Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

Newcastlevirus (NDV) har studerats under de senaste åren för att utveckla nya vektorer för vaccinering och behandling, bland annat. Dessa studier har varit möjlig på grund av tekniker för att rädda rekombinant virus från cDNA, såsom de som vi beskriver här.

Abstract

Newcastlesjukevirus (NDV), prototypen medlem av Avulavirus släkte av familjen Paramyxoviridae 1, är en icke-segmenterade, negativ-sense, single-stranded, omsluten RNA-virus (fig 1) med potentiella tillämpningar som en vektor för vaccination och behandling av mänskliga sjukdomar. Fördjupad undersökning av dessa ansökningar har bara blivit möjlig efter införandet av omvänd genetik att rädda rekombinanta virus från plasmider som kodar för sina kompletta genom som cDNA 2-5. Viral cDNA kan enkelt modifieras in vitro genom användning av standardklonings-förfaranden för att ändra genotypen av viruset och / eller att inkludera nya transkriptionsenheter. Räddning av sådana genetiskt modifierade virus utgör ett värdefullt verktyg för att förstå faktorer som påverkar multipla stadier av infektion, såväl som möjliggör utveckling och förbättring av vektorer för expression och tillförsel av antigenerför vaccinering och behandling. Här beskriver vi ett protokoll för att rädda rekombinanta NDVs.

Introduction

Newcastlevirus (NDV), en avian paramyxovirus tillhör Avulavirus släktet 1, är en ekonomiskt relevant och därmed allmänt forskat och övervakade zoonotiska smittämnet, som allvarligt kan påverka fjäderfäuppfödning runt om i världen. Även om inte en mänsklig patogen, NDV har också studerats ingående utanför veterinär området både som modell paramyxovirus och på grund av sin mycket intressanta, naturliga oncolytic egenskaper 6. Forskning om NDV stor nytta av utvecklingen av omvänd genetik för enkelsträngade, icke-segmenterade negativ-sense RNA-virus, först beskrivna för rabiesvirus från Conzelmann och coleagues 2. En mängd genetiskt modifierade NDVs, bär främmande gener eller modifieringar av deras vildtyp genomet har studerats sedan dess. Arbetet med dessa rekombinanta virus har varit avgörande för att karakterisera olika virulensfaktorer inte bara av NDV utan också av andra relevanta human patogener som influensa A-virus 7 - eller den framväxande nipahvirus 8. Dessutom har ett antal olika studier undersökte användningen av dessa tekniker för att förbättra den inneboende antitumöraktivitet av NDV 6,9,10, främst genom att öka den immunstimulerande egenskaper av viruset. Annan relevant område av forskning på rekombinanta NDVs har varit alstringen av vaccinkandidater mot andra virala sjukdomar såsom influensa 5,11,12, HIV 13 mässlings 14, SARS 15, eller den som orsakas av det respiratoriska sincytial virus (RSV) 16. Bland de olika anmärkningsvärda fördelar som NDV är bristen på redan existerande immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten i de utländska genetiska insatser, brist på recombinatory aktivitet och övergripande en hög säkerhetsprofil i kombination med de ovan nämnda naturliga immunstimulerande egenskaper 17. Det är också anmärkningsvärt att potentiella användningen av rekombinanta bivalenta vacciner i poultry, virus skydd mot både NDV och högpatogen aviär influensa 11,12. Detta kan vara ett utmärkt sätt att minska risken för de senare sprids från vilda till tama djur, vilket också bidrar till att förhindra en eventuell interspecifik hoppa av den fruktade fågelinfluensan för människor. Slutligen reporter uttrycker NDV har använts för utvärdering av medfödda immunsvar samt identifiering av interferon antagonist kodas av flera virus 18-27.

