Summary
Poisson zèbre ont été un outil précieux pour de nombreux domaines de recherche. Ici, nous démontrons une méthode pour induire une réponse visuelle et calculer une acuité visuelle fonctionnelle chez le poisson zèbre d'un adulte.
Abstract
Poisson zèbre sont un modèle éprouvé pour la recherche de la vision, mais la plupart des méthodes antérieures généralement axés sur les larves de poissons ou démontré une réponse simple. Plus récemment comportement visuel adulte chez le poisson zèbre est devenu d'intérêt, mais les méthodes pour mesurer les réponses spécifiques sont nouveaux à venir. Pour combler cette lacune, nous avons décidé de développer une méthodologie d'utiliser à plusieurs reprises et avec précision la réponse optocinétique (OKR) pour mesurer l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte. Ici, nous montrons que l'acuité visuelle du poisson zèbre adulte peut être mesurée, y compris les deux acuités monoculaires et binoculaires. Parce que le poisson n'est pas blessé au cours de la procédure, l'acuité visuelle peut être mesurée et comparée sur des périodes courtes ou longues. Les mesures de l'acuité visuelle décrites ici peuvent également se faire rapidement pour permettre un débit élevé et des procédures visuelles supplémentaires si vous le souhaitez. Ce type d'analyse est propice à des études ou enquêtes de progression de la maladie d'intervention de la drogue.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) sont un bon modèle pour étudier la physiologie visuelle due à la similitude de leur rétine à d'autres vertébrés, leur cycle de vie court, et la disponibilité de mutants génétiquement modifiés 1,2. Le réflexe optocinétique / réponse / nystagmus (OKR) est une combinaison de la poursuite en douceur et des mouvements oculaires rapides saccades. Pour plus de 60 ans, les cliniciens ont démontré que la Oberkirchenrätin peut être utilisé pour la mesure objective de l'acuité visuelle chez les patients et est particulièrement utile pour déterminer les capacités visuelles infantiles 5.3. La première utilisation de OKR chez les animaux a utilisé des pigeons dans les années 1950 6. Plus récemment, l'OKR est devenu un outil précieux pour l'évaluation de la fonction visuelle chez le poisson zèbre larvaire et est souvent utilisé pour cribler des mutants génétiques qui ont une déficience visuelle 1,2. Alors que l'OKR a été largement utilisé pour déterminer la fonction visuelle chez le poisson zèbre larvaire, il a récemment été démontré en zèbre adultepêcher 7-10. Une étude récente de Tappeiner et al. Utilise un système de optomoteur disponible dans le commerce traditionnellement utilisé pour les souris, OptoMotry, pour démontrer que l'acuité visuelle du poisson zèbre adulte reste assez constant, ~ 0,59 cycles par degré (cpd), même à travers les différentes vitesses angulaires 7 .
Bien que l'OKR s'est avéré être très utile dans les études de poisson zèbre larves, d'autres méthodes pour le comportement visuel ont été utilisés chez les adultes de poisson zèbre avec des degrés variables de succès. Le test de réaction de fuite démontré que albinos et rubis poisson zèbre, les deux mutants de pigmentation, ont réduit des réponses visuelles dans des conditions de luminosité 11,12. Ce même test de réaction de fuite a également réussi à identifier des mutants d nuit de cécité, mais à 2 ans d'âge de 13 ans. Toutefois, le test de réaction de fuite n'est pas sans défauts. Il est difficile d'attribuer à une fonction visuelle exacte et est seulement une approximatio brutn de changements visuels - ce qui signifie qu'il faut un grand changement avant le changement est identifié.
Une autre méthode qui a été développée pour identifier le poisson zèbre adulte ayant une déficience visuelle est la réponse optomoteur (OMR) 11. Dans ce dosage, les poissons sont placés dans un réservoir circulaire d'une colonne opaque au centre. Rayures noires et blanches tournent autour du réservoir et le poisson est chargés de nager dans le sens du mouvement de bande. Comme la réponse de fuite, l'OMR se concentre sur les capacités visuo-motrices du poisson zèbre adulte. Il a cependant été utilisée avec succès pour identifier les poissons ayant une déficience visuelle, telles que les mutants de lrp2/bugeye 14. Les lrp2/bugeye poisson zèbre buphtalmie d'exposition, une pression intraoculaire élevée, diminués OMR, et la dégénérescence progressive de la rétine 14,15.
