Summary
El pez cebra ha sido una herramienta valiosa para muchas áreas de investigación. Aquí se demuestra un método para provocar una respuesta visual y calcular una agudeza visual funcional en el pez cebra adultos.
Abstract
El pez cebra es un modelo probado para la investigación de la visión, sin embargo muchos de los métodos anteriores generalmente se centraron en las larvas de peces o demostrado una respuesta simple. Más recientemente el comportamiento visual de adultos en el pez cebra se ha convertido de interés, pero los métodos para medir las respuestas específicas son nuevas llegar. Para colmar esta laguna, nos propusimos desarrollar una metodología para utilizar en varias ocasiones y con precisión la respuesta optocinético (OKR) para medir la agudeza visual en adultos de pez cebra. Aquí nos muestran que la agudeza visual del pez cebra adulto se puede medir, incluyendo tanto las agudezas binocular y monocular. Debido a que el pescado no se daña durante el procedimiento, la agudeza visual puede ser medido y comparado en períodos de tiempo cortos o largos. Las mediciones de agudeza visual descritos aquí también se puede hacer rápidamente para permitir un alto rendimiento y para los procedimientos visuales adicionales si se desea. Este tipo de análisis es propicio para los estudios de intervención de drogas o investigaciones de progresión de la enfermedad.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) son un buen modelo para estudiar la fisiología visual debido a la similitud de su retina a otros vertebrados, su corto ciclo de vida, y la disponibilidad de mutantes alterados genéticamente 1,2. El reflejo optocinético / respuesta / nistagmo (OKR) es una combinación de ejercicio suave y rápidos movimientos oculares sacádicos. Durante más de 60 años los médicos han demostrado que la okr se puede utilizar para medir objetivamente la agudeza visual en los pacientes y es especialmente útil para determinar infantiles capacidades visuales 3-5. El primer uso registrado de OKR en animales utilizaba palomas en la década de 1950 6. Más recientemente, el OKR se ha convertido en una valiosa herramienta para la evaluación de la función visual en larvas de pez cebra y es de uso frecuente para la detección de mutantes genéticos que tienen un 1,2 deficiencia visual. Mientras que el okr ha sido ampliamente utilizado para determinar la función visual en larvas de pez cebra, sólo recientemente se ha demostrado en cebra adultospescar 7-10. Un artículo reciente de Tappeiner et al. Utiliza un sistema optomotor disponible comercialmente utilizada tradicionalmente para los ratones, OptoMotry, para demostrar que la agudeza visual del pez cebra adulto sigue siendo bastante constante, ~ 0,59 ciclos por grado (cpd), incluso a través de diversas velocidades angulares 7 .
Aunque el OKR ha demostrado ser muy útil en estudios de larvas de pez cebra, otros métodos para el comportamiento visual se han utilizado en los adultos de pez cebra con diversos grados de éxito. El ensayo de respuesta de escape demostró que albino y rubí pez cebra, ambos mutantes de pigmentación, han reducido las respuestas visuales en condiciones de luz brillante 11,12. Este mismo ensayo respuesta de escape también ha identificado con éxito ceguera nocturna d mutantes, aunque a los 2 años de edad de 13 años. Sin embargo, el ensayo de respuesta de escape no está exenta de defectos. Es difícil atribuir a una función visual exacta y está a sólo approximatio bruton de los cambios visuales - lo que significa que se necesita un cambio grande antes de que se identifique el cambio.
Otro método que se ha desarrollado para la identificación de pez cebra adulto con discapacidad visual es la respuesta optomotor (OMR) 11. En este ensayo, los peces se colocan en un tanque circular con una columna de opaco en el centro. Rayas blancas y negras giran alrededor del tanque y el pez tiene la tarea de nadar en la dirección del movimiento de la raya. Al igual que la respuesta de escape, la OMR se centra en las capacidades visuomotoras del pez cebra adulto. Sin embargo se ha utilizado con éxito para identificar peces con deficiencias visuales, como los mutantes lrp2/bugeye 14. Los buftalmos exhibición de pez cebra lrp2/bugeye, presión intraocular elevada, disminuyó OMR, y la degeneración retiniana progresiva 14,15.
Muchos estudios han utilizado la capacidad visomotora en adultos de pez cebra, que suelen ser subjetivos y no pueden ser quantitatively analizado. Al utilizar el OKR, se puede estudiar la agudeza visual de los peces adultos de manera más objetiva. Hemos construido nuestro propio dispositivo OKR, siguiendo el modelo que se utiliza inicialmente para estudios larvales 1. En este estudio hemos demostrado que el okr se puede utilizar para calcular tanto monocular y agudeza visual binocular en el pez cebra.
Protocol
Toda la cría de animales y los experimentos deben ser aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices establecidas por el Comité de la respectiva institución u otros requisitos legales Institucional Cuidado de Animales y el uso.
1. Cuidado de pez cebra
- Mantener el pez cebra en condiciones estándar a 28,5 ° C en un ciclo de 10 horas de oscuridad-luz 14 hr 16.
- Mantenga adultos de pez cebra a una densidad tanque de alrededor de 3 peces / L.