Räddningsprocessen av en rekombinant, icke-segmenterade, negativ-strängat RNA-virus består i princip på ett konstlat sätt tvingar en viral replikationscykeln i en producerande cell genom att transfektera cDNA som kodar för den minimala infektiösa molekylära maskineri, som kallas ribonukleoprotein eller RNP (Figur 2). De RNPs bestå av det virala polymeraset (P-och L-proteiner), varvid nukleoprotein (NP) och fullängds-antigenomiskt RNA av viruset. Denna RNA + antigenom är the-mall som krävs för att generera de komplementära RNA-genom, som, även i samband med resten av proteinerna i den virala RNP, rekapitulerar samma smitt komplex som en naturlig virus skulle släppa på cellens cytoplasma vid infektion (Figur 2A ). Från detta steg framåt, kan den virala cykeln vidare naturligt och rekombinanta virioner encapsidating de modifierade genomen, kommer att genereras (Figur 2B). Anmärkningsvärt, transfektion av den genomiska cDNA istället för den antigenomiska cDNA försämrar kraftigt eller upphäver räddnings effektivitet 2,28-30 helt. Även när antigenomiskt cDNA transfekteras, är effektiviteten av inkapsling av det rekombinanta RNA in RNP i transfekterade celler antagligen mycket låg. På grund av detta, räddnings protokoll för NDV innehåller ofta olika steg för amplifiering av de få virus-partiklar som frigörs från de ursprungligen transfekterade celler genom samodling av dem med permissiva celler och / eller av deninfektion i embryonerade ägg.

Före räddnings kan cDNA manipuleras genom standardkloningsförfaranden i syfte att alstra de önskade modifieringar. Även om specifika mutationer av olika genprodukter och regulatoriska sekvenserna av virus kan rättframt uppnås på detta sätt, många av det publicerade arbete som involverar rekombinant NDV har krävt tillägg av en ny transkriptionsenhet in i NDV-genomet. Liksom andra medlemmar av paramyxovirus familjen, kodar NDV genomet åtta olika proteiner i sex transkriptionsenheter, som differentiellt uttrycks beroende på deras placering i förhållande till 3 'änden på en minskande gradient avgörande för virusets livscykel 1. På grund av detta måste platsen för den nya transkriptionsenheten inom genomet väljas omsorgsfullt för att uppnå en balans mellan uttrycket av transgenen och nedskrivning av viral replikation. Insättning mellan P-och M-gener har använts mest, tHough andra platser har också testats 13,31.

Oavsett insatsen, kloning i NDV cDNA måste följa vissa regler för att generera en rescuable konstruktion: (i) varje ny gen som ska ingå i NDV genomet måste vara under kontroll av lämpliga signaler för den virala RNA-beroende-RNA polymeras. Dessa sekvenser måste tillsättas uppströms om ny öppen läsram (ORF) så polymeraset kan känna igen slutet av föregående genen (GE) och början av den nya transgenen (GS), åtskilda av en enda nukleotid intergeniska sekvensen (IG) . Tillägg av en giltig Kozak (K) sekvens för att förbättra eukaryota ribosomala översättning rekommenderas också för bättre främmande proteinuttryck 32, (ii) effektiv replikering av NDV, som för de flesta medlemmar av Paramyxoviridae familjen är beroende av genomet längd är multipel av sex 33, varför någon insättning i NDV har att följa den här "regeln om sex". Om nödvändigt required ytterligare nukleotider kan läggas nedströms den nya ORF, och (iii) bör kontrolleras sekvensen av transgenen för att hitta möjliga GE och GS som sekvenser som kan inverka räddnings effektivitet, transgen uttryck och / eller virus livskraft. Om det finns, måste dessa sekvenser avlägsnas genom tyst mutagenes. Alstring av rekombinant fullängds-cDNA efter ovannämnda reglerna är det första steget för att effektivt framställa en genetiskt modifierad NDV som beskrivs här.

I det system som alla DNA-konstruktioner är under kontroll av T7-RNA-polymeras-promotorn (Figur 3). Detta cytoplasmiska polymeras tillhandahålles i träns genom saminfektion med en rekombinant modifierad vaccinia-Ankara-viruset (MVA-T7) 34. Fig. 3A visar pNDV-B1 plasmiden, vilken kodar för fullängds-antigenomiskt cDNA 5. Figur 3B visar pTM1 plasmider kodar NP, P-och L-ORF. Plasmider pCITE-GFP, som kodar, under T7-promotorn, grönt fluorescerande protein (GFP), och pCAGGS GFP-18, som kodar samma ORF under kyckling beta aktin-promotorn 35, används som kontroller. I detta protokoll visar vi det förfarande för att rädda rekombinant NDV från cDNA av den lentogena NDV-stammen Hitchner B1 5 (Figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av däggdjursceller (Figur 4A, Dag 1)

Sträck HEp-2 eller A549-celler dagen före transfektion i 6-brunnars plattor. Densitet av cellerna bör nå 80-90% sammanflödet följande dag. Vanligtvis kan ett sammanflytande 100 mm skål delas upp i åtta brunnar (omkring 1 x 10 6 celler per brunn). För varje virus som ska räddas, bör 2-4 olika brunnar tas med, samt 2 extra brunnar för kontrollerna pCAGGS-GFP och pCITE-GFP 18, i syfte att övervaka transfektion och MVA-T7 infektionseffektivitet, respektive.

