Summary
Zebravis hebben een waardevol instrument voor vele onderzoeksgebieden geweest. Hier laten we een methode om een visuele respons opwekken en berekent een functionele gezichtsscherpte in het volwassen zebravissen.
Abstract
Zebravis is een bewezen model voor visie onderzoek, maar veel van de eerdere methoden algemeen gericht op het larvale vis of toonden een simpel antwoord. Meer recent volwassen visuele gedrag in zebravis is geworden van belang, maar methoden om specifieke antwoorden te meten zijn nieuw komen. Om deze kloof te dichten, we gaan naar een methodologie om herhaaldelijk en nauwkeurig gebruik maken van de optokinetische respons (OKR) aan gezichtsscherpte bij volwassen zebravissen meten. Hier laten we zien dat de volwassen zebravissen de gezichtsscherpte kan worden gemeten, met inbegrip van zowel binoculair en monoculair acuities. Omdat de vis niet wordt geschaad tijdens de procedure, kan de gezichtsscherpte worden gemeten en vergeleken over korte of langere tijd. De gezichtsscherpte metingen beschreven kan ook snel waardoor hoge productie en voor meer visuele procedures indien gewenst. Dit type analyse is bevorderlijk voor druginterventie studies of onderzoeken van progressie van de ziekte.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) zijn een goed model om visuele fysiologie studeren vanwege de gelijkenis van hun netvlies naar andere gewervelde dieren, hun korte levenscyclus, en de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde mutanten 1,2. Optokinetische reflex / reactie / nystagmus (OKR) is een combinatie van smooth pursuit en snelle saccade oogbewegingen. Al meer dan 60 jaar clinici hebben aangetoond dat de OKR kan worden voor het objectief meten gezichtsscherpte bij patiënten en is vooral nuttig voor het bepalen zuigeling visuele mogelijkheden 3-5. Het eerste geregistreerde gebruik van OKR bij dieren werd met behulp van duiven in de jaren 1950 6. Meer recent is de OKR uitgegroeid tot een waardevol instrument voor de beoordeling van de visuele functie in larvale zebravis en wordt vaak gebruikt om te screenen op genetische mutanten die een visuele handicap 1,2 hebben. Terwijl de OKR wijd gebruikt om visuele functie in larvale zebravissen, heeft onlangs aangetoond bij volwassen zebravissen 7-10. Een recent artikel van Tappeiner et al.. Maakt gebruik van een commercieel verkrijgbaar optomotor systeem traditioneel gebruikt voor muizen, OptoMotry, om aan te tonen dat de gezichtsscherpte van de volwassen zebravissen blijft vrij constant, ~ 0,59 cycli per graad (CPD), zelfs over verschillende hoeksnelheden 7 .
Hoewel de OKR heeft bewezen zeer nuttig larvale zebravis studies zijn, zijn andere werkwijzen voor het kijkgedrag gebruikt in zebravis volwassenen met wisselend succes. De ontsnapping respons test toonde aan dat albino en robijn zebravis, zowel pigmentatie mutanten, hebben visuele reacties verminderd in fel licht 11,12. Dezelfde escape response test ook succes geïdentificeerd nachtblindheid d mutanten, zij het 2 jaar 13. Echter, de ontsnapping respons test is niet zonder gebreken. Het is moeilijk om toe te schrijven aan een exacte visuele functie en is slechts een grove approximation van visuele veranderingen - wat betekent dat het duurt een grote verandering voor de verandering wordt geïdentificeerd.
Een andere methode die is ontwikkeld voor het identificeren van volwassen zebravissen met een visuele handicap is het optomotor respons (OMR) 11. In deze assay worden vissen in een ronde tank geplaatst met een ondoorzichtige kolom in het midden. Zwarte en witte strepen roteren rond de tank en de vis is belast met het zwemmen in de richting van de streep beweging. Net als de ontsnapping respons, de OMR richt zich op de visuomotorische mogelijkheden van de volwassen zebravissen. Het is echter met succes gebruikt om vis te identificeren met een visuele handicap, zoals de lrp2/bugeye mutanten 14. De lrp2/bugeye zebravis tentoonstelling buphthalmos, verhoogde intra-oculaire druk, verminderde OMR en progressieve retina degeneratie 14,15.
