Summary
Zebrafish têm sido uma ferramenta valiosa para diversas áreas de pesquisa. Aqui demonstramos um método para induzir uma resposta visual e calcular uma acuidade visual funcional no peixe-zebra adultos.
Abstract
Zebrafish são um modelo comprovado de pesquisa da visão, no entanto muitos dos métodos anteriores, geralmente focados em larvas de peixes ou demonstraram uma resposta simples. Mais recentemente comportamento visual adulto no peixe-zebra tornou-se de interesse, mas os métodos para medir respostas específicas são novos chegando. Para preencher esta lacuna, nos propusemos a desenvolver uma metodologia para repetidamente e precisa utilizar a resposta optocinético (OKR) para medir a acuidade visual em peixe-zebra adulto. Aqui nós mostramos que a acuidade visual do peixe-zebra adulto pode ser medido, incluindo tanto acuidade binocular e monocular. Porque o peixe não seja prejudicado durante o procedimento, a acuidade visual pode ser medida e comparada ao longo de períodos de tempo curtos ou longos. As medidas de acuidade visual descritos aqui também pode ser feito permitindo que rapidamente para alto rendimento e para procedimentos visuais adicionais, se desejar. Este tipo de análise é propício para estudos de intervenção de drogas ou investigações de progressão da doença.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) são um bom modelo para o estudo da fisiologia visual devido à semelhança de sua retina para outros vertebrados, seu ciclo de vida curto, ea disponibilidade de mutantes geneticamente modificados 1,2. O reflexo optocinético / resposta / nistagmo (OKR) é uma combinação de exercício suave e movimentos oculares rápidos sacádicos. Durante mais de 60 anos os clínicos têm demonstrado que a OKR pode ser usado para medir objectivamente acuidade visual nos pacientes e é especialmente útil para a determinação infantis capacidades visuais 3-5. O primeiro registro do uso OKR em animais estava usando pombos na década de 1950 6. Mais recentemente, o OKR tornou-se uma ferramenta valiosa para a avaliação da função visual em zebrafish larval e é muitas vezes usado para triagem de mutantes genéticos que têm uma deficiência visual 1,2. Enquanto o OKR tem sido amplamente utilizada para determinar a função visual em peixes-zebra de larvas, que apenas recentemente foi demonstrada em adultos zebrapescar 7-10. Um artigo recente de Tappeiner et al. Utiliza um sistema optomotor disponível comercialmente tradicionalmente utilizado para ratinhos, OptoMotry, para demonstrar que a acuidade visual do peixe-zebra adultos permanece bastante constante, ~ 0,59 ciclos por grau (cpd), mesmo através de várias velocidades angulares 7 .
Embora o OKR provou ser bastante útil em estudos de peixe-zebra de larvas, outros métodos para o comportamento visual foram usadas em adultos de peixes-zebra com variados graus de sucesso. O ensaio resposta de fuga demonstrou que albino e rubi peixe-zebra, os dois mutantes de pigmentação, reduziram respostas visuais em condições de luz brilhante 11,12. Este ensaio resposta de fuga mesmo também identificou com sucesso cegueira noturna d mutantes, ainda que aos 2 anos de idade 13. No entanto, o ensaio de resposta de fuga não é sem falhas. É difícil atribuir a uma função visual exata e é apenas uma approximatio bruton de mudanças visuais - o que significa que é preciso uma grande mudança antes da mudança é identificado.
Outro método que tem sido desenvolvido para a identificação de peixe-zebra adulto com deficiência visual é a resposta optomotor (OMR) 11. Neste ensaio, os peixes são colocados em um tanque circular com uma coluna opaco no centro. Listras preto e branco girar em torno do tanque e os peixes tem a tarefa de nadar na direção do movimento de distribuição. Como a resposta de fuga, o OMR se concentra nos recursos visuomotoras do peixe-zebra adulto. Todavia, foi utilizado com sucesso para identificar peixes com deficiências visuais, tais como os mutantes lrp2/bugeye 14. Os lrp2/bugeye buphthalmos exibem peixe-zebra, a pressão intra-ocular elevada, diminuiu OMR, e degeneração progressiva da retina 14,15.
Muitos estudos têm utilizado as capacidades visuomotoras em peixe-zebra adulto, que muitas vezes são subjetivos e não podem ser quantitatively analisados. Ao utilizar o OKR, pode-se estudar a acuidade visual de peixes adultos de forma mais objetiva. Nós construímos nosso próprio dispositivo OKR, modelado após um inicialmente usado para estudos de larvas 1. Neste estudo demonstrámos que o OKR pode ser utilizado para calcular tanto monocular e acuidade visual binocular em peixes-zebra.
Protocol
Todos pecuária e experimentos devem ser aprovadas e conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê da respectiva instituição ou outros requisitos legais Institutional Animal Care e Use.
1. Cuidados Zebrafish
- Manter a peixe-zebra, sob condições padrão a 28,5 ° C num ciclo de 10 horas de luz-escuro de 14 h 16.