2. Infektion av däggdjursceller med rekombinant Modified Vaccinia Ankara virus som uttrycker bakteriofag T7 RNA-polymeras (MVA-T7) (Figur 4A, Dag 2)

  1. Värm upp PBS 1x/BA/PS och media vid 37 ° C.
  2. Tvätta cellerna två gånger med 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Infect de odlade däggdjursceller med MVA-T7-virus vid en multiplicitet av infektion (moi) Av 1 pfu / cell i en slutlig volym av 200 | al i PBS / BA / PS för en timme vid rumstemperatur.
  4. Under virusinfektion inkubation förbereda transfektion mix som beskrivits i 3.

3. Transfektion av däggdjursceller (Figur 4A, Dag 2)

  1. Framställning av Lipofectamine: Mix 1-2 pg av LPF2000 med 250 ^ il OptiMEM per räddningsförsök och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
  2. Preparation av DNA: Gör en plasmid cocktail för varje räddning i 50 pl OptiMEM. Lägg till 0,4 ^ g av pTM1-NP, 0,2 pg av pTM1-P och 0,2 | ig av pTM1-L per rör. Lägg 1 ug av fullängds-cDNA-klon av NDV räddas till varje rör. Också förbereda två kontroll transfektioner, en med 2 pg av pCAGGS-GFP (kolla transfektion effektivitet) och den andra med 2 pg av pCITE-GFP (kolla T7-polymeras driven uttryck av MVA-T7).
  3. Efter LPF2000-OptiMEM lösning har förinkuberats i 5 minuter (steg 3.1), tillsätt 250il av lösningen på de DNA-rören (steg 3,2) och inkubera under 20-30 minuter vid rumstemperatur.
  4. Efter inkubation med MVA-T7, ta bort viruset inokulatet genom aspiration och ersätta med den DNA-LPF2000 transfektion mix (steg 3,3).
  5. Tillsätt 1 ml DMEM 10% FBS / PS till varje skål.
  6. Inkubera de infekterade / transfekterade celler för 6-8 timmar (eller över natten) vid 37 ° C, 5% CO2 och sedan ersätta transfektion media med 1,5 ml av färsk DMEM 10% FBS / PS.
  7. Vid 24 h efter transfektion, kan observeras kontrollbrunnarna under ett fluorescensmikroskop för att utvärdera transfektionseffektivitet (pCAGGS-GFP) och T7-polymeras-aktivitet (pCITE-GFP) (Figur 5A). Fortsätt med samodling av de infekterade / transfekterade celler med fågel fibroblaster som beskrivs nedan.

4. Co-kultur av däggdjursceller med fågelceller (Figur 4A, Dag 3)

Vanligtvis en sammanflytande 100 mm vävnadskultur maträtt av kyckling (CEF) or anka (defs) embryofibroblaster används per två transfekterade brunnar. Var noga med att förbereda i förväg, tillräckligt 100 mm vävnadsodlingsskålar av fågelceller per alla försök räddning. För effektiv räddning av viruset, är DMEM-10% FBS / PS-medium kompletterat med 5% av allantoisvätska och 30 mM MgCl2. Vid denna punkt, 24 tim pi kan däggdjursceller börja visa cytopatisk effekt (CPE) på grund av MVA-T7-infektion, asevident i fig. 5A.