De nombreuses études ont utilisé les capacités visuo-motrices chez le poisson zèbre adulte, qui sont souvent subjective et ne peuvent pas être dispoitatively analysé. En utilisant l'OKR, on peut étudier l'acuité visuelle des poissons adultes de façon plus objective. Nous avons construit notre propre dispositif OKR, calqué sur celui initialement utilisé pour les études larvaires 1. Dans cette étude, nous démontrons que l'OKR peut être utilisé pour calculer à la fois monoculaire et acuité visuelle binoculaire chez le poisson zèbre.
Protocol
Tout élevage et expériences des animaux devraient être approuvées et menées conformément aux lignes directrices énoncées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'institution concernée ou d'autres dispositions légales.
Une. Soins poisson zèbre
- Maintenir le poisson zèbre dans des conditions standard à 28,5 ° C sur un cycle de 10 h foncé 14 h de lumière 16.
- Gardez le poisson zèbre adulte à une densité de réservoir d'environ 3 poissons / L.
2. Réponse optocinétique (OKR)
- Construire le dispositif d'enregistrement de OKR personnalisé à l'aide d'un diamètre de 14,5 cm tambour rotatif, un microscope stéréo avec réglage de l'intensité lumineuse réglable (300-8,000 lux) et un ordinateur (figure 1a).
- Fixez une caméra pour le microscope qui fournira un flux en direct sur un écran adjacent et permettre la capture d'image et d'enregistrement.
- Commander le tambour rotatif à l'aide d'un microcontrôleur relié à un ordinateur qui AccommoDate différentes sélections de vitesse et de direction.
- Anesthésier les poissons 0,016% tricaine pendant 2-3 min, puis placez le poisson sur une petite plate-forme avec les yeux et les branchies suspendus au-dessus du bord.
- Placez une fine éponge / serviette sur le corps du poisson et la broche 2-3 morceaux de mousse, en forme pour accueillir le poisson, plus de poisson pour garder immobilisé. Limiter le mouvement de la queue du poisson a été trouvé pour être un aspect crucial pour l'immobilisation sans causer de préjudice pour les poissons, et a été mieux réalisé en utilisant un morceau plat de mousse. (Figure 1b)
- Positionner le poisson à l'intérieur d'un réservoir rempli d'eau cylindrique, qui s'adapte à l'intérieur du tambour rotatif de l'appareil d'enregistrement à Oberkirchenrätin. Utiliser des aimants sur la plate-forme pour positionner le poisson en position verticale, avec les yeux d'environ 7,3 cm du bord du tambour. Les poissons devraient relancer de l'anesthésie en quelques minutes - une respiration normale va reprendre et les mouvements oculaires aléatoires doit être observé.
- Placez un base réseau de 0,07 cycles par degré (cpd) dans le tambour rotatif et engager les contrôles informatiques pour commencer la rotation et la capture vidéo (une vitesse de 12 tours par minute a été utilisé pour cet article, mais des vitesses de 8-16 tours devraient donner des résultats similaires).
- Une fois une première OKR est suscité par la base réseau, mettre en pause la rotation brièvement, et de remplacer la grille d'une grille plus petite (fréquence spatiale supérieure).
- Répétez ce processus jusqu'à un OKR ne peut plus être obtenue. Refaites le test avec le plus petit réseau qui a causé une OKR suivant une approche d'escalier modifié et puis répétez l'aide de la grille qui n'a pas réussi à obtenir une réponse pour vérifier la perte de l'OKR. Ce processus peut être répété pour vérifier une vraie réponse à la plus petite grille détectable si la grille finale changé par rapport au premier événement d'extinction.
- Obtenir des mesures d'acuité monoculaire en plaçant un obturateur en plastique noir sur les bandes adjacentes à l'œil opposé. Répétez la procédure ci-dessus (étapes 2.6 à 2.7).
- Obtenir l'acuité de l'œil opposé par le repositionnement de l'obturateur et répéter les étapes à nouveau 02.06 à 02.07.
- Notez la distance de chaque oeil est des rayures pendant la procédure de test en utilisant la bande de mesure de référence sous le réservoir de poissons ainsi que des mesures d'acuité précises peuvent être calculées dans les étapes suivantes.
3. Calcul de l'acuité visuelle
- Obtenir l'acuité visuelle par le calcul de la CPD:
où a est la distance entre le centre de la lentille à réseau de diffraction et h est la longueur d'un cycle du réseau de diffraction la plus petite à laquelle Oberkirchenrätin a été observée (Figure 1c). - Pour les mesures combinées de l'acuité visuelle, la moyenne d'une valeur à la fois de la gauche et l'œil droit est utilisé.
où a est la distance entre le centre de la lentille à réseau de diffraction et h est la longueur d'un cycle du réseau de diffraction la plus petite à laquelle Oberkirchenrätin a été observée (Figure 1c). Representative Results
OKR fonctionnalité Device
Le dispositif de OKR comme expliqué ci-dessus et illustré à la figure 1 fonctionne avec un entretien minimal. Comme indiqué dans l'étape 2.3, immobilisant la queue est essentiel de garder les poissons retenus lors de l'enregistrement. Suffisamment immobilisé, les poissons peuvent être maintenus dans le dispositif de OKR pour des périodes de temps prolongées. Par conséquent, il faut prendre soin pendant les étapes initiales d'immobilisation, de sorte que plus de données peuvent être collectées pour chaque poisson.
Mesures de l'acuité visuelle
Les jumelles OKR est facilement obtenue chez le poisson adulte normal. En suivant la procédure ci-dessus, on peut trouver acuité visuelle pour le poisson zèbre de plusieurs siècles (figure 2). La meilleure acuité binoculaire spatiale nous avons enregistré était de 0,74 cpd. Comme indiqué dans la figure 2, l'acuité binoculaire augmente généralement avec l'âge (n = 46; p = 0,002 analyse de variance en utilisant SPSS v14), mais se stabiliseaprès environ 12 mois d'âge. Lorsque nous avons comparé l'acuité visuelle mesurée dans 5 mois poissons sauvages à lrp2/bugeye poissons appariés pour l'âge, nous avons constaté que le poisson lrp2/bugeye avait considérablement réduit l'acuité (p <0,001; type sauvage: 0,49 ± 0,05 cpd n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; T-test de Student avec Excel).
Par occlusion de l'œil droit de l'acuité visuelle de l'œil gauche peut être déterminée et vice versa. Par rapport à l'acuité binoculaire, sommation binoculaire est observé de manière similaire à la vision humaine 17 (figure 3). L'acuité binoculaire était généralement 5-10% mieux que ce soit à droite (OD) ou gauche (OS) acuités mesurées indépendamment. Pour certains poissons individuels, la différence était une amélioration de 25%.