- Mantenha adulto zebrafish a uma densidade de cerca de 3 tanque de peixes / L.
2. Resposta optocinético (OKR)
- Construir o dispositivo de gravação OKR personalizado usando um aumento de 14,5 cm de diâmetro tambor rotativo, um microscópio estéreo com configurações de intensidade de luz ajustáveis (300-8,000 Lux) e um computador (Figura 1a).
- Anexar uma câmera para o microscópio que irá proporcionar uma transmissão ao vivo para um monitor ao lado e permitir a captação e gravação de imagens.
- Controlar o tambor rotativo utilizando um microcontrolador ligado a um computador que irá acomodarData várias selecções de velocidade e direção.
- Anestesiar os peixes em 0,016% tricaina por 2-3 min e, em seguida, coloque o peixe em uma pequena plataforma com os olhos e guelras suspensos sobre a borda.
- Coloque uma esponja fina / toalha sobre o corpo do peixe e pin 2-3 pedaços de espuma, em forma de acomodar o peixe, o peixe mais para mantê-lo imobilizado. A limitação do movimento da cauda do peixe foi encontrado para ser um aspecto crucial para a imobilização sem causar danos aos peixes, e foi melhor conseguido utilizando uma peça plana de espuma. (Figura 1b)
- Posicionar o peixe dentro de um tanque cheio de água, cilíndrica, que se encaixa no interior do tambor rotativo do dispositivo de gravação OKR. Use imans na plataforma para posicionar o peixe na posição vertical, com os olhos cerca de 7,3 cm da borda do tambor. O peixe deve reavivar da anestesia dentro de alguns minutos - a respiração normal será retomado e movimentos oculares aleatórios devem ser observadas.
- Coloque um baixoe grade de 0,07 ciclos por grau (cpg) no tambor rotativo e envolver os controles de computador para começar a rotação e captura de vídeo (uma velocidade de 12 rpm foi utilizada para este papel, mas velocidades de 8-16 rpm deve dar resultados semelhantes).
- Uma vez que um OKR inicial é provocada pela base ralar, pausar a rotação brevemente, e substituir a grade com uma grade menor (maior freqüência espacial).
- Repita esse processo até que um OKR já não pode ser atingida. Teste novamente com o menor grade que causou uma OKR seguir uma abordagem modificada escada e, em seguida, repetir usando a grade que falhou para extrair uma resposta para verificar a perda da OKR. Este processo pode ser repetido para verificar uma verdadeira resposta à menor grade detectável se a grade definitiva mudado em relação ao primeiro evento de extinção.
- Obter medidas de acuidade monocular, colocando uma prótese de plástico preto sobre as faixas adjacentes ao olho oposto. Repita o procedimento acima (passos 2,6-2,7).
- Obter a acuidade do olho oposto ao reposicionar a prótese e repetindo a 2,6-2,7 passos novamente.
- Note-se a distância de cada olho é das listras durante o procedimento de teste usando a faixa de medição de referência sob o tanque de peixes, de modo que as medidas de acuidade precisas podem ser calculadas nos passos seguintes.
3. Calculando Visual Acuity
- Obter a acuidade visual através do cálculo do CPD:
onde a é a distância a partir do centro da lente, para a grade, e h é o comprimento de um ciclo da menor grelha na qual OKR foi observado (Figura 1c). - Por medidas de acuidade visual combinadas, a média de um valor, tanto do olho esquerdo e direito é usado.
onde a é a distância a partir do centro da lente, para a grade, e h é o comprimento de um ciclo da menor grelha na qual OKR foi observado (Figura 1c). Representative Results
OKR funcionalidade do dispositivo
O dispositivo OKR como explicado acima e mostrado na Figura 1 funciona com um mínimo de manutenção. Como observado na etapa 2.3, imobilizando a cauda é fundamental para manter o peixe contido durante a gravação. Suficientemente imobilizada, o peixe pode ser mantido no dispositivo de OKR por períodos prolongados de tempo. Consequentemente, o cuidado deve ser tomado durante os passos iniciais de imobilização, para que mais dados podem ser coletados para cada peixe.
Medidas de acuidade visual
O binocular OKR é facilmente atingida em peixe adulto normal. Seguindo o procedimento acima descrito pode-se encontrar acuidade visual de peixe-zebra de várias idades (Figura 2). A melhor acuidade espacial binocular registramos foi de 0,74 cpg. Como observado na Figura 2, a acuidade binocular geralmente aumenta com a idade (n = 46, p = 0,002 ANOVA usando SPSS v14), mas os níveis de folgadepois de cerca de 12 meses de idade. Quando comparamos a medida da acuidade visual em cinco meses de idade do tipo selvagem de peixe para pareados por idade lrp2/bugeye peixe, descobrimos que o peixe lrp2/bugeye tinham reduzido significativamente a acuidade (p <0,001; tipo selvagem: 0,49 ± 0,05 cpg; n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; t de Student usando Excel).
