Den Optokinetic Response som ett kvantitativt mått på synskärpan i Zebrafish

Summary

Zebrafisk har varit ett värdefullt verktyg för många forskningsområden. Här visar vi en metod för att framkalla en visuell respons och beräkna en funktionell synskärpa i den vuxna zebrafisk.

Abstract

Zebrafisk är en beprövad modell för syn forskning, men många av de tidigare metoder i allmänhet inriktade på yngel eller visat ett enkelt svar. På senare vuxna visuella beteende i zebrafisk har blivit av intresse, men metoder för att mäta specifika svar är nya kommer. För att åtgärda denna brist, vi på att utveckla en metod för att vid upprepade tillfällen och korrekt utnyttja optokinetic svar (OKR) för att mäta synskärpa i vuxen zebrafisk. Här visar vi att den vuxna zebrafisk synskärpa kan mätas, inkluderande både binokulära och monokulära acuities. Eftersom fisken inte skadas under förfarandet, kan synskärpan mätas och jämföras över korta eller långa tidsperioder. Synskärpan mätningar som beskrivs här kan också göras snabbt vilket möjliggör hög genomströmning och för ytterligare visuella förfaranden om så önskas. Denna typ av analys leder till läkemedelsinterventionsstudier och undersökningar av sjukdomsprogression.

Introduction

Zebrafisk (Danio rerio) är en bra modell för att studera visuell fysiologi på grund av likheten mellan deras näthinna till andra ryggradsdjur, deras korta livslängd, och tillgången till genetiskt förändrade mutanter ^1,2. Den optokinetic reflex / svar / nystagmus (OKR) är en kombination av mjuk strävan och snabba saccade ögonrörelser. I mer än 60 år kliniker har visat att OKR kan användas för att objektivt mäta synskärpan hos patienter, och är särskilt användbart för att bestämma spädbarn visuella kapacitet ^3-5. Den första inspelade användning av OKR djur använde duvor på 1950-talet ^6. På senare tid har det OKR blivit ett värdefullt verktyg för att bedöma den visuella funktion i larver zebrafisk och används ofta för att screena för genetiska mutanter som har en synskada ^1,2. Medan OKR har i stor utsträckning använts för att fastställa synfunktion i larver zebrafisk har det först nyligen visats hos vuxna zebrafiska ^7-10. En färsk artikel av Tappeiner et al. Använder en kommersiellt tillgänglig optomotor systemet som traditionellt används för möss, OptoMotry, att visa att den synskärpa av den vuxna zebrafisk förblir ganska konstant, ~ 0,59 cykler per grad (CPD), även över olika vinkelhastigheter ⁷ .

Fastän OKR har visat sig vara ganska användbar i larval zebrafisk studier har andra metoder för visuella uppträdande använts i zebrafisk vuxna med varierande grad av framgång. Analysflyktsvaret visade att albino och rubin zebrafisk, både pigmente mutanter, har minskat visuella reaktioner i starkt ljus ^11,12. Samma flykt svarsanalys har också lyckats identifiera natten blindhet d mutanter, om än vid 2 års ålder ^13. Emellertid är avbrottssvarsanalysen inte utan brister. Det är svårt att tillskriva till en exakt visuell funktion och är bara en grov approximation av synförändringar - vilket betyder att det tar en stor förändring innan ändringen identifieras.

En annan metod som har utvecklats för att identifiera vuxna zebrafisk med nedsatt syn är det optomotor svar (OMR) ^11. I denna analys är fisk placeras i en cirkulär tank med en ogenomskinlig kolumnen i mitten. Svarta och vita ränder roterar runt tanken och fisken har till uppgift att simma i riktning mot rand rörelse. Liksom flyktrespons, OMR fokuserar på visuomotor kapaciteten hos vuxna zebrafisk. Det har dock använts framgångsrikt för att identifiera fisk med synskador, såsom lrp2/bugeye mutanterna ^14. De lrp2/bugeye zebrafisk uppvisar buphthalmos, förhöjt intraokulärt tryck, minskat OMR, och progressiv retinal degeneration ^14,15.

Många studier har använt visuomotor kapacitet i vuxen zebrafisk, som ofta är subjektiva och kan inte vara quantitatively analyseras. Genom att använda OKR kan man studera den synskärpa av vuxen fisk mer objektivt. Vi har byggt vår egen OKR enhet, modellerad efter en början användes för larv studier ^1. I denna studie visar vi att den OKR kan användas för att beräkna både monokulära och binokulära synskärpan hos zebrafisk.

Protocol

All djurhållning och experiment bör godkännas och genomföras i enlighet med riktlinjer som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén av respektive institution eller andra rättsliga krav.