  1. Värm upp PBS 1x och media till 37 ° C.
  2. Tvätta mammalieceller, 2x, med 1 ml PBS 1x.
  3. Trypsinisera däggdjursceller med 0,2 ml av EDTA-trypsin tills de fristående. Resuspendera cellerna i 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoisvätska, 30 mM MgCl2 och överför till en 100 mm vävnadsodlingsskål. Lägg 3 ml av samma medium.
  4. Tvätta fågelceller, två gånger med 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinisera fågelceller med 1 ml EDTA-trypsin och inkubera i 1-2 min vid 37 ° C tills cellerna lossnar. Resuspendera the celler adderar 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoisvätska, 30 mM MgCl2 och lägga till 4 ml av de trypsiniserade cellerna till däggdjurscellerna i samodlades 100 mm vävnadsodlingsskål för en total volym av 8 ml (4 ml däggdjurs, 4 ml fågelceller).
  6. Skaka försiktigt för hand de samodlade celler i 100 mm skål för att få en jämn fördelning och sedan placera dem i inkubatorn vid 37 ° C under 3-4 dagar. Kriterierna för att smitta ägg 3 eller 4 dagar efter samodling av däggdjurs-och fågelceller beror på hur mycket cytopatisk effekt (cell avrundning, död, lossnar från ytan, osv.) Observeras i MVA-T7 virusinfektion.

5. Infektion av Chicken befruktat ägg (Figur 4A, dagar 6-7)

  1. Efter 3-4 dagar av samodling av däggdjurs-och fågelceller, avlägsna en ml av vävnadsodlings supernatanten och tillsätt till ett Eppendorf-rör.
  2. Centrifugera vävnad odlingssupernatant under 1 min vid 12000 rpm i en bänkcentrifug för att avlägsna cellrester.
  3. Candle äggen med hjälp av en ljus genomlysning rutan för att visa gränsytan mellan luftsäcken och allantois kaviteten. Gör en markering på gränssnittet gränsen undvika blodkärl lokalisering. Spray 70% etanol över äggen för att skapa sterila förhållanden. Göra försiktigt ett hål i äggskalet på den markerade platsen och inokulera 500 pl av supernatanten med användning av en insulin (1 ml) spruta, som syftar nålen vertikalt och direkt in i allantoiskaviteten. (Figur 4B).
  4. Täta nick i äggskal med smält vax eller paraffin.
  5. Inkubera ägg under 2-3 dagar vid 37 ° C.

6. Skörd av allantoisvätska från Infected Chicken befruktat ägg (Figur 4A, dagar 8-10)

  1. Inkubera de infekterade äggen under 2-4 h eller över natten vid 4 ° C i syfte att döda kycklingembryo och koagulerar blodet.
  2. Spray äggen med 70% etanol (för att upprätthålla sterila betingelser).
  3. Knacka försiktigt den apikala delen av ägget, över luftspalten, med en sked. När äggskal är sprucken, ta bort fragment med pincett och fullt exponera allantois membranet.
  4. Exponera allantoiskaviteten genom utskärning allantois membranet med pincett och sax, undviker skador på blodkärlen och äggulan.
  5. Tryck försiktigt ner embryot med en spatel och samla den uppåtströmmande allantoisvätska (8-12 ml per ägg) med en 10 ml pipett. Undvik att skada äggula membranet. Överför allantoisvätska till ett 15 ml centrifugrör på is (använd en tub per ägg).
  6. Klargörande av allantoisvätska genom centrifugering under 5 min vid 1500 rpm. Överför supernatanten till ett nytt rör utan att störa pelleten.
  7. Förvara proverna vid 4 ° C i upp till 1 vecka, tills kontrollera dem för förekomst av NDV efter hemagglutineringsanalys.

7. Hemagglutination (HA)-analys

Förekomsten av virus i Allantoic vätska från infekterade äggen kan fastställas makroskopiskt genom deras förmåga att hemagglutinate kalkon röda blodkroppar (RBC). I fallet med NDV, är ungefär 10 6 plackbildande enheter (PFU) per ml som krävs för att ge en positiv signal i HA-analysen. HA-analyser utförs i V-bottnade 96-brunnsplattor. Negativ (PBS 1x, oinfekterade allantoisvätska) samt positiva (allantoisvätska från någon NDV virus) kontrollprov bör alltid finnas med i alla HA-analys för att bekräfta det. För att utföra en HA-analys:

  1. Pipettera 50 | il av PBS 1x per brunn i en V-botten 96-brunnar.
  2. Pipettera 50 | il av allantoisvätska proverna i brunnarna på den första kolumnen i plattan. Utför 2-faldiga seriespäd genom resten av plattan och kasta den sista, extra 50 ^ från brunnar i den sista kolumnen.
  3. Dispensera 50 pl av 0,5% kalkon RBC i PBS 1x per brunn. Skaka plattan försiktigt genom att knacka.
  4. Inkubera plattan vid 4 ° C (eller is) feller från 30 till 45 min eller tills en klar pellet bildas i de negativa kontrollbrunnarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Räddning av NDV är en väletablerad procedur, rutinmässigt i de laboratorier som har tillgång till den fullständiga cDNA av viruset. Emellertid gör den inneboende stokastiska naturen av förfarandet det svårt att uppnå 100% räddnings effektivitet. Övervaka de tidiga stegen i processen, speciellt transfektionseffektiviteten och infektionen med MVA-T7, hjälper att identifiera möjliga problem. Figur 5A visar standard transfektion och transfektion / infektionseffektivitetsvinster som är tillräckligt för en lyckad NDV räddning. Efter rundor av förstärkning i fågel däggdjur co-kulturer och embryone ägg, är förekomsten av räddade virus upptäcktes av positiva brunnar i HA-analysen. NDV inducerar hemagglutination genom länkning erytrocyter och förhindrar således deras sedimentering i botten av den V-formade bra. Därför kan avsaknaden av HA-aktivitet enkelt särskiljas genom bildning av ett rött, runda pellet av RBC (Figur 5B). Negativa resultati HA-analys kan bero på en otillräcklig titer av virus i allantoisvätska: minst titer av ca 10 6 pfu / ml erfordras för att få en positiv HA-resultat. Lägre virustitrar kan fortfarande påvisas med immunofluorescens assay (IFA) med hjälp av specifika anti NDV antikroppar. En ny passage på ägg för ytterligare förstärkning av viruset förekommer i de första inokulerade äggen rekommenderas i dessa fall.

Figur 1
Figur 1. Genom organisation av Newcastlevirus (NDV) Den icke-segmenterade, enkelsträngat negativ-känsla RNA-genom av NDV är 15.186 nukleotider (nt) lång och kodar åtta olika polypeptider i sex transkriptionsenheter:. NP, P, M, F, HN och L plus V-och W-proteiner, uppstod efter förskjutningar i läsramen för P-ORF under transkription. Icke-kodande, regulatoriska sekvenser flankerargenomet i sitt 3 "(ledare) och 5" (trailer) slutar. Ytterligare icke-kodande gen slut (GE), intergen (IG) och gen start (GS) sekvenser reglerar viruspolymerasaktivitet mellan de olika ORF. Expressionsnivåer i de olika generna på det virala genomet bero på deras relativa position i förhållande till 3'-änden (dvs. NP transkripten är de mest förekommande, L avskrifter minst), vilket effektivt skapar en gradient kritisk för virusets livscykel 1.

Figur 2
Figur 2. Grund för NDV räddning från klonat DNA. Schematisk jämförelse mellan en naturlig (A) och den artificiellt inducerad (B) cykel under räddningsprocessen. (A) Efter att fästa till målcellen, släpper sin iska innehåll i cytoplasman inkapslad viruset i RNP. RNA-polymeras transkriberar RNA-genomet i de olika mRNA i de virusproteiner och i en kompletterande, full längd antigenom RNA + kopia, som är mall för produktion av flera kopior av det ursprungliga genomet som kommer att införlivas i begynnande virioner. (B ) Under räddningsprocessen, är komponenterna i RNP (NP, P-och L-proteiner, samt en fullängds, vanligtvis modifierad antigenom RNA) från cDNA transfektion. Vid beredning av antigenom RNP i cytoplasman av den transfekterade cellen, kan de producerar de kompletterande, rekombinanta iska RNP och en hel cykel kan sedan börja på nytt, som slutar med lanseringen av rekombinanta virus.