Por oclusão do olho direito acuidade visual para o olho esquerdo pode ser determinada e vice-versa. Quando comparado com a acuidade binocular, soma binocular é observado de maneira semelhante à visão humana 17 (Figura 3). A acuidade binocular era geralmente 5-10% melhor do que qualquer direito (OD) ou à esquerda (OS) acuidades medidos de forma independente. Para alguns peixes individuais a diferença foi uma melhoria de 25%.
Figura 1. Reco Okrrding. A) O dispositivo consiste de uma OKR 14,5 centímetros de diâmetro do cilindro e microscópio com ajustes de intensidade de luz ajustável (300-8,000 lux) em rotação. A câmera oferece uma transmissão ao vivo em um monitor adjacente. O tambor rotativo tem várias configurações de velocidade em ambos os sentido horário e anti-horário direções e grades de freqüência espacial intercambiáveis são inseridos e removidos conforme necessário. B) Os peixes são garantidos e colocado no centro do tambor rotativo. C) ciclos por grau (cpg) é calculado usando = CPD 
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Figura 2. A acuidade visual muda com a idade. O gráfico mostra acuidades visuais independentes medidos 5 - 15 meses de idade. A acuidade visual geralmente aumenta ao longo do primeiro ano de desenvolvimento e, em seguida, caudas um pouco aos 15 meses de idade (p = 0,002 ANOVA usando SPSS v14). Cada ponto pode tanto representar um ou vários peixes. A acuidade visual é medida em ciclos / grau (cpg). (N = 46 total, 8 a 5 meses, 4 a 6 meses, 7 a 8 meses, 6 a 9 meses, 11 a 10 meses; 2 a 11 meses, 2 a 12 meses, e de 6 a 15 meses). clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Efeito somatório acuidade visual binocular. O binocular (OU) acuidade visual é geralmente mais elevado em relação ao direito (OD) ou à esquerda (OS) acuidade dos olhos. Neste grupo particular as acuidades OS foram significativamente menores. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Discussion
Na ocasião, o peixe pode escapar para o reservatório de água. É crítico para imobilizar a cauda. Além disso, o uso de uma esponja fina / toalha sobre o corpo do peixe também foi encontrado para ser de valor inestimável para manter os peixes suspensos por períodos prolongados de tempo. Fomos capazes de manter os peixes imobilizados por mais de 30 minutos usando este procedimento, sem prejudicar os peixes. Esta quantidade de tempo é mais do que suficiente para fazer a binocular e ambos acuidade monoculares.
A apresentação da grade pode ser feita de forma, tal como descrito aqui e em qualquer local usando um tambor rotativo ou fisicamente por apresentar um mostrador digital 18-22. Ambos os tipos têm vantagens e desvantagens específicas. Optamos por usar a rotação física tanto por razões de custo e especificações técnicas. Excluindo-se o computador e equipamentos de imagem, o dispositivo OKR descrito aqui pode ser construído por cerca de US $ 150.
O OKR é um meio objetivo de determinar visual acuidade no peixe-zebra adulto. Embora vários outros ensaios visuomotoras para visão têm sido utilizados em experiências anteriores e mesmo o electrorretinograma foi feito com êxito em olhos de peixe-zebra adultos, embora não tenha sido muito utilizada, o peixe-zebra adultos OKR abre a porta para muitas novas condições experimentais 22. Este estudo demonstrou a utilidade do OKR em medir as variações de acuidade visual ao longo do tempo, identificando diferença de acuidade visual em modelos de doenças dos olhos, e para determinar a acuidade visual monocular.
Curiosamente, adulto visão do peixe-zebra, quando comparado com a visão humana (20/20) é de aproximadamente 20/1, 000 (0,60 cpg quando é convertido para -0.3 logMAR). Embora isso possa parecer pobre, os olhos de peixe-zebra são muito bem adequados para o seu ambiente. Apesar da tarefa visual de olhar através de 6,5 centímetros de água, alguns milímetros de policarbonato, e outro centímetro de ar, o peixe executar muito bem! Descobrimos que a acuidade adulto zebrafish é about 70% do que seria previsível dado o seu espaçamento fotorreceptor. 23 Contraste isso com o desempenho humano ideal ~ 20/12, o que é cerca de 80% do previsto 20/10, e da técnica para medir a capacidade OKR visual em peixe-zebra adulto é impressionante 24 , 25.
A técnica de medição da acuidade visual do olho independentes permitiria estudos em que um olho podem ser tratadas e a outra utilizada como um controlo. Além disso, o peixe com o desenvolvimento do olho assimétrico como o lrp2/bugeye ou peixes que desenvolver catarata pode ser monitorado com mais precisão. Deve notar-se que o tratamento tem de ser feita para medir com precisão a distância entre os olhos para as faixas e para obstruir o campo de visão completo. Esta técnica deve abrir a porta para medidas mais precisas e específicas da função visual peixe-zebra.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiamento concedido pela Universidade Ocidental de Ciências da Saúde Faculdade de Optometria para DJC. Um agradecimento especial a Irisa Tam para design gráfico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
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