2. Respuesta optocinética (OKR)
- Construir el dispositivo de grabación OKR personalizado utilizando un diámetro de 14,5 cm tambor giratorio, un microscopio estéreo con ajustes de intensidad de luz ajustable (300-8,000 lux) y un ordenador (Figura 1a).
- Adjuntar una cámara para el microscopio que proporcionará una transmisión en vivo en un monitor adyacente y permitir la captura de imágenes y grabación.
- Controle el tambor giratorio mediante un microcontrolador conectado a una computadora que acomodarFecha varias selecciones de velocidad y dirección.
- Anestesiar los peces en 0,016% tricaína durante 2-3 minutos y luego coloque el pescado en una pequeña plataforma con los ojos y branquias suspendidos sobre el borde.
- Coloque una esponja / toalla fina sobre el cuerpo de los peces y el pin 2-3 piezas de espuma, en forma de dar cabida a los peces, más de los peces para mantenerlo inmovilizado. Limitar el movimiento de la cola del pescado resultó ser un aspecto crucial para la inmovilización sin causar lesiones a los peces, y se logra mejor utilizando una pieza plana de espuma. (Figura 1b)
- Coloque el pescado dentro de un tanque lleno de agua cilíndrica, que se ajusta en el interior del tambor giratorio del dispositivo de grabación okr. Utilice los imanes en la plataforma para colocar el pescado en posición vertical, con los ojos aproximadamente 7,3 cm del borde del tambor. Los peces deben revivir de la anestesia en pocos minutos - la respiración normal se reanudará y los movimientos oculares aleatorios debe observarse.
- Coloque unas base rejilla de 0,07 ciclos por grado (cpd) en el tambor giratorio y comprometer a los controles de la computadora para comenzar la rotación y la captura de vídeo (una velocidad de 12 rpm se utilizó para este papel, pero las velocidades de 8-16 rpm deben dar resultados similares).
- Una vez que una inicial OKR se provoca por la base de rejilla, una pausa en la rotación brevemente, y vuelva a colocar la rejilla con una rejilla más pequeña (mayor frecuencia espacial).
- Repita este proceso hasta que un OKR ya no puede ser obtenido. Repita la prueba con la rejilla más pequeño que provocó un okr siguiendo un enfoque de escalera modificado y luego repetir el uso de la rejilla que no pudo provocar una respuesta para verificar la pérdida de la okr. Este proceso puede repetirse para verificar una verdadera respuesta a la rejilla más pequeño detectable si la rejilla final distinto con respecto al primer evento de extinción.
- Obtener mediciones de agudeza monocular poniendo un oclusor de plástico negro sobre las franjas adyacentes al ojo contrario. Repita el procedimiento anterior (pasos 2.6 a 2.7).
- Obtener la agudeza del ojo opuesto reposicionando el oclusor y repitiendo el 2.6 a 2.7 pasos de nuevo.
- Tenga en cuenta la distancia de cada ojo es de las rayas durante el procedimiento de prueba mediante el uso de la tira de medición de referencia por debajo del tanque de peces de modo que las medidas de agudeza precisos pueden ser calculados en los pasos siguientes.
3. Cálculo de la agudeza visual
- Obtener la agudeza visual mediante el cálculo del CPD:
donde a es la distancia desde el centro de la lente a la rejilla, y h es la longitud de un ciclo de la rejilla más pequeña a la que okr se observó (Figura 1c). - Para las mediciones de agudeza visual combinados, el promedio se utiliza un valor de la izquierda y el ojo derecho.
donde a es la distancia desde el centro de la lente a la rejilla, y h es la longitud de un ciclo de la rejilla más pequeña a la que okr se observó (Figura 1c). Representative Results
OKR funcionalidad del dispositivo
El dispositivo OKR como se explicó anteriormente y se muestra en la Figura 1 funciona con un mantenimiento mínimo. Como se indicó en el paso 2.3, inmovilizar la cola es fundamental para mantener los peces sujetados durante la grabación. Suficientemente inmovilizado, los peces se pueden mantener en el dispositivo OKR por períodos prolongados de tiempo. En consecuencia, se debe tener cuidado durante las etapas iniciales de inmovilización, para que más datos se pueden obtener de cada pez individual.
Mediciones de agudeza visual
El binocular OKR se provoca fácilmente en el pescado adulto normal. Siguiendo el procedimiento anterior se pueden encontrar las agudezas visuales de pez cebra de muchas edades (Figura 2). La mejor agudeza espacial binocular se registró fue de 0,74 cpd. Como se ha indicado en la Figura 2, la agudeza binocular generalmente aumenta con la edad (n = 46, p = 0,002 ANOVA con el programa SPSS v14), pero los niveles fueradespués de unos 12 meses de edad. Cuando se comparó la agudeza visual se mide en 5 meses de tipo salvaje viejo pez a lrp2/bugeye de la misma edad, se encontró que los peces lrp2/bugeye había reducido considerablemente la agudeza (p <0,001; tipo salvaje: 0.49 ± 0.05 cpd, n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; t de Student utilizando Excel).
