Summary
דג הזברה הייתה כלי חשוב לתחומי מחקר רבים. כאן אנו מדגימים שיטה כדי לעורר תגובה חזותית ולחשב את חדות ראייה תפקודיות בדג הזברה המבוגר.
Abstract
דג הזברה הוא מודל מוכח למחקר חזון, אולם רבים מן השיטות הקודמות מתמקדות בדרך כלל על דגי זחל או הפגינו תגובה פשוטה. לאחרונה התנהגות חזותית למבוגרים דג הזברה הפכה עניין, אבל שיטות למדידת תגובות ספציפיות חדשות הקרוב. כדי להתמודד עם הפער הזה, אנחנו יצאנו לפתח מתודולוגיה שוב ושוב ובאופן מדויק לנצל את תגובת optokinetic (OKR) כדי למדוד את חדות ראייה בדג זברה מבוגר. כאן אנו מראים כי חדות הראייה של דג הזברה המבוגר ניתן למדוד, כולל שני חדות משקפת ומשקפות. מכיוון שהדגים לא ייפגעו במהלך ההליך, חדות הראייה ניתן למדוד והשוואה לתקופות קצרות או ארוכות של זמן. יכולות להיעשות גם מדידות חדות הראייה המתוארות כאן מאפשרות מהירות לתפוקה גבוהה ולנהלים חזותיים נוספים אם תרצה בכך. סוג זה של ניתוח הוא תורם למחקרי התערבות תרופתית או חקירות של התקדמות מחלה.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) הוא מודל טוב ללמוד פיזיולוגיה חזותית בשל הדמיון של הרשתית שלהם לבעלי חוליות אחרות, מחזור החיים הקצר שלהם, ואת הזמינות של מוטציות שינו גנטי 1,2. רפלקס / התגובה / ניסטגמוס optokinetic (OKR) הוא שילוב של מרדף חלק ותנועות עיני saccade מהירה. במשך יותר משנים 60 רופאים הוכיחו כי OKR יכול לשמש למדידה באופן אובייקטיבי את חדות ראייה בחולים ושימושי במיוחד לקביעת יכולות חזותיות תינוק 3-5. השימוש המתועד הראשון של OKR בבעלי חיים היה באמצעות יונים ב1950s 6. לאחרונה, OKR הפך לכלי רב ערך להערכת תפקוד הראייה בדג זברת זחל ומשמש לעתים קרובות בדיקת סקר למוטציות גנטיות שיש לי 1,2 לקות ראייה. בעוד OKR כבר בשימוש נרחב כדי לקבוע תפקוד ראייה בדג זברת זחל, יש לו רק לאחרונה הודגם בזברה בוגרתהדגים 7-10. נייר האחרון על ידי Tappeiner et al. משתמש במערכת optomotor זמינה מסחרי משמשת באופן מסורתי לעכברים, OptoMotry, על מנת להוכיח כי חדות הראייה של דג הזברה המבוגר נשארה די קבועה, ~ 0.59 מחזורים לתואר (CPD), אפילו על פני מהירויות זוויתי שונות 7 .
למרות OKR הוכיחה להיות שימושי למדי במחקרי דג הזברה זחל, שיטות אחרות להתנהגות חזותית כבר בשימוש במבוגרים דג הזברה עם דרגות שונות של הצלחה. Assay תגובת הבריחה הוכיח כי דג הזברה לבקן ואודם, שתי מוטציות פיגמנטציה, צמצמו תגובות חזותיות בתנאי אור בהירים 11,12. אותו assay תגובת בריחה זה גם זיהה בהצלחה מוטציות ד עיוורון הלילה, אם כי ב2 שנים של גיל 13. עם זאת, assay תגובת הבריחה אינו נטול פגמים. קשה לייחס לתפקוד ראייה מדויק ורק approximatio ברוטוn שינויים חזותיים - כלומר הוא לוקח שינוי גדול לפני השינוי מזוהה.
שיטה נוספת שפותחה לזיהוי דג הזברה מבוגר עם ליקויי ראייה היא תגובת optomotor (OMR) 11. ב assay זה, דגים ממוקמים במכל עגול עם טור אטום במרכז. פסים שחורים ולבנים לסובב סביב הטנק והדגים הוא המוטל עם שוחה בכיוון תנועת הפס. כמו תגובת הבריחה, OMR מתמקד ביכולות visuomotor של דג הזברה המבוגר. אולם זה שמש בהצלחה לזהות דגים עם ליקויי ראייה, כגון מוטציות lrp2/bugeye 14. Buphthalmos lrp2/bugeye דג הזברה התערוכה, לחץ התוך עיני מוגבר, פחת OMR, וניוון רשתית מתקדם 14,15.