Vele studies hebben de visuomotorische capaciteiten op volwassen zebravissen, die vaak subjectief en kunnen niet quant worden gebruiktitatively geanalyseerd. Via de OKR, kan men de gezichtsscherpte volwassen vis objectiever te bestuderen. Wij hebben onze eigen OKR apparaat, gemodelleerd naar een in eerste instantie gebruikt voor de larven studies 1 gebouwd. In deze studie demonstreren we dat de OKR kan worden gebruikt om zowel monoculaire en binoculaire gezichtsscherpte in zebravis berekenen.
Protocol
Alle veeteelt en experimenten moet worden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de desbetreffende instelling of andere wettelijke vereisten.
1. Zebravis Care
- Handhaaf zebravis onder standaard condities bij 28.5 ° C op een 10 uur donker 14 uur licht cyclus 16.
- Houd volwassen zebravissen op een tank dichtheid van ongeveer 3 vis / L.
2. Optokinetische respons (OKR)
- Maakt het aangepaste OKR opname-apparaat met behulp van een 14,5 cm diameter roterende trommel, een stereo-microscoop met instelbare lichtintensiteit instellingen (300-8,000 lux) en een computer (figuur 1a).
- Bevestig een camera op de microscoop die een live feed zal bieden op een aangrenzend monitor en laat voor het vastleggen en opnemen.
- Controle van de roterende trommel met een microcontroller gekoppeld aan een computer die accommodatum verschillende snelheid en richting selecties.
- Verdoven van de vis in 0,016% tricaïne voor 2-3 minuten en daarna leg de vis op een klein platform met de ogen en de kieuwen opgehangen over de rand.
- Plaats een dunne spons / handdoek over het lichaam van de vis en speld 2-3 stukken schuim, gevormd om de vis op te slaan, over de vissen te houden geïmmobiliseerd. Het beperken van de beweging van de staart van de vis bleek een cruciaal aspect voor immobilisatie zonder letsel voor de vis, en is best bereikt door een vlak stuk schuim. (Figuur 1b)
- Plaats de vis in een cilindrisch met water gevulde tank, dat past in de draaiende trommel van de OKR opnameapparaat. Gebruik magneten op het platform om de vis rechtop, de ogen ongeveer 7,3 cm van de rand van de trommel. De vissen moeten herleven uit de narcose binnen een paar minuten - normale ademhaling wordt hervat en willekeurige oogbewegingen moeten worden nageleefd.
- Plaats een base raspen van 0,07 cycli per graad (CPD) in de draaiende trommel en zet de computer controles rotatie en video-opname beginnen (een snelheid van 12 rpm voor dit document, maar snelheden 8-16 rpm dienen vergelijkbare resultaten oplevert).
- Zodra een eerste OKR wordt opgewekt door de basis raspen, pauzeer de rotatie kort, en vervang het rooster met een kleinere rooster (hogere ruimtelijke frequentie).
- Herhaal dit proces tot een OKR niet meer kan worden opgewekt. Test opnieuw met de kleinste rooster dat een OKR veroorzaakt na een gewijzigde benadering trap en herhaal met het raster die niet tot een reactie op het verlies van de OKR controleren wekken. Dit proces kan worden herhaald om een werkelijke reactie op de kleinste detecteerbare raster controleren of het uiteindelijke raster veranderd ten opzichte van het eerste uitstervengebeurtenis.
- Verkrijgen monoculaire gezichtsscherpte metingen door het plaatsen van een zwarte plastic occluder over de strepen naast het tegenovergestelde oog. Herhaal de bovenstaande procedure (stappen 2,6-2,7).
- Het verkrijgen van de scherpte van het andere oog door de herpositionering van de occluder weer herhalen van stappen 2,6-2,7.