Figure 1. Reco okrrding. A) Le dispositif de OKR se compose d'un diamètre de 14,5 cm tambour et microscope avec réglage de l'intensité lumineuse réglable (300-8,000 lux) en rotation. Un appareil photo est un flux en direct sur un écran adjacent. Le tambour rotatif dispose de plusieurs réglages de la vitesse dans les deux directions dans le sens horaire et anti-horaire et interchangeables réseaux de fréquences spatiales sont inséré et retiré au besoin. B) Les poissons sont fixé et placé dans le centre du tambour rotatif. C) cycles par degré (cpd) est calculé utilisant = cpd 
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Figure 2. L'acuité visuelle change avec l'âge. Le graphique montre acuité visuelle indépendantes mesurées 5 - 15 mois d'âge. L'acuité visuelle augmente généralement pendant la première année de développement et est dégressive un peu à 15 mois (p = 0,002 ANOVA utilisant SPSS v14). Chaque point peut représenter 1 ou plusieurs poissons. L'acuité visuelle est mesurée en cycles / degré (cpd). (N = un total de 46, 8 à 5 mois; 4 à 6 mois, 7 à 8 mois, 6 à 9 mois, 11 à 10 mois; 2 à 11 mois; 2 à 12 mois et 6 à 15 mois). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Jumelles effet de sommation de l'acuité visuelle. Les jumelles (UO) acuité visuelle est généralement plus élevé par rapport à la droite (OD) ou (OS) acuité de l'œil gauche. Dans ce groupe, notamment les acuités OS étaient significativement plus faibles. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Discussion
À l'occasion, les poissons peuvent s'échapper dans le réservoir d'eau. Il est essentiel pour immobiliser la queue. En outre, l'utilisation d'un mince éponge / serviette sur le corps du poisson a aussi été jugée inestimable pour garder les poissons suspendus pour des périodes de temps prolongées. Nous avons réussi à conserver le poisson immobilisés pendant plus de 30 minutes en utilisant cette procédure sans nuire aux poissons. Ce laps de temps est plus que suffisant pour faire les jumelles et les deux acuités monoculaires.
La présentation de la grille peut se faire soit, comme décrit ici et ailleurs en utilisant un tambour rotatif physiquement ou en présentant un affichage numérique 18 à 22. Les deux types ont des avantages et des inconvénients spécifiques. Nous avons choisi d'utiliser la rotation physique à la fois pour des raisons de coûts et de spécifications techniques. Hors de l'ordinateur et de l'équipement d'imagerie, le dispositif de OKR décrit ici peut être construit pour environ 150 $.
Le OKR est un moyen objectif de déterminer vismanuel acuité chez le poisson zèbre adulte. Bien que plusieurs autres tests visuo-motrices pour la vision ont été utilisés dans les expériences précédentes et même l'électrorétinogramme a été fait avec succès dans les yeux de poisson zèbre adulte, si elle n'a pas été très utilisée, l'OKR de poisson zèbre adulte ouvre la porte à de nombreuses nouvelles conditions expérimentales 22. Cette étude a démontré l'utilité de l'OKR à mesurer les variations de l'acuité visuelle au fil du temps, d'identifier la différence d'acuité visuelle dans les modèles de la maladie de l'oeil, et dans la détermination de l'acuité visuelle monoculaire.
Fait intéressant, le poisson zèbre adulte vision par rapport à la vision humaine (20/20) est d'environ 20/1, 000 (0,60 cpd quand est converti à -0,3 logMAR). Même si cela peut sembler pauvre aux yeux de poisson zèbre sont très bien adaptés à son environnement. Malgré la tâche visuelle de regarder à travers 6,5 cm d'eau, de quelques millimètres de polycarbonate, et un autre centimètre d'air, le poisson effectuer très bien! Nous avons constaté que l'acuité de poisson zèbre adulte est about 70% de ce qui serait prévu compte tenu de leur espacement des photorécepteurs. 23 Voilà qui contraste avec la performance humaine optimale ~ 20/12, ce qui représente environ 80% de la prédite 20/10, et la technique OKR pour mesurer la capacité visuelle chez le poisson zèbre adulte est impressionnant 24 , 25.
La technique de mesure de l'acuité visuelle de l'oeil indépendants permettrait études dans lesquelles un œil pourrait être traitée et l'autre utilisé comme contrôle. En outre, le poisson avec le développement des yeux asymétrique comme le lrp2/bugeye ou poissons qui se développent cataracte pourraient être suivis avec plus de précision. Il convient de noter que les soins doivent être prises pour mesurer avec précision la distance entre les yeux et les rayures et à obstruer le champ de vision complet. Cette technique devrait ouvrir la porte à des mesures plus précises et spécifiques de la fonction visuelle du poisson zèbre.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le financement fourni par l'Université de l'Ouest de sciences de la santé du Collège d'optométrie de DJC. Un merci spécial à l'Irisa Tam pour la conception graphique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
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