מחקרים רבים השתמשו ביכולות visuomotor בדג זברה מבוגר, אשר לעתים סובייקטיבי ולא יכול להיות קוואנטניתח itatively. על ידי שימוש בOKR, אפשר ללמוד את חדות הראייה של דגים בוגרים יותר באופן אובייקטיבי. בנינו המכשיר שלנו OKR, במודל אחד בתחילה שימש למחקרי זחל 1. במחקר זה אנו מראים כי OKR יכול לשמש כדי לחשב גם משקף וחדות ראייה דו עיניות בדג זברה.
Protocol
כל בעלי החיים והניסויים צריכים להיות מאושרים ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש במוסד המתאים או דרישות משפטיות אחרות.
1. טיפול דג הזברה
- לשמור על דג הזברה בתנאים סטנדרטיים ב28.5 ° C על מחזור אור hr כהה 14 10 שעה 16.
- שמור על דג הזברה מבוגר בצפיפות טנק של כ 3 דגים / ל '
2. תגובת Optokinetic (OKR)
- לבנות מכשיר הקלטת OKR המותאמת אישית באמצעות קוטר 14.5 סנטימטר מסתובב תוף, מיקרוסקופ סטריאו עם הגדרות להתאמה עוצמת אור (300-8,000 סוויטה דה לוקס) ומחשב (איור 1 א).
- צרף מצלמה למיקרוסקופ שיספק שידור חי על גבי צג צמוד ולאפשר ללכידת תמונה והקלטה.
- לשלוט על התוף מסתובב באמצעות מיקרו המקושר למחשב אשר accommoבחירות מהירות וכיוון שונות תאריך.
- להרדים את הדגים בtricaine 0.016% ל2-3 דק 'ולאחר מכן הנח את הדג על פלטפורמה קטנה עם העיניים וזימים תלויים מעל הקצה.
- הנח ספוג / מגבת דקה על הגוף של הדג ולהצמיד 2-3 חתיכות של קצף, בצורה שתתאים לדגים, על הדגים כדי להשאיר אותו משותק. הגבלת התנועה של הזנב של הדג נמצא להיות היבט קריטי לקיבוע מבלי לגרום לפגיעה בדגים, והייתה הטוב ביותר שהושגה באמצעות פיסת הקצף שטוחה. (איור 1b)
- מקם את הדגים בתוך טנק גלילי מלא מים, שמתאים בתוך התוף מסתובב של מכשיר הקלטת OKR. השתמש במגנטים על הפלטפורמה כדי למקם את הדגים זקופים, עם העיניים כ 7.3 סנטימטר מהקצה של התוף. הדג צריך להחיות מההרדמה תוך כמה דקות - נשימה רגילה תתחדש ויש לשים לב תנועות עיניים אקראיות.
- הנח basדואר צורם של 0.07 מחזורים לתואר (CPD) לתוך התוף מסתובב ולעסוק בקרות מחשב כדי להתחיל סיבוב ולכידת וידאו (מהירות של סל"ד 12 שימשה לנייר הזה, אבל במהירויות של 8-16 סל"ד צריכים לתת תוצאות דומות).
- ברגע שOKR ראשונית שהושרו על ידי הבסיס הצורם, להשהות את הסיבוב קצר, ולהחליף את הסבכה עם סבכה קטנה יותר (תדירות מרחבית גבוהה יותר).
- חזור על תהליך זה עד שכבר לא יכול להיות שהושרו OKR. בדוק שוב עם הסבכה הקטנה ביותר שגרמה OKR הבאה גישת מדרגות שונה ולאחר מכן חזור באמצעות צורם שלא הצליח לעורר תגובה כדי לאמת את אובדן OKR. תהליך זה ניתן לחזור כדי לוודא מענה אמיתי לסבכה לגילוי הקטנה ביותר, אם צורם הסופי השתנה ביחס לאירוע ההכחדה הראשון.
- להשיג מדידות חדות המשקפת על ידי הצבת occluder פלסטיק שחור על הפסים סמוכים לעין ההפוכה. חזור על התהליך לעיל (שלבים 2.6-2.7).