- Let op de afstand elk oog is van de strepen tijdens de testprocedure door de verwijzing meten strip onder het aquarium, zodat nauwkeurige scherpte maatregelen kunnen worden berekend op de volgende stappen.
3. Het berekenen van de gezichtsscherpte
- Het verkrijgen van de gezichtsscherpte door het berekenen van de CPD:
waarbij a de afstand van het centrum van de lens tot het rooster en h de lengte van een cyclus van de kleinste raster waarop OKR waargenomen (Figuur 1c). - Voor gecombineerde gezichtsscherpte metingen, het gemiddelde een waarde van zowel de linker-en rechteroog wordt gebruikt.
waarbij a de afstand van het centrum van de lens tot het rooster en h de lengte van een cyclus van de kleinste raster waarop OKR waargenomen (Figuur 1c). Representative Results
OKR Device functionaliteit
De OKR inrichting zoals hierboven uitgelegd en getoond in figuur 1 werkt met minimaal onderhoud. Zoals opgemerkt in stap 2.3, immobiliseren van de staart is van cruciaal belang voor het houden van de vis tegengehouden tijdens de opname. Voldoende geïmmobiliseerd, kan de vis in het OKR toestel worden gehouden voor langere tijd. Daarom moet ervoor worden gezorgd tijdens de eerste immobilisatie stappen, zodat er meer gegevens kunnen worden verzameld voor elke individuele vis.
Gezichtsscherpte metingen
De verrekijker OKR wordt gemakkelijk opgewekt in normale volwassen vis. Door het volgen van de bovenstaande procedure een visuele acuities voor zebravis van vele eeuwen (figuur 2) kan vinden. De beste verrekijker ruimtelijke gezichtsscherpte we opgenomen was 0.74 BPR. Zoals in figuur 2, de binoculaire gezichtsscherpte algemeen toe met de leeftijd (n = 46, p = 0,002 ANOVA met SPSS v14), maar vlakt afna ongeveer 12 maanden oud. Wanneer we vergeleken de gemeten gezichtsscherpte in 5 maanden oude wild type vis met in leeftijd vergelijkbare lrp2/bugeye vis, vonden we dat de lrp2/bugeye vis aanzienlijk had verminderd gezichtsscherpte (p <0,001; wild-type: 0.49 ± 0.05 BPR; n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; Student's T-test met Excel).
Door afsluiten van het rechteroog de gezichtsscherpte voor het linkeroog vastgesteld is en vice versa. In vergelijking met de verrekijker gezichtsscherpte wordt binoculair sommatie zo ook de humane visie 17 (figuur 3). De binoculaire gezichtsscherpte was over het algemeen 5-10% beter dan zowel rechts (OD) of links (OS) acuities onafhankelijk gemeten. Voor sommige individuele vis het verschil was een verbetering van 25%.