Por ocluir el ojo derecho de la agudeza visual para el ojo izquierdo se puede determinar y viceversa. Cuando se compara con la agudeza binocular, la suma binocular se observa de manera similar a la visión humana 17 (Figura 3). La agudeza binocular fue en general un 5-10% mejor que cualquiera de la derecha (OD) oa la izquierda (SO) agudezas medidos de forma independiente. Para algunos ejemplares la diferencia fue una mejora del 25%.
Figura 1. Reco OKRrding. A) El dispositivo OKR consiste en un diámetro de 14,5 cm tambor y microscopio con ajustes de intensidad de luz ajustable (300-8,000 lux) giratorio. Una cámara ofrece una transmisión en vivo en un monitor adyacente. El tambor giratorio tiene varias posiciones de velocidad en ambas direcciones en sentido horario y en sentido antihorario y rejillas de frecuencia espacial intercambiables están insertados y retirados, según sea necesario. B) Los peces están asegurados y se coloca en el centro del tambor giratorio. C) ciclos por grado (cpd) se calcula usando = CPD 
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Figura 2. La agudeza visual cambia con la edad. El gráfico muestra las agudezas visuales independientes de medición 5 - 15 meses de edad. La agudeza visual aumenta generalmente durante todo el primer año de desarrollo y luego colea un poco a los 15 meses de edad (p = 0,002 ANOVA con el programa SPSS v14). Cada punto puede representar ya sea 1 o varios peces. La agudeza visual se mide en ciclos / grado (cpd). (N = 46 total, 8 a los 5 meses, 4 a los 6 meses, 7 a los 8 meses, 6 a los 9 meses; 11 a los 10 meses; 2 a los 11 meses; 2 a los 12 meses, y 6 a los 15 meses). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Efecto sumatorio de la agudeza visual binocular. El binocular (OU) de la agudeza visual es generalmente más alta en comparación con el derecho (OD) o (OS) agudeza del ojo izquierdo. En este grupo en particular las agudezas de SG fueron significativamente más bajos. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Discussion
En ocasiones los peces pueden escapar hacia el tanque de agua. Es crítico para inmovilizar la cola. También se encontró además el uso de una esponja fina / toalla sobre el cuerpo de los peces a ser muy valiosa para mantener a los peces en suspensión durante períodos prolongados de tiempo. Hemos sido capaces de mantener el pescado inmovilizados durante más de 30 minutos de utilizar este procedimiento, sin dañar a los peces. Esta cantidad de tiempo es más que suficiente para hacer el binocular y ambos agudeza monocular.
La presentación de la rejilla se puede hacer ya sea como se describe aquí y en otros lugares utilizando un tambor giratorio físicamente o mediante la presentación de una pantalla digital 18-22. Ambos tipos tienen ventajas y desventajas específicas. Hemos elegido utilizar la rotación física, tanto por razones de costo y las especificaciones técnicas. Excluyendo el ordenador y equipos de imagen, el dispositivo OKR aquí descrito puede ser construida por alrededor de $ 150.
El OKR es un medio objetivo para determinar visual agudeza en el pez cebra adulto. Mientras que varios otros ensayos visomotora para la visión se han utilizado en experimentos anteriores y hasta el electrorretinograma se ha hecho con éxito en los ojos de pez cebra adultos, aunque no ha sido muy utilizado, la OKR adultos de pez cebra se abre la puerta a muchas nuevas condiciones experimentales 22. Este estudio ha demostrado la utilidad de la okr en la medición de cambios de agudeza visual en el tiempo, la identificación de diferencia de la agudeza visual en modelos de enfermedad de ojo, y en la determinación de la agudeza visual monocular.
Curiosamente, el pez cebra adultos visión en comparación con la visión humana (20/20) es de aproximadamente 20/1, 000 (0,60 CPD cuando se convierte a -0,3 logMAR). Aunque esto puede parecer pobre, los ojos de pez cebra son muy adecuadas para su entorno. A pesar de la tarea visual de mirando a través de 6,5 cm de agua, unos pocos milímetros de policarbonato, y otro centímetro de aire, el pescado realizar bastante bien! Se encontró que la agudeza adultos de pez cebra es about 70% de lo que se predijo por su separación de los fotorreceptores. 23 Contraste eso con la actuación humana óptima ~ 20/12, que es aproximadamente el 80% del predicho 20/10, y la técnica OKR para medir la capacidad visual en adultos de pez cebra es impresionante 24 , 25.
La técnica de medición de la agudeza visual del ojo independientes permitiría estudios en los que un ojo podría ser tratado y el otro utilizado como control. Además, el pescado con el desarrollo del ojo asimétrico como el lrp2/bugeye o pescado que se desarrollan las cataratas pueden ser controlados con mayor precisión. Cabe señalar que el cuidado necesita ser tomado para medir con precisión la distancia de los ojos a las rayas y para ocluir el campo completo de visión. Esta técnica debe abrir la puerta a medidas más precisas y específicas de la función visual del pez cebra.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Financiamiento proporcionado por la Universidad Western de Ciencias de la Salud Facultad de Optometría de DJC. Un agradecimiento especial a Irisa Tam para el diseño gráfico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
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