Figur 3
Figur 3. T7-driven expressionsplasmiderna för generering av rekombinant NDV. (A) Full längd viral cDNA: The fullängds pNDV-B1 ampicillinresistens plasmid driver uttryck för lentogen NDV stam Hitchner B1 antigenom under T7-promotorn (P T7) och T7-terminatorsekvensen (T T7) som innehåller hepatit Delta Ribozyme (HDR) klyvning. Den pNDV-B1 var ursprungligen avsedd att bära utländska insatser mellan P och M-generna 5. Införande av en ny gen (Xbal-stället) kräver tillsats av den reglerande genen ände (GE), intergena (IG) och genen start (GS)-sekvenserna för att möjliggöra dess funktionella igenkänning av det virala polymeraset. Expression effektiviteten av transgenen kan förbättras med tillsats av en Kozak (K)-sekvensen uppströms om startkodonet 32. Hela kassetten införs i NDV cDNA måste ha ett totalt antal nukleotider delbart med sex att följa den "regeln om sex" 33 som driver en effektiv replikering av de flesta paramyxovius genomen (B) Protein uttryckningsplasmider:. Viral NP, P, och L-ORF, kantadeav T7-promotorn (P-T7), UTR av encefalomyokarditvirus (EMC) och T7-terminator (T T7) sekvenser klonades in i pTM1 ryggrad ampicillinresistens vektor 5,36.

Figur 4
Figur 4. Plasmid-baserade omvänd genetik för generering av rekombinanta Newcastlesjukevirus. (A) Viral räddning: A549 eller HEp-2-celler är infekterade med den modifierade vacciniavirus Ankara som uttrycker bakteriofag T7-polymeras (MVA-T7). Efter viral infektion, celler som är co-transfekterades med expressionsplasmiden som krävs för replikering och transkription av NDV-virusgenomet (NP, P och L) tillsammans med den fulla längden NDV cDNA under T7-promotor. Tjugofyra timmar post-infection/transfection, däggdjursceller är samodlade med kyckling eller anka (CEF ochDEF, respektive). Tre till fyra dagar efter co-kultur, 8-10 dagar gamla kycklingembryone ägg ympas med vävnads odlingssupernatanter av co-kultur celler för ytterligare förstärkning. Två till tre dagar efter inkubering av 8-10 dagar gamla ägg vid 37 ° C, allantoisvätska från äggen skördas och analyseras med avseende på lyckad räddning av det rekombinanta viruset genom HA-analys. Positiva (+) räddnings virus karakteriseras vidare på genomisk (RT-PCR) och protein (t.ex. immunofluorescens assay (IFA) och Western blot (WB) nivåer Negativ (-.) HA resultat kan bero på att det saknas tillräckligt med virus för att vara . detekteras av HA Reinfection färsk kyckling embryonerade ägg att amplifiera virus indikeras (B) Infektion av kycklingembryonerat ägg. 8-10 kycklingembryoinnehållande ägg som skall genomlysas för att markera gränsytan mellan luftsäcken och allantois kavitet med ett insulin. (1 ml) sprutan, ägg infekteras med vävnadskultursupernatant inne allantois cavity, såsom anges.

Figur 5
Figur 5. Representativa resultat. (A) Transfektion och MVA-T7 infektion effektivitet: representativ fluorescerande (vänster) och ljusa (höger) områden A549-celler transfekterade med pCAGGS-GFP (överst) eller infekterade med MVA-T7 och transfekterade med pCITE-GFP (botten) illustreras . Konstitutiv GFP-expression driven av pCAGGS är en indikator på transfektionseffektivitet, medan T7-promotordrivna GFP-expression genom pCITE är en kontroll för MVA-T7-infektion och T7-polymeras-aktivitet. Celler avbildades vid 24 h post-transfection/post-infection (B) hemagglutineringsanalys (HA): förekomst av virala partiklar i allantoisvätska inducerar hemagglutination, vilket visas genom avsaknad av pelleten i botten av en V-formad väl. Frånvaro av virus medger bildning av en röd pellet i botten av the väl. Figuren visar både de kontroller som behövs för alla HA-analys (negativ, ren allantoisvätska, positiv, en redan karakteriseras NDV prov), och resultaten av tre okända prover erhållna efter en räddning, med två positiva (+) och en negativ (-) resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera faktorer ska beaktas för att uppnå bra resultat samtidigt rädda NDV. Först den fullängds cDNA-konstruktion som ska användas måste utformas så att den funktionella införlivandet av nya transgener / ändringar i NDV genomet. Detta innebär, enligt ovan, att (i) lämplig gen end (GE), intergen (IG) och gen start (GS) sekvenser är att läggas till vid behov, (ii) det inte finns några förmodade GE eller GS-sekvenser i den utländska gen, och (iii) den fullständiga rekombinanta genomet följer den "regeln om sex".