Figuur 1. OKR recording. A) De OKR apparaat bestaat uit een 14,5 cm diameter roterende trommel en microscoop met instelbare lichtintensiteit instellingen (300-8,000 lux). Een camera geeft een live feed op een aangrenzend monitor. De roterende trommel verschillende snelheden in zowel rechtsom als linksom richtingen verwisselbare ruimtelijke frequentie roosters worden ingebracht en verwijderd indien nodig. B) vissen zijn bevestigd en in het midden van de roterende trommel. C) cycli per graad (CPD) wordt berekend gebruik cpd = 
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Gezichtsscherpte verandert met de leeftijd. De grafiek toont onafhankelijke visuele acuities gemeten 5 - 15 maanden in leeftijd. De gezichtsscherpte in het algemeen verhoogt gedurende het eerste jaar van ontwikkeling en vervolgens geleidelijk af een beetje op leeftijd van 15 maanden (p = 0,002 ANOVA met SPSS v14). Elk punt kan zowel vertegenwoordigen 1 of meerdere vissen. Gezichtsscherpte wordt gemeten in cycli / graad (CPD). (N = 46 in totaal, 8 bij 5 maanden, 4 op 6 maanden; 7 op 8 maanden, 6 op 9 maanden, 11 op 10 maanden, 2 op 11 maanden, 2 bij 12 maanden en 6 bij 15 maanden). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Binoculaire gezichtsscherpte sommatie effect. De verrekijker (OU) gezichtsscherpte is in het algemeen hoger in vergelijking met rechts (OD) of links (OS) oog acuities. In deze specifieke groep waren de OS acuities beduidend lager. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Discussion
Bij gelegenheid van de vissen kunnen ontsnappen in het waterreservoir. Het is cruciaal om de staart te immobiliseren. Daarnaast is het gebruik van een dunne spons / handdoek over het lichaam van de vis bleek ook van onschatbare waarde voor het bijhouden van de vis geschorst voor langere tijd te zijn. We konden vis geïmmobiliseerd meer dan 30 minuten te houden met deze procedure zonder nadelige gevolgen voor het vissen. Deze hoeveelheid is meer dan voldoende om de binoculaire en beide monoculaire acuities doen.
De presentatie van het rooster kan worden gedaan als hier en elders beschreven met behulp van een fysiek roterende trommel of door de presentatie van een digitaal display 18-22. Beide typen hebben specifieke voordelen en nadelen. We kozen ervoor om de fysieke rotatie gebruiken zowel vanwege de kosten en technische specificaties. Exclusief de computer-en beeldapparatuur, kan het OKR apparaat hier beschreven worden gebouwd voor rond de $ 150.
De OKR is een objectief middel om te bepalen tenUAL scherpte bij volwassen zebravis. Terwijl verscheidene andere visuomotorische assays voor visie zijn gebruikt in eerdere experimenten en zelfs de electroretinogram met succes toegepast bij volwassen zebravissen ogen, hoewel het niet zwaar is gebruikt, de volwassen zebravissen OKR opent de deur naar vele nieuwe experimentele omstandigheden 22. Deze studie heeft aangetoond nut van de OKR in het meten van de gezichtsscherpte veranderingen in de tijd, het identificeren van de gezichtsscherpte verschil in oogziekte modellen, en bij het bepalen van monoculaire gezichtsscherpte.
Interessant, volwassen zebravissen visie in vergelijking met het menselijke oog (20/20) is ongeveer 20/1, 000 (bij 0,60 CPD wordt omgezet naar -0,3 Logmar). Hoewel dit lijkt misschien slecht, zijn de zebravis ogen zeer geschikt voor zijn omgeving. Ondanks de visuele taak van het kijken door 6,5 cm water, een paar millimeter van polycarbonaat, en een andere centimeter van de lucht, de vissen voeren heel goed! We vonden dat de volwassen zebravissen scherpte is about 70% van wat zou worden voorspeld gezien hun fotogeleider afstand. 23 contrast dat optimale menselijke prestaties ~ 20/12, die ongeveer 80% van de voorspelde 20/10 en OKR techniek voor visuele capaciteit in volwassen zebravissen is indrukwekkend 24 , 25.
De techniek van het meten van onafhankelijke oog visueel acuities zou voor studies waarin een oog kunnen worden behandeld en de andere als een controle gebruikt. Daarnaast kan vissen met asymmetrische eye ontwikkeling, zoals de lrp2/bugeye of vis dat cataract ontwikkelen nauwkeuriger worden gecontroleerd. Opgemerkt zij dat zorg moet worden genomen om nauwkeurig de afstand van de ogen naar de strepen en het volledige gezichtsveld af te sluiten. Deze techniek moet de deur openen naar meer accurate en specifieke maatregelen van de zebravis visuele functie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering verstrekt door de Western University of Health Sciences College van Optometrie aan DJC. Speciale dank aan Irisa Tam voor grafische vormgeving.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
References
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
- Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
- Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
- Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
- Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
- Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
- Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
- Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
- Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
- Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
- Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
- Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
- Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
- Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
- Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).
