite o virus respiratorio sinciziale, così come l'emergente, altamente patogeno Hendra e virus Nipah, ricerca sul ciclo di vita di base di questa famiglia di virus è importante per capire la loro biologia. Al di là della ricerca di base, NDVs ricombinanti hanno un grande potenziale come vaccino e vectos oncolitici, combinando la possibilità di trasportare geni estranei inseriti nei loro genomi con un profilo di sicurezza biologica ben valutato. Per tutti questi motivi, il protocollo di soccorso NDV può essere un bene prezioso per molti laboratori di tutto il mondo interessati alla ricerca sui virus, lo sviluppo di vaccini e il trattamento del cancro.

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Disclosures

Adolfo García-Sastre è un inventore di brevetti sul virus della malattia di Newcastle ricombinanti che sono di proprietà della Scuola di Medicina di Icahn al Monte Sinai.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti nei laboratori di Drs. Peter Palese e Adolfo García-Sastre per lo sviluppo di NDV invertire tecniche di genetica e per l'assistenza tecnica. La ricerca in virus della malattia di Newcastle in laboratorio AG-S è parzialmente finanziato dalla NIAD concedere R01AI088770 e dal Dipartimento di Centro di Eccellenza per la Sicurezza Nazionale Scienza e Tecnologia per emergenti e malattie zoonotiche animali (CEEZAD, numero award 2010-ST-061-AG001). La ricerca in laboratorio LM-S è finanziato da sovvenzioni NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, i Centri NIAID di eccellenza per la ricerca e l'Influenza Surveillance (HHSN266200700008C), e l'Università di Rochester Centro per Biodefense immunitario Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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References

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Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA
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Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

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