1. Zebrafish Care

1. Bibehåll zebrafisk under standardbetingelser vid 28,5 ° C på en 10 hr dark-14 hr ljuscykel ^16.
2. Håll vuxen zebrafisk på en tank täthet av ca 3 fiskar / L.

2. Optokinetic svar (OKR)

1. Bygg upp den anpassade OKR inspelningsenhet med en 14,5 cm diameter roterande trumma, en stereolupp med justerbar ljusintensitet inställningar (300-8,000 lux) och en dator (Figur 1a).
   1. Anslut en kamera till mikroskopet som ger en levande foder på en intilliggande bildskärm och möjliggöra fotografering och inspelning.
   2. Styr den roterande trumman med hjälp av en mikrokontroller kopplad till en dator som kommer att accommodatum olika hastighet och riktning val.
2. Söva fisken i 0,016% tricaine för 2-3 minuter och sedan placera fisken på en liten plattform med ögonen och gälarna svävande över kanten.
3. Lägg en tunn svamp / handduk över kroppen av fisken och stift 2-3 bitar av skum, formade för att rymma fisken, över fisken att hålla den immobiliserade. Att begränsa rörelse av svansen av fisken visade sig vara en avgörande aspekt för immobilisering utan att orsaka skada på fisken, och var bäst uppnås med hjälp av en platt bit skum. (Figur 1b)
4. Placera fisken i en cylindrisk vattenfylld tank, som passar inuti den roterande trumman i OKR inspelningsenhet. Använd magneter på plattformen för att placera fisken upprätt, med ögonen ca 7,3 cm från kanten av trumman. Fisken ska återuppliva från anestesi inom några minuter - normal andning återupptas och slumpmässiga ögonrörelser ska observeras.
5. Placera en base galler av 0.07 cykler per grad (CPD) i den roterande trumman och engagera datorn kontroller för att påbörja rotation och videoinspelning (en hastighet på 12 rpm användes för denna uppsats, men hastigheter på 8-16 rpm borde ge liknande resultat).
6. När en initial OKR framkallas av basen galler, pausa rotation kort, och byt ut gallret med en mindre galler (högre spatial frekvens).
7. Upprepa processen tills en OKR inte längre kan framkallas. Nytt genom den minsta gitter som orsakade ett OKR följande en modifierad trappa tillvägagångssätt och upprepar sedan med användning gittret som misslyckades att framkalla ett svar för att kontrollera förlusten av OKR. Denna process kan upprepas för att kontrollera ett riktigt svar på den minsta detekterbara galler om det slutliga gallret ändras i förhållande till den första utdöendet.
8. Skaffa monokulära mätningar skärpa genom att placera en svart plast ockluderingsanordning över ränderna intill det motsatta ögat. Upprepa proceduren ovan (steg från 2,6 till 2,7).
9. Skaffa synskärpa av det motsatta ögat genom att flytta tillslutningen och upprepa steg 2,6-2,7 igen.
10. Notera avståndet varje öga är från ränderna under testförfarandet genom att använda strip referensmätning under akvariet så att korrekta skärpa åtgärderna kan beräknas i följande steg.

3. Beräkning av synskärpan

1. Skaffa synskärpan genom att beräkna byggproduktdirektivet: där a är avståndet från mitten av linsen till gallret, och h är längden av en cykel av de minsta gallret där OKR observerades (figur 1c).
2. För kombinerade visuella mätningar skärpa, den genomsnittliga a-värde från både vänster och höger öga används.

Representative Results

OKR Device Funktionalitet

Den OKR anordning såsom förklarats ovan och visas i fig 1 fungerar med minimalt underhåll. Som påpekas i steg 2.3, immobilisera svansen är avgörande för att hålla fisken fastspända under inspelningen. Tillräckligt immobiliserade, kan fisken förvaras i OKR enheten i långa perioder. Därför bör man under de inledande immobilisering steg, så att mer data kan samlas in för varje enskild fisk.

Visuell mätning acuity

Den binokulära OKR lätt elicited i normal vuxen fisk. Genom att följa proceduren ovan kan man finna visuella acuities för zebrafisk för många åldrar (Figur 2). Den bästa kikare rumsliga synskärpa vi spelade in var 0,74 CPD. Såsom noteras i fig 2, ökar binokulär synskärpa allmänhet med ålder (n = 46, p = 0,002 ANOVA med hjälp av SPSS v14), men planar utefter ungefär 12 månaders ålder. När vi jämförde den uppmätta synskärpan i 5 månader gamla vildtyp fisk till åldersmatchade lrp2/bugeye fisk, fann vi att lrp2/bugeye fisken avsevärt hade minskat synskärpa (p <0,001; vild typ: 0,49 ± 0,05 CPD, n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; Students t-test med användning av Excel).