När det gäller räddningsprocessen, kvaliteten på förberedelserna plasmid, de MVA-T7 lager samt korrekt underhåll av celler är kritiska. För de flesta fall är standard maxiprep rening av plasmid-DNA nog, även om svåra kloning och räddningsprocesser, på grund av storleken eller arten av transgener, kan förbättras genom att rena DNA genom CsCl densitetsgradientcentrifugering. Transfektion effektivitet med hjälp av Lipofectamine är vanligen tillräckligt för en lyckad räddning, fastän andra transfektion metoder såsom nucleofection kan också användas. I varje fall måste förhållandet mellan de olika plasmider att vara strängt upprätthålls (0.4:0.2:0.2:1 till NP-PL-pNDV, respektive). På grund av den mödosamma och på något sätt stokastiska karaktären av räddningsprocessen, bör åtminstone 2-4 olika brunnar transfekteras per konstruktion att bli räddade, och olika kloner av samma konstruktion bör analyseras.

I det protokoll som vi har beskrivit här använder vi MVA-T7 att i trans T7 polymeras krävs för uttrycket av virala cDNA konstruktioner. Även om detta är ett standardförfarande i vårt laboratorium, är det inte den enda möjliga metoden. Till exempel har andra grupper framgångsrikt räddade NDV och andra icke-segmenterade, negativ-sträng-RNA-virus med hjälp av cellinjer som konstitutivt uttrycker höga nivåer av T7-polymeras 4,37. Tillgängligheten av en rekombinant vektoreller cellinje kodning T7-polymeras, liksom den specifika prestanda av antingen strategi i en given laboratorium, bör beaktas vid upprättandet nytt räddningssystem för NDV.

Efter bestämning av NDV-närvaro i allantoisvätska av HA ytterligare studier att utföras för att fullständigt karaktärisera den nyligen räddade virusen, t.ex. RT-PCR, följt av sekvensering av det virala genomet, IFA och Western-blotting (WB) för att bestämma expressions av den främmande genen (om tillämpligt). , Kan också behövas, beroende på arten av de modifieringar som de rekombinanta virus som bär andra typer av biokemiska och funktionella analyser.

Räddningen av rekombinant NDV från cDNA är en användbar teknik för flera skäl. Först och mest uppenbara, ger denna teknik med förmågan att analysera biologi NDV, ett ekonomiskt relevant virus för fågelindustrin, genom experimentellt förändra sina gener och regulatoriska sekvenser. NDV är ett paramyxovirus nära besläktad med mänskliga patogener som mässling, påssjuka eller respiratory syncytial virus, liksom den framväxande, högpatogen Hendra och Nipah virus, forskning om grundläggande livscykeln för denna familj av virus är viktigt att förstå deras biologi. Utöver grundforskning, rekombinanta NDVs har en stor potential som vaccin och onkolytiska vectos kombinerar möjligheten att genomföra Superiorkurs gener i sina genom med en väl bedömt biosäkerhet profilen. Av alla dessa skäl kan det NDV räddnings protokollet vara en värdefull tillgång för många laboratorier över hela världen intresserade av virusforskning, vaccinutveckling och cancerbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Adolfo García-Sastre är en uppfinnare av patent på rekombinanta Newcastlesjuka virus som ägs av Icahn School of Medicine på Mount Sinai.

Acknowledgments

Författarna vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i laboratorier Dr. Peter Palese och Adolfo García-Sastre för utveckling av NDV omvänd genetik och för tekniskt stöd. Forskning i Newcastlevirus i AG-S laboratorium är delvis finansierat av NIAD bevilja R01AI088770 och av Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence för nya och Zoonotic djursjukdomar (CEEZAD, utmärkelse nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratorium finansieras av NIH bidrag RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700008C), och The University of Rochester Centrum för Biodefense Immunmodeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Tags

Immunology , Vaccines Oncolytic virotherapy Immunity Innate Newcastlevirus (NDV) MVA-T7 omvänd genetik plasmid transfektion rekombinant virus HA analys
Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A.,… More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter