Summary
وقد الزرد أداة قيمة بالنسبة للعديد من المجالات البحثية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة للحصول على رد البصرية وحساب البصر وظيفية في الزرد الكبار.
Abstract
الزرد هي نموذج ثبت للبحوث الرؤية، ولكن العديد من الأساليب السابقة ركزت عموما على الأسماك اليرقات أو تظاهر استجابة بسيطة. في الآونة الأخيرة أصبح السلوك البصرية الكبار في الزرد من الفائدة، ولكن أساليب لقياس استجابات محددة هي الجديدة القادمة. لمعالجة هذه الفجوة، شرعنا في وضع منهجية للاستفادة مرارا وبدقة استجابة حركة العين (OKR) لقياس حدة البصر في الزرد الكبار. نحن هنا تبين أن حدة الزرد الكبار البصرية يمكن قياسها، بما في ذلك كل البراعة مجهر وأحادي. لأنه لم يتم المساس الأسماك أثناء الإجراء، وحدة البصر ويمكن قياس ومقارنة مدى فترات قصيرة أو طويلة من الزمن. ويمكن أيضا قياسات حدة الإبصار وصفها هنا أن يتم السماح بسرعة لإنتاجية عالية وإجراءات البصرية إضافية إذا لزم الأمر. هذا النوع من التحليل يفضي إلى دراسات التدخل المخدرات أو التحقيقات في تطور المرض.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) هي نموذج جيد لدراسة علم وظائف الأعضاء البصرية نظرا لتشابه الشبكية لالفقاريات الأخرى، ودورة حياة قصيرة فيها، وتوافر المسوخ المعدلة وراثيا 1،2. وحركة العين العاكسة / استجابة / رأرأة (OKR) هو مزيج من السعي نحو سلس وحركات العين السريعة حركة العين. لأكثر من 60 عاما وقد أثبتت الأطباء أن OKR يمكن استخدامها لقياس موضوعي حدة البصر لدى المرضى ومفيد خاصة لتحديد قدرات الأطفال البصرية 3-5. استخدام سجلت أول من OKR في الحيوانات كان يستخدم الحمام في 6 1950S. في الآونة الأخيرة، أصبحت OKR أداة قيمة لتقييم وظيفة البصرية في الزرد اليرقات وغالبا ما تستخدم للكشف عن طفرات الجينية التي لديها 1،2 ضعف البصر. في حين أن OKR قد استخدمت على نطاق واسع لتحديد وظيفة البصرية في الزرد اليرقات، ومؤخرا فقط تم التدليل عليه في حمار وحشي الكبارالصيد 7-10. ورقة أعدها مؤخرا Tappeiner وآخرون. يستخدم نظام optomotor المتاحة تجاريا التي تستخدم عادة للفئران، OptoMotry، لإثبات أن البصر من الزرد الكبار يبقى ثابتا تماما، ~ 0.59 دورة في درجة (وثيقة البرنامج القطري)، حتى عبر مختلف السرعات الزاوي 7 .
على الرغم من أن OKR وقد ثبت أن تكون مفيدة للغاية في الدراسات الزرد اليرقات، وقد استخدمت أساليب أخرى للسلوك البصرية في البالغين الزرد مع درجات متفاوتة من النجاح. أظهر فحص استجابة الهروب التي البيضاء وروبي الزرد، سواء المسوخ تصبغ، خفضت الاستجابات البصرية في ظروف الضوء الساطع 11،12. كما حددت هذه نفس الاستجابة الهروب الفحص بنجاح العمى الليلي د المسوخ، وإن كان في عمر 2 سنة من سن ال 13. ومع ذلك، فإن فحص استجابة الهروب لا يخلو من العيوب. فمن الصعب أن ينسب إلى وظيفة البصرية بالضبط وما هي إلا approximatio الإجمالين التغيرات البصرية - وهذا يعني أنه يأخذ تغيير كبير قبل أن يتم التعرف على التغيير.
طريقة أخرى التي تم تطويرها لتحديد الزرد الكبار ذوي العاهات البصرية هو الرد optomotor (ريال عماني) 11. في هذا الاختبار، يتم وضع الأسماك في خزان دائري مع عمود مبهمة في المركز. خطوط سوداء وبيضاء تدور حول الخزان ويتم تكليف السمك مع السباحة في اتجاه الحركة شريطية. مثل استجابة الهروب، يركز على قدرات ريال عماني visuomotor من الزرد الكبار. ولكن تم استخدامه بنجاح لتحديد السمك يعانون من إعاقات بصرية، مثل المسوخ lrp2/bugeye 14. وlrp2/bugeye جسامة المقلة المعرض الزرد، ضغط العين المرتفع، تضاءلت ريال عماني، وتنكس الشبكية التدريجي 14،15.
وقد استخدمت العديد من الدراسات قدرات visuomotor في الزرد الكبار، التي غالبا ما تكون ذاتية ولا يمكن أن يكون ضليع في الرياضياتتحليل itatively. باستخدام OKR، يمكن للمرء أن دراسة البصر من الأسماك البالغة أكثر موضوعية. بنينا لدينا جهاز OKR الخاصة، على غرار تلك المستخدمة في البداية لدراسات اليرقات 1. في هذه الدراسة علينا أن نظهر أن OKR يمكن استخدامها لحساب كل من أحادي وحدة البصر مجهر في الزرد.
Protocol
يجب الموافقة على جميع تربية الحيوانات والتجارب والتي تتم وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة المعنية أو المتطلبات القانونية الأخرى.
1. رعاية الزرد
- الحفاظ على الزرد تحت الظروف القياسية في 28.5 درجة مئوية في دورة 10 ساعة داكنة 14 ساعة ضوء 16.
- الحفاظ على الزرد الكبار في مناطق ذات كثافة خزان الأسماك حوالي 3 / L.
2. استجابة حركة العين (OKR)
- بناء جهاز تسجيل OKR مخصصة باستخدام 14.5 سم القطر الدورية طبل، مجهر ستيريو مع إعدادات شدة الضوء قابل للتعديل (300-8،000 لوكس) وجهاز كمبيوتر (الشكل 1A).
- إرفاق الكاميرا إلى المجهر من شأنها أن توفر البث المباشر على شاشة المجاورة والسماح لالتقاط الصور وتسجيل.
- السيطرة على طبل الدورية باستخدام متحكم مرتبطة جهاز الكمبيوتر الذي سوف accommoتاريخ مختلف سرعة واتجاه التحديدات.
- تخدير الأسماك في 0.016٪ تريكين لمدة 2-3 دقيقة ثم ضع السمك على منصة صغيرة مع العينين والخياشيم معلق فوق الحافة.
- وضع اسفنجة رقيقة / منشفة على جسم السمكة ويعلقون 2-3 قطع من الرغوة، وشكل لاستيعاب الأسماك، وأكثر من الأسماك للحفاظ على وظائفها. تم العثور على الحد من حركة ذيل السمكة أن يكون أحد الجوانب الهامة لتجميد دون أن تسبب إصابات للأسماك، وكان أفضل تحقيق ذلك باستخدام قطعة مسطحة من الرغوة. (الشكل 1B)
- ضع السمك في خزان مملوء بالمياه أسطواني، التي تناسبها داخل البرميل الدورية للجهاز تسجيل OKR. استخدام مغناطيس على منصة لوضع الأسماك تستقيم، مع عيون حوالي 7.3 سم من على حافة البرميل. يجب الأسماك احياء من التخدير في غضون بضع دقائق - سوف تستأنف التنفس الطبيعي وينبغي مراعاة حركات العين العشوائية.
- وضع وباه صريف من 0.07 دورة في درجة (CPD) في طبلة الدورية وإشراك عناصر جهاز الكمبيوتر لبدء التناوب والتقاط الفيديو (تم استخدام سرعة 12 دورة في الدقيقة لهذه الورقة، ولكن ينبغي بسرعة 8-16 دورة في الدقيقة تعطي نتائج مماثلة).
- مرة واحدة يتم استخلاصها على OKR الأولي من قاعدة صريف، وقفة التناوب لفترة وجيزة، واستبدال صريف صريف مع أصغر (تردد أعلى المكاني).
- كرر هذه العملية حتى لم يعد من الممكن استخلاصها على OKR. إعادة اختبار مع أصغر صريف التي تسبب OKR اتباع نهج درج تعديل ثم كرر باستخدام صريف التي فشلت في استثارة رد فعل للتحقق من فقدان OKR. ويمكن تكرار هذه العملية للتحقق من استجابة حقيقية لأصغر صريف كشفها إذا تغيرت صريف النهائية بالنسبة إلى الحدث الانقراض الأول.
- الحصول على قياسات حدة أحادي عن طريق وضع مطبق بلاستيكية سوداء على المشارب المجاورة للعين المعاكس. كرر الإجراء أعلاه (الخطوات 2،6-2،7).
- الحصول على حدة من العين المعاكس من خلال تغيير موضع مطبق وتكرار الخطوات 2،6-2،7 مرة أخرى.
- لاحظ المسافة كل عين هو من المشارب أثناء إجراء الاختبار باستخدام شريط القياس المرجعية تحت خزان الأسماك بحيث يمكن حساب التدابير حدة دقيقة في الخطوات التالية.
3. حساب البصر
- الحصول على حدة البصر عن طريق حساب وثيقة البرنامج القطري:
حيث هي المسافة من مركز العدسة إلى صريف، وساعة هي مدة دورة واحدة من أصغر صريف الذي لوحظ OKR (الشكل 1C). - لقياس حدة البصر مجتمعة، وبلغ متوسط يتم استخدام قيمة من كل من اليسار والعين اليمنى.
حيث هي المسافة من مركز العدسة إلى صريف، وساعة هي مدة دورة واحدة من أصغر صريف الذي لوحظ OKR (الشكل 1C). Representative Results
OKR الأجهزة الوظيفية
الجهاز OKR كما هو موضح أعلاه ومبين في الشكل 1 وظائف مع الحد الأدنى من الصيانة. كما لوحظ في الخطوة 2.3، شل حركة الذيل أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الأسماك ضبط النفس أثناء التسجيل. يجمد بما فيه الكفاية، والأسماك يمكن أن تبقى في الجهاز OKR لفترات طويلة من الزمن. وبالتالي، ينبغي توخي الحذر خلال الخطوات الأولية الشلل، بحيث المزيد من البيانات التي يمكن جمعها عن كل فرد الأسماك.
قياسات حدة الإبصار
وأثارت OKR مجهر بسهولة في الأسماك البالغة العادية. باتباع الإجراء أعلاه يمكن للمرء أن يجد البراعة البصرية لالزرد العديد من الأعمار (الشكل 2). كان أفضل حدة مكانية مجهر سجلنا 0.74 ثيقة البرنامج القطري. كما لوحظ في الشكل 2، وحدة مجهر يزيد عموما مع التقدم في العمر (ن = 46، P = 0.002 ANOVA باستخدام SPSS V14)، ولكن مستويات قبالةبعد حوالي 12 شهرا من العمر. عندما قارنا قياس حدة البصر في 5 الشهر النوع البري القديم الأسماك العمر المتطابقة الأسماك lrp2/bugeye، وجدنا أن الأسماك lrp2/bugeye قد خفضت بشكل ملحوظ حدة (ع <0.001؛ النوع البري: 0.49 ± 0.05 وثيقة البرنامج القطري، ن = 8؛ lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06، ن = 10، تي الطالب اختبار باستخدام Excel).
قبل الاغلاق العين اليمنى والبصر للعين اليسرى ويمكن تحديد والعكس بالعكس. بالمقارنة مع حدة مجهر، لوحظ الجمع مجهر بالمثل لرؤية الإنسان 17 (الشكل 3). كانت حدة مجهر عموما 5-10٪ أفضل من أي حق (OD) أو اليسار (OS) البراعة تقاس بشكل مستقل. بالنسبة لبعض الأسماك الفردية كان الفارق تحسن 25٪.
الشكل 1. ريكو OKRrding. A) ويتكون الجهاز OKR من 14.5 سم القطر الدورية طبل والمجهر مع إعدادات شدة الضوء قابل للتعديل (300-8،000 لوكس). توفر كاميرا البث المباشر على شاشة المجاورة. يتم حساب طبل الدورية لديه مختلف ضبط السرعة في كل اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة الاتجاهات وتبادل حواجز شبكية التردد المكاني يتم إدراج وإزالة حسب الحاجة. يتم تأمينها ب) الأسماك ووضعها في وسط طبل بالتناوب. C) دورات لكل درجة (CPD) = باستخدام وثيقة البرنامج القطري 
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. يتغير البصر مع تقدم العمر. ويبين الرسم البياني البراعة البصرية مستقلة قياس 5 - 15 أشهر في العمر. يزيد من حدة البصر عادة على مدار السنة الأولى من التنمية ومن ثم ذيول قبالة قليلا في 15 شهرا من العمر (ع = 0.002 ANOVA باستخدام SPSS V14). كل نقطة قد تمثل إما 1 أو عدة الأسماك. يتم قياس حدة الإبصار في دورة / درجة (وثيقة البرنامج القطري). (ن = 46 المجموع؛ 8 في 5 أشهر، 4 في 6 أشهر و 7 في 8 أشهر و 6 في 9 أشهر، و 11 في 10 أشهر، 2 في 11 شهرا؛ 2 في 12 شهرا، و 6 في 15 شهرا). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. مجهر البصر تأثير الجمع. مجهر (OU) البصر بشكل عام أعلى بالمقارنة مع حق (OD) أو اليسار (OS) البراعة العين. في هذه المجموعة خاصة كانت البراعة OS أقل من ذلك بكثير. (* ع = 0.006، N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Discussion
في بعض الأحيان قد الأسماك الهرب في خزان المياه. فمن الأهمية بمكان أن لشل حركة الذيل. بالإضافة إلى ذلك تم العثور على استخدام اسفنجة رقيقة / منشفة على جسم السمكة أيضا أنها لا تقدر بثمن لحفظ الأسماك مع وقف التنفيذ لفترات طويلة من الزمن. كنا قادرين على إبقاء الأسماك يجمد لأكثر من 30 دقيقة باستخدام هذا الإجراء دون الإضرار الأسماك. هذا القدر من الوقت أكثر من كافية للقيام مجهر وكلاهما أحادي البراعة.
عرض صريف يمكن القيام به إما كما هو موضح هنا وفي أماكن أخرى باستخدام أسطوانة دوارة جسديا أو من خلال تقديم العرض الرقمي 18-22. كلا النوعين لها مزايا وعيوب محددة. اخترنا لاستخدام التناوب المادية على حد سواء لأسباب التكلفة والمواصفات الفنية. باستثناء الكمبيوتر ومعدات التصوير، وجهاز OKR الموصوفة هنا يمكن بناء لنحو 150 دولارا.
وOKR هو وسيلة موضوعية لتحديد فيماالسياقية حدة في الزرد الكبار. بينما العديد من المقايسات visuomotor أخرى لرؤية استخدمت في التجارب السابقة وتم إنجازه حتى كهربية الشبكية بنجاح في عيون الزرد الكبار، على الرغم من أنه لم يتم الاستفادة منها بشكل كبير، يفتح OKR الزرد الكبار الباب أمام العديد من الظروف التجريبية الجديدة 22. وقد أثبتت هذه الدراسة فائدة في OKR في قياس التغيرات البصر مع مرور الوقت، وتحديد الفرق البصر في النماذج أمراض العين، والبصر في تحديد أحادي.
ومن المثير للاهتمام، والكبار الرؤية الزرد بالمقارنة مع رؤية الإنسان (20/20) ما يقرب من 20/1، 000 (عندما يتم تحويل وثيقة البرنامج القطري ل0.60 -0.3 logMAR). على الرغم من أن هذا قد يبدو والفقراء، والعيون الزرد هي مناسبة بشكل جيد للغاية لبيئتها. على الرغم من المهمة البصرية من يبحث من خلال 6.5 سم من الماء، وبضعة ملليمترات من البولي، وآخر سنتيمتر من الهواء، والأسماك أداء جيدا جدا! وجدنا أن حدة الزرد الكبار هو أبوالتحرير 70٪ من ما يمكن توقعها نظرا تباعد مبصرة بهم. 23 التباين مع أن الأداء البشري الأمثل ~ 20/12، وهي عبارة عن 80٪ من توقع 20/10، وتقنية OKR لقياس القدرة البصرية في الزرد الكبار مثير للإعجاب 24 ، 25.
إن تقنية قياس العين البراعة البصرية مستقلة تسمح للدراسات التي يمكن أن تعالج عين واحدة والأخرى المستخدمة كمجموعة تحكم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن رصد الأسماك مع التنمية العين غير المتماثلة مثل lrp2/bugeye أو الأسماك التي تطور الساد بشكل أكثر دقة. تجدر الإشارة إلى أن الرعاية يجب أن يؤخذ لقياس بدقة المسافة من العيون إلى المشارب وتسد حقل كامل من الرؤية. هذه التقنية يجب أن تفتح الباب لتدابير أكثر دقة وتحديدا من وظيفة البصرية الزرد.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
التمويل المقدم من قبل الجامعة الغربية للعلوم الصحية كلية البصريات لDJC. شكر خاص لIrisa تام لتصميم الرسوم البيانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
References
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
- Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
- Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
- Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
- Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
- Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
- Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
- Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
- Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
- Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
- Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
- Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
- Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
- Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
- Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).
