Ultralydsvurdering af Myocardial Microstructure

Summary

Ekkokardiografi er almindeligt anvendt til ikke-invasivt karakterisere og kvantificere ændringer i hjerte struktur og funktion. Vi beskriver en ultralydsbaseret billedalgoritme, der tilbyder et forbedret surrogatmål for myokardiemikrostruktur og kan udføres ved hjælp af open-access billedanalysesoftware.

Abstract

Ekkokardiografi er en bredt tilgængelig billedbehandling modalitet, der er almindeligt anvendt til ikke-invasivt karakterisere og kvantificere ændringer i hjerte struktur og funktion. Ultralydvurderinger af hjertevæv kan omfatte analyser af baggrundsspredersignalintensitet inden for en given region af interesse. Tidligere etablerede teknikker har hovedsageligt været baseret på den integrerede eller gennemsnitlige værdi af backscatter signalintensiteter, som kan være modtagelige for variation fra aliaserede data fra lave billedhastigheder og tidsforsinkelser for algoritmer baseret på cyklisk variation. Heri beskriver vi en ultralydsbaseret billedalgoritme, der strækker sig fra tidligere metoder, kan anvendes på en enkelt billedramme og tegner sig for den fulde fordeling af signalintensitetsværdier afledt af en given myokardieprøve. Når algoritmen anvendes på repræsentative muse- og humane billeddata, skelner den mellem forsøgspersoner med og uden udsættelse for kronisk efterbelastningsresistens. Algoritmen tilbyder en forbedret surrogat måling af myokardie mikrostruktur og kan udføres ved hjælp af open-access billedanalyse software.

Introduction

Ekkokardiografi er en bredt tilgængelig billedbehandling modalitet, der er almindeligt anvendt til ikke-invasivt karakterisere og kvantificere ændringer i hjerte struktur og funktion. Ultralydvurderinger af hjertevæv kan omfatte analyser af backscatter signalintensitet inden for en given region af interesse på et enkelt tidspunkt, såvel som i løbet af hjertecyklussen. Tidligere undersøgelser har antydet, at målinger af sonografisk signalintensitet kan identificere den underliggende tilstedeværelse af myokardiefiber disarray, levedygtig versus ikke-misundelsesværdigt myokardievæv og interstitiel fibrose^1-3. Vi henviser til myokardie 'mikrostruktur' som vævsarkitekturen, der ved hjælp af sonografisk analyse kan karakteriseres ud over lineære målinger af bruttostørrelse og morfologi. Derfor er analyser af sonografisk signalintensitet blevet brugt til at evaluere mikrostrukturelle ændringer af myokardievæv i indstillingen af hypertrofisk og udvidet kardiomyopati^4,5, kronisk koronararteriesygdom^6,7og hypertensive hjertesygdom^8,9. Tidligere etablerede teknikker har imidlertid overvejende været baseret på den integrerede eller gennemsnitlige værdi af backscatter signalintensiteter, som kan være modtagelige for variabilitet fra tilfældig støj⁵, aliaserede data fra lave billedhastigheder¹⁰og tidsforsinkelser for algoritmer baseret på cyklisk variation¹¹.

Heri beskriver vi metoden til at bruge en ultralydsbaseret billedanalysealgoritme, der strækker sig fra tidligere metoder; denne algoritme fokuserer på en enkelt end-diastolisk ramme til billedanalyse og tegner sig for den fulde fordeling af signalintensitetsværdier