- השג את חדות של העין ההפך ידי למקם מחדש את occluder וחוזר 2.6-2.7 צעדים שוב.
- שים לב למרחק כל עין היא מהפסים במהלך הליך הבדיקה על ידי שימוש ברצועת מדידת התייחסות מתחת לאקווריום, כך שניתן לחשב צעדי חדות מדויקים בשלבים הבאים.
3. חישוב חדות ראייה
- השג את חדות ראייה על ידי חישוב עלות לכל יום:
שבו הוא המרחק ממרכז העדשה לסבכה, ושעות היא אורכו של מחזור אחד של הסורג הקטן ביותר שבו OKR נצפתה (איור 1 ג'). - למדידות חדות ראייה משולבות, בממוצע משמש ערך משני מהשמאל ועין ימין.
שבו הוא המרחק ממרכז העדשה לסבכה, ושעות היא אורכו של מחזור אחד של הסורג הקטן ביותר שבו OKR נצפתה (איור 1 ג'). Representative Results
פונקציונליות התקנים OKR
מכשיר OKR כפי שהוסבר לעיל ומוצגים באיור 1 פונקציות עם תחזוקה מינימאלית. כפי שצוין בשלב 2.3, לשתק את הזנב הוא קריטי לשמירה על הדגים מאופקים במהלך ההקלטה. המשותק במידה מספקת, יכולים להיות כל הזמן הדגים במכשיר OKR לתקופות ממושכות של זמן. כתוצאה מכך, יש להיזהר בצעדי הקיבוע הראשוניים, כך שניתן לאסוף נתונים נוספים עבור כל דגים בודדים.
מדידות חדות ראייה
OKR המשקפת הוא שהושרו בקלות בדגים בוגרים נורמלים. על ידי ביצוע ההליך הנ"ל ניתן למצוא חדות ראייה לדג זברה בגילים רבים (איור 2). חדות מרחבית המשקפת הטובות ביותר שנרשמנו היו 0.74 CPD. כפי שצוין באיור 2, חדות המשקפת בדרך כלל עולה עם גיל (n = 46, p = 0.002 ANOVA באמצעות V14 SPSS), אבל רמות מעללאחר כ 12 חודשים של גיל. כאשר השווינו את חדות ראייה שנמדדה בחודש 5 דגים מסוג בר ישן לדגי lrp2/bugeye גיל בהתאמה, מצאנו כי דגי lrp2/bugeye צמצמו חדות (p <0.001 באופן משמעותי; סוג בר: 0.49 ± 0.05 CPD, n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; T של סטודנטים מבחן באמצעות Excel).
על ידי חוסם את עין ימין חדות הראייה לעין השמאל ניתן לקבוע, ולהיפך. כאשר לעומת חדות המשקפת, סיכום משקפת הוא ציין באופן דומה לראייה אנושית 17 (איור 3). חדות המשקפת היו בדרך כלל 5-10% יותר מאשר כל אחד ימינה (OD) או שמאלה חדות (OS) שנמדדו באופן עצמאי. לכמה דגים בודדים ההבדל היה שיפור 25%.
איור 1. reco OKRrding.) מכשיר OKR מורכב מקוטר 14.5 סנטימטר מסתובב תוף ומיקרוסקופ עם הגדרות עוצמת אור מתכווננת (300-8,000 סוויטה דה לוקס). מצלמה מספקת שידור חי במוניטור סמוך. יש התוף מסתובב הגדרות מהירות שונות בשני כיוונים עם כיוון השעון ונגד כיוון שעון ושבכות תדר המרחבי להחלפתם להוסיף ולהסיר לפי הצורך. דגי ארוחת בוקר) מאובטחים וממוקמים במרכזו של התוף מסתובב. C) מחזורים לתואר (CPD) מחושבים באמצעות = CPD 
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. חדות ראייה משתנה עם גיל. הגרף מראה חדות ראייה עצמאיות נמדדו 5 - 15 חודשים בגיל. חדות הראייה עולה באופן לאורך כל השנה הראשונה של פיתוח ולאחר מכן זנבות קצת ב15 חודשים של גיל (p = 0.002 ANOVA באמצעות V14 SPSS). כל נקודה עשויה גם לייצג את 1 או כמה דגים. חדות ראייה נמדדות במחזורים / תואר (CPD). (N = 46 כולל; 8 בשעה 5 חודשים; 4 ב6 חודשים; 7 ב8 חודשים; 6 בשעה 9 חודשים; 11 ב10 חודשים; 2 ב11 חודשים; 2 ב12 חודשים; ו6 ב15 חודשים). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. אפקט סיכום חדות ראייה משקפת. המשקפת (OU) חדות ראייה היא בדרך כלל גבוהה יותר בהשוואה לימין (OD) או שמאלה חדות העין (OS). בקבוצה מסוימת זו חדות OS היו נמוכות יותר באופן משמעותי. (* P = 0.006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
בהזדמנות הדגים עלולים לברוח לתוך מיכל המים. זה קריטי, כדי לשתק את הזנב. בנוסף השימוש בספוג / מגבת דקה על גופו של הדג נמצא גם להיות רב ערך לשמירה על הדגים הושעו לתקופות ממושכות של זמן. היינו מסוגל לשמור על דגים משותקים למשך יותר מ30 דקות באמצעות הליך זה מבלי לפגוע בדגים. משך הזמן הזה הוא יותר ממספיק כדי לעשות את המשקפת וגם חדות משקפות.
המצגת של הסורג ניתן גם לעשות זאת כפי שמתוארת כאן ובמקומות אחרים באמצעות תוף מסתובב פיזי או על ידי הצגת תצוגה דיגיטלית 18-22. יש שני סוגים יש יתרונות וחסרונות מסוימים. אנחנו בחרנו להשתמש בסיבוב הפיזי הן מסיבות עלות ומפרטים טכניים. לא כולל המחשב וציוד הדמיה, מכשיר OKR המתואר כאן יכול להיות בנוי סביב 150 דולרים.
OKR היא אמצעים אובייקטיביים לקביעת מולחדות רע"מ בדג זברה מבוגר. בעוד כמה מבחני visuomotor אחרים לראייה כבר בשימוש בניסויים קודמים ואפילו electroretinogram כבר נעשה בהצלחה בעיני דג הזברה מבוגר, למרות שזה לא נוצל במידה רבה, OKR דג הזברה המבוגר פותח את הדלת להרבה מצבים ניסיוניים חדשים 22. מחקר זה הוכיח השירות של OKR במדידת שינויי חדות ראייה לאורך זמן, זיהוי הבדל בחדות ראייה במודלים של מחלת עיניים, ובקביעת חדות ראייה משקפת.
מעניין לציין, כי חזון דג הזברה מבוגר בהשוואה לראייה אנושית (20/20) הוא כ 20/1, 000 (כאשר 0.60 CPD מומר -0.3 Logmar). למרות שזה אולי נראה גרוע, עיני דג הזברה הן גם מתאימות מאוד לסביבתו. למרות המשימה החזותית של מחפש דרך 6.5 סנטימטר של מים, כמה מילימטרים של פוליקרבונט, ועוד סנטימטר של אוויר, הדגים לבצע היטב! מצאנו כי חדות דג הזברה המבוגר היא אבוut 70% ממה שהייתי ניתן לחזות נתון מרווח קולטי האור שלהם. 23 ניגודיות כי עם ביצועים אנושיים אופטימליים ~ 20/12, שזה בערך 80% מחזו 20/10, וטכניקת OKR למדידת יכולת חזותית בדג הזברה מבוגר מרשימה 24 , 25.
הטכניקה של מדידת חדות ראייה בעין עצמאית תאפשר למחקרים בהם ניתן לטפל בעין אחת ואחרת שימשו כביקורת. בנוסף, דגים עם התפתחות העין סימטרית כגון lrp2/bugeye או דגים המתפתחים קטרקט יכולים להיות במעקב בצורה מדויקת יותר. יש לציין כי טיפול צריך לקחת כדי למדוד במדויק את המרחק בין העיניים לפסים וכדי לחסום את שדה ראייה מלא. טכניקה זו צריכה לפתוח את הדלת לצעדים יותר מדויקים וספציפיים של תפקוד ראייה דג הזברה.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מימון הניתן על ידי האוניברסיטה המערבית למדעי בריאות במכללה לאופטומטריה לDJC. תודה מיוחדת לIrisa תם לעיצוב גרפי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
References
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
- Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
- Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
- Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
- Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
- Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
- Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
- Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
- Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
- Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
- Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L.
- Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
- Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
- Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E.
- Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).