Genom att tillsluta det högra ögat synskärpan för vänster öga kan bestämmas och vice versa. Vid en jämförelse med binokulär synskärpa, är kikare summering observeras på samma sätt som det mänskliga ögat ¹⁷ (Figur 3). Den binokulära synskärpan var i allmänhet 5-10% bättre än antingen höger (OD) eller vänster (OS) acuities uppmätta självständigt. För vissa fiskar skillnaden var en 25% förbättring.

Figur 1. OKR recording. A) OKR består av en 14,5 cm diameter roterande trumma och mikroskop med justerbar ljusintensitet inställningar (300-8,000 lux). En kamera ger en levande foder på en angränsande bildskärm. Den roterande trumman har olika hastigheter i både medurs och moturs riktningar och utbytbara rumsliga frekvens galler infogas och tas bort efter behov. B) Fiskar är säkrade och placeras i mitten av den roterande trumman. C) Cykler per grad (CPD) beräknas med användning av CPD = Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Synskärpa förändras med åldern. Diagrammet visar oberoende visuella acuities uppmätta 5 - 15 månaders ålder. Den synskärpa ökar generellt under hela det första året av utveckling och sedan progressivt lite vid 15 månaders ålder (p = 0,002 ANOVA med hjälp av SPSS v14). Varje punkt kan antingen representera en eller flera fiskar. Synskärpa mäts i cykler / grad (CPD). (N = 46 totalt, 8 på 5 månader, 4 vid 6 månader, 7 till 8 månader, 6 vid 9 månader, 11 till 10 månader, 2 vid 11 månader, 2 vid 12 månader, och 6 på 15 månader). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Binokulär synskärpa summaeffekt. Den binokulära (OU) synskärpa är i allmänhet högre än höger (OD) eller vänster (OS) ögon acuities. I denna speciella grupp var de OS acuities betydligt lägre. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Ibland fisken kan fly in i vattentanken. Det är kritiskt att immobilisera svansen. Dessutom användning av en tunn svamp / handduk över fiskens kropp visade sig också vara ovärderlig för att hålla fisken suspenderade under längre tidsperioder. Vi kunde hålla fisk immobiliserade i mer än 30 min med hjälp av denna procedur utan att skada fisken. Denna tid är mer än tillräckligt för att göra kikare och båda monokulära acuities.

Presentationen av gallret kan antingen göras som beskrivs här och på andra ställen med hjälp av en fysiskt roterande trumma eller genom att presentera en digital display ^18-22. Båda typerna har särskilda fördelar och nackdelar. Vi valde att använda den fysiska rotationen både av kostnadsskäl och tekniska specifikationer. Exklusive datorn och bildutrustning, kan det OKR enhet som beskrivs här byggas för runt $ 150.

Den OKR är ett objektivt sätt att bestämma visUAL skärpa i vuxen zebrafisk. Medan flera andra visuomotor analyser för visionen har använts i tidigare experiment och även elektroretinogram har framgångsrikt gjort i vuxen zebrafisk ögon, även om det inte har varit starkt utnyttjats, den vuxna zebrafisk OKR öppnar dörren till många nya experimentella förhållanden ^22. Denna studie har visat på OKR s verktyg för att mäta synskärpa förändringar över tid, identifiera synskärpa skillnad i ögonsjukdomsmodeller och för att fastställa monokulär synskärpa.

Intressant, jämfört med det mänskliga ögat (20/20) är vuxen zebrafisk syn ca 20/1, 000 (då 0,60 CPD omvandlas till -0,3 logMAR). Även om detta kanske inte är bra, är de zebrafisk ögon mycket väl lämpad för sin omgivning. Trots den visuella uppgiften att titta igenom 6.5 cm vatten, några millimeter av polykarbonat och annan centimeter i luft, fiskarna utför ganska bra! Vi fann att den vuxna zebrafisk skärpan är ABOut 70% av vad som skulle förutsägas med tanke på deras ljusmätare avstånd. ²³ Kontrast som med optimal mänsklig prestation ~ 20/12, vilket är ungefär 80% av den beräknade 20/10, och OKR teknik för att mäta visuell förmåga i vuxen zebrafisk är imponerande ^{24 , 25.}

Tekniken att mäta oberoende ögon visuella acuities skulle möjliggöra studier i vilka ett öga kunde behandlas och den andra används som en kontroll. Dessutom fiskar med asymmetrisk ögonens utveckling såsom lrp2/bugeye eller fisk som utvecklar grå starr skulle kunna övervakas mer noggrant. Det bör noteras att vård måste vidtas för att noggrant mäta avståndet från ögonen till ränder och att täppa till hela synfältet. Denna teknik bör öppna dörren för mer exakta och specifika åtgärder för zebrafisk synfunktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950