Summary
Zebrafische haben ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsbereiche. Hier zeigen wir eine Methode, um eine visuelle Reaktion hervorzurufen und berechnen eine funktionale Sehschärfe im erwachsenen Zebrafisch.
Abstract
Zebrafische sind ein bewährtes Modell für Vision-Forschung, aber viele der früheren Verfahren in der Regel auf Fischlarven konzentriert oder demonstriert eine einfache Antwort. In jüngerer Erwachsener visuelle Verhalten im Zebrafisch hat sich von Interesse, sondern Methoden, um spezifische Reaktionen messen, neue kommen sind. Um diese Lücke zu schließen, machten wir uns, eine Methodik wiederholt und genau nutzen die optokinetische Reaktion (OKR), um die Sehschärfe bei erwachsenen Zebrafisch messen zu entwickeln. Hier zeigen wir, dass die Sehschärfe des erwachsenen Zebrafisch die gemessen werden kann, einschließlich der beiden Fernglas und monokulare Sehschärfe. Da der Fisch in dem Verfahren nicht geschädigt, kann die Sehschärfe gemessen und verglichen werden über kurze oder längere Zeit. Die hier beschriebenen Messungen Sehschärfe kann auch getan werden schnell so dass für hohen Durchsatz und für zusätzliche visuelle Verfahren, falls gewünscht. Diese Art der Analyse ist förderlich für Drogeninterventionsstudien oder Untersuchungen der Krankheitsprogression.
Introduction
Zebrafisch (Danio rerio) sind ein gutes Modell, um visuelle Physiologie aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Netzhaut zu anderen Wirbeltieren, ihren kurzen Lebenszyklus, und der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mutanten 1,2 studieren. Der optokinetische Reflex / Reaktion / Nystagmus (OKR) ist eine Kombination von glatten Streben und schnelle Sakkaden Augenbewegungen. Für mehr als 60 Jahren Kliniker haben gezeigt, dass der OKR kann zur objektiven Messung der Sehschärfe bei Patienten angewendet werden und ist besonders nützlich für die Bestimmung Säugling visuellen Fähigkeiten 3-5. Die erste aufgezeichnete Verwendung von OKR bei Tieren wurde mit Tauben in den 1950er Jahren sechs. Vor kurzem hat der Oberkirchenrat hat sich zu einem wertvollen Werkzeug für die Beurteilung der visuellen Funktion in Zebrafisch-Larven und wird häufig verwendet, um für die genetische Mutanten, die eine Sehbehinderung haben 1,2 Bildschirm. Während die OKR wurde weit verbreitet, um die visuelle Funktion in Zebrafisch-Larven festzustellen, hat es erst vor kurzem bei erwachsenen Zebra nachgewiesenfischen 7-10. Eine aktuelle Arbeit von Tappeiner et al. Nutzt einen handelsüblichen optomotorischen System traditionell für Mäuse verwendet, OptoMotry, um zu zeigen, dass die Sehschärfe des erwachsenen Zebrafisch bleibt ziemlich konstant, ~ 0,59 Zyklen pro Grad (cpd), auch über verschiedene Winkelgeschwindigkeiten 7 .
Obwohl die OKR hat sich als sehr nützlich bei der Zebrafisch-Larven-Studien wurden andere Methoden für visuelle Verhalten im Zebrafisch Erwachsene mit unterschiedlichem Erfolg eingesetzt. Die Fluchtreaktion Test gezeigt, dass Albino-Zebrafisch und Rubin, beide Pigmentierung Mutanten haben visuelle Antworten in hellen Lichtverhältnissen 11,12 reduziert. Das gleiche Fluchtreaktion Test auch erfolgreich Nachtblindheit d Mutanten identifiziert, wenn auch in 2 Jahren 13. Jedoch ist die Fluchtreaktion Assay nicht ohne Mängel. Es ist schwierig, zu einer exakten visuellen Funktion zuschreiben und ist nur eine grobe approximation der optische Veränderungen - also dauert es eine große Veränderung bevor die Änderung erkannt wird.
Eine weitere Methode, die zur Identifizierung von erwachsenen Zebrafisch mit Sehbehinderungen entwickelt wurde, ist der optomotorischen Reaktion (OMR) 11. In diesem Test werden die Fische in einem kreisförmigen Behälter mit einem undurchsichtigen Spalte in der Mitte. Schwarz-Weiß-Streifen drehen, um den Tank und die Fische schwimmen mit in Richtung der Streifenbewegung beauftragt. Wie die Fluchtreaktion, konzentriert sich die OMR auf den visuomotorischen Fähigkeiten des erwachsenen Zebrafisch. Es hat sich jedoch erfolgreich eingesetzt, um Fisch mit Sehbehinderungen, wie die 14 lrp2/bugeye Mutanten zu identifizieren. Die lrp2/bugeye Zebrafisch zeigen Buphthalmus, erhöhtem Augeninnendruck, verminderte OMR und progressive Degeneration der Netzhaut 14,15.
Viele Studien haben die visuomotorische Fähigkeiten bei erwachsenen Zebrafischen, die oft subjektiv und kann nicht verwendet werden quantitatively analysiert. Durch die Verwendung des OKR, kann man die Sehschärfe von erwachsenen Fischen mehr objektiv zu studieren. Wir haben unsere eigenen OKR Gerät, nach einem zunächst für ein Larven-Studien verwendet, modelliert gebaut. In dieser Studie zeigen wir, dass der OKR kann verwendet werden, um sowohl die monokulare und binokulare Sehschärfe im Zebrafisch zu berechnen.
Protocol
Alle Tierhaltung und Experimente sollte genehmigt und in Übereinstimmung mit Richtlinien, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der jeweiligen Institution oder sonstigen gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt werden gesetzt.
1. Zebrafisch-Pflege
- Pflegen Zebrafisch unter Standardbedingungen bei 28,5 ° C auf einem 10 h-14 h dunkel Lichtzyklus 16.
- Halten erwachsenen Zebrafisch an einem Tank Dichte von etwa 3 Fisch / L.
2. Optokinetischen Reaktion (OKR)
- Erstellen Sie die benutzerdefinierte OKR Aufnahmegerät mit einem 14,5 cm Durchmesser rotierende Trommel, ein Stereo-Mikroskop mit einstellbarer Lichtintensitätseinstellungen (300-8,000 Lux) und einen Computer (Abbildung 1a).
- Bringen Sie eine Kamera an das Mikroskop, die einen Live-Feed auf ein benachbartes Monitor bieten und damit für Bildaufnahme und Aufnahme.
- Kontrolle der Rotationstrommel mit einem Mikrocontroller mit einem Computer verbunden wird, die AccommoDatum verschiedenen Geschwindigkeits-und Richtungs Auswahl.
- Anesthetize die Fische in 0,016% Tricaine für 2-3 min und dann den Fisch auf einer kleinen Plattform mit den Augen und Kiemen über den Rand aufgehängt.
- Legen Sie eine dünne Schwamm / Tuch über den Körper der Fische und Pin 2-3 Schaumstoffstücke, geformt, um die Fische beherbergen, über die Fische zu halten, immobilisiert. Begrenzen der Bewegung des Schwanzes der Fische erwies sich als ein entscheidender Aspekt für die Immobilisierung ohne Verletzung des Fisch sein und am besten mit einem flachen Schaumstoffstück erreicht. (Abbildung 1b)
- Positionieren Sie den Fisch in einem zylindrischen Wasser gefüllten Tank, das im Inneren der rotierenden Trommel des OKR Aufnahmegerät passt. Mit Magneten auf der Plattform, um den Fisch aufrecht, mit den Augen etwa 7,3 cm von der Kante der Trommel. Die Fische sollten aus der Narkose innerhalb von wenigen Minuten wieder zu beleben - normale Atmung wird wieder aufgenommen und zufällige Augenbewegungen zu beachten.
- Legen Sie ein base Gitter von 0,07 Zyklen pro Grad (CPD) in die rotierende Trommel und in Eingriff mit den Computer steuert, um die Drehung und die Videoaufzeichnung zu beginnen (mit einer Geschwindigkeit von 12 UpM wurde dieses Papier verwendet, aber Geschwindigkeiten von 8-16 rpm sollten ähnliche Ergebnisse zu ergeben).
- Sobald ein Anfangs OKR wird von der Basis Gitter hervorgerufen, halten Sie den Dreh kurz, und ersetzen Sie das Gitter mit einem kleineren Gitter (höhere räumliche Frequenz).
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein OKR nicht mehr eruiert werden. Wiederholen Sie den Test mit dem kleinsten Gitter, die eine OKR nach einem modifizierten Ansatz Treppe verursacht und wiederholen Sie dann mit dem Gitter, die eine Reaktion auf den Verlust des OKR überprüfen zu entlocken fehlgeschlagen. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, um eine wahre Antwort auf den kleinsten nachweisbaren Gitter überprüfen, ob die letzte Gitter verändert gegenüber dem ersten Löschungsereignis.
- Erhalten monokulare Sehschärfe Messungen, indem Sie einen schwarzen Plastikverschluss über den Streifen neben der gegenüberliegenden Auge. Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang (Schritte von 2,6 bis 2,7).
- Besorgen Sie sich die Sehschärfe des anderen Auges durch Neupositionierung der Okkluder und Wiederholen der Schritte 2.6-2.7 wieder.
- Notieren Sie den Abstand jedes Auge ist von den Streifen während der Testprozedur mit Hilfe der Referenzmessstreifen unter dem Aquarium, so dass genaue Sehschärfe Maßnahmen können in den folgenden Schritten berechnet werden.
3. Berechnung der Sehschärfe
- Besorgen Sie sich die Sehschärfe durch die Berechnung der cpd:
wobei a der Abstand von der Mitte der Linse zu dem Gitter, und h die Länge eines Zyklus der kleinsten Gitter an dem OKR beobachtet (Fig. 1c). - Zur kombinierten Messung der Sehschärfe, die gemittelte a-Wert von sowohl dem linken und rechten Auge verwendet wird.
wobei a der Abstand von der Mitte der Linse zu dem Gitter, und h die Länge eines Zyklus der kleinsten Gitter an dem OKR beobachtet (Fig. 1c). Representative Results
OKR-Device-Funktionalität
Der OKR Gerät wie oben beschrieben und in Abbildung 1 dargestellten Funktionen mit minimalem Wartungsaufwand. Wie in Schritt 2.3 erwähnt, Immobilisierung der Schwanz ist entscheidend für die Beibehaltung der Fisch während der Aufnahme festgehalten. Ausreichend immobilisiert, können die Fische in der OKR Gerät für längere Zeit gehalten werden. Folglich sollte Sorgfalt während der Anfangs Immobilisierung Maßnahmen ergriffen werden, so dass mehr Daten für jeden einzelnen Fisch gesammelt werden.
Die Sehschärfe Messungen
Das Fernglas OKR leicht in normalen erwachsenen Fischen hervorgerufen. Nach dem Verfahren über einen Sehschärfen Zebrafisch für viele Altersgruppen (Abbildung 2) zu finden. Der beste Fernglas räumlichen Schärfe verzeichneten wir 0,74 cpd. Wie in Fig. 2 angegeben, der binokulare Sehschärfe Allgemeinen mit dem Alter zunimmt (n = 46, p = 0,002 ANOVA mit SPSS v14), aber einpendeltnach etwa 12 Monaten. Beim Vergleich der gemessenen Sehschärfe in 5 Monate alten Wildtyp-Fische Alter abgestimmte lrp2/bugeye Fisch, fanden wir, dass der Fisch hatte lrp2/bugeye Sehschärfe deutlich reduziert (p <0,001; Wildtyp: 0,49 ± 0,05 cpd, n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; Student-T-Test mit Excel).
Durch Verschließen des rechten Auges die Sehschärfe des linken Auges bestimmt werden und umgekehrt. Im Vergleich zu der binokularen Sehschärfe wird binokularen Summa ähnlich menschliche Auge 17 (Fig. 3) beobachtet. Das binokulare Sehschärfe war in der Regel 5 bis 10% besser als entweder rechts (OD) oder links (OS) acuities unabhängig gemessen. Aus irgendeinem einzelnen Fische der Unterschied war eine Verbesserung um 25%.
Fig. 1 ist. OKR recoDing. A) Der OKR Gerät besteht aus einem 14,5 cm Durchmesser rotierenden Trommel und Mikroskop mit einstellbarer Lichtintensitätseinstellungen (300-8,000 Lux). Eine Kamera bietet einen Live-Feed auf einer benachbarten Monitor. Die Drehtrommel hat verschiedene Geschwindigkeiten in beiden Richtungen im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn und austauschbar Raumfrequenzgitter eingesetzt und entfernt nach Bedarf. B) Fisch befestigt sind und in der Mitte der rotierenden Trommel angeordnet ist. C) Zyklen pro Grad (cpd) berechnet wird mit cpd = 
Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Die Sehschärfe ändert sich mit dem Alter. Die Grafik zeigt, unabhängig Sehschärfe gemessen 5 - 15 Monate in Alter. Das erhöht die Sehschärfe in der Regel während der ersten Jahre der Entwicklung und Schwänze sich ein wenig bei 15 Monaten (p = 0,002 ANOVA mit SPSS v14) dann. Jeder Punkt kann entweder für 1 oder mehrere Fische. Die Sehschärfe wird in Zyklen / Grad (cpd) gemessen. (N = 46 insgesamt, 8 auf 5 Monate, 4 auf 6 Monate, 7 auf 8 Monate, 6 auf 9 Monate, 11 auf 10 Monate, 2 mit 11 Monaten, 2 bei 12 Monaten und 6 auf 15 Monate). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Binocular Sehschärfe Summationseffekt. Das Fernglas (OU) Sehschärfe ist im allgemeinen höher, verglichen mit rechts (OD) oder links (OS) Augen acuities. In dieser speziellen Gruppe waren die OS acuities deutlich niedriger. (* P = 0,006, n = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Discussion
Gelegentlich können die Fische in den Wassertank zu entkommen. Es ist kritisch, um den Schwanz zu immobilisieren. Zusätzlich ist die Verwendung einer dünnen Schwamm / Tuch über dem Körper des Fisches wurde auch gefunden, von unschätzbarem Wert zu halten, die Fische für längere Zeit ausgesetzt zu sein. Wir waren in der Lage, Fisch für mehr als 30 min immobilisiert mit diesem Verfahren, ohne die Fische zu halten. Diese Zeit ist mehr als ausreichend, um die beiden monokularen und binokularen Sehschärfe tun.
Die Präsentation des Gitters kann entweder geschehen, wie hier und anderswo mit einer sich drehenden Trommel oder physisch durch die Vorlage einer digitalen Anzeige 18 bis 22 beschrieben. Beide Ausführungen haben Vor-und Nachteile. Wir entschieden uns, die physikalische Drehung sowohl aus Kostengründen und technischen Spezifikationen zu verwenden. Ohne den Computer-und Imaging-Geräte, kann die hier beschriebenen OKR Gerät für rund 150 Dollar gebaut werden.
Der OKR ist ein Ziel, Mittel zur Bestimmung übermanuelle Schärfe bei erwachsenen Zebrafisch. Während mehrere andere visuomotorischen Assays für Vision haben in früheren Experimenten verwendet wurde und auch die ERG wurde erfolgreich in erwachsenen Zebrafisch Augen gemacht, obwohl es nicht zu stark in Anspruch genommen, die erwachsenen Zebrafisch OKR öffnet die Tür zu vielen neuen experimentellen Bedingungen 22. Diese Studie hat der OKR-Dienstprogramm in der Messung der Sehschärfe Veränderungen über die Zeit gezeigt, die Identifizierung Sehschärfe Unterschied in der Augenkrankheit Modelle und bei der Bestimmung monokulare Sehschärfe.
Interessant ist, erwachsenen Zebrafisch Vision im Vergleich zu menschlichen Sehens (20/20) ca. 20/1, 000 (bei 0,60 cpd ist auf -0,3 logMAR umgerechnet). Obwohl dies schlecht scheinen, werden die Zebrafisch-Augen sehr gut für seine Umgebung geeignet. Trotz der visuellen Aufgabe der Blick durch 6,5 cm Wasser, ein paar Millimeter aus Polycarbonat, und einem anderen Zentimeter Luft, die Fische ganz gut durchführen! Wir fanden, dass die erwachsenen Zebrafisch Sehschärfe ist about 70%, was angesichts ihres Photorezeptors Abstand. 23. Kontrast vorhergesagt werden, dass mit einer optimalen menschlichen Leistung ~ 20/12 die etwa 80% der vorhergesagten 20/10, und OKR Technik zur Messung visuelle Fähigkeit in erwachsenen Zebrafisch ist beeindruckend 24 , 25.
Die Technik der Messung unabhängig Auge Sehschärfen würde für Studien, in denen ein Auge behandelt werden konnte und die andere verwendet als Kontrolle zu ermöglichen. Zusätzlich könnten Fische mit asymmetrischen Entwicklung des Auges wie der lrp2/bugeye oder Fische, die Katarakt entwickeln genauer überwacht werden. Es sollte beachtet werden, dass darauf zu achten, genau zu messen Sie den Abstand von den Augen zu den Streifen und die volle Sichtfeld zu verschließen werden. Diese Technik sollte die Tür, um genauere und spezifische Maßnahmen der Zebrafisch-visuellen Funktion öffnen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Finanzierung durch die Western University of Health Sciences College of Optometry zu DJC Verfügung gestellt. Besonderen Dank an Irisa Tam für Grafik-Design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
References
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
- Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
- Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
- Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
- Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
- Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
- Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
- Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
- Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
- Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
- Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
- Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
- Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
- Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
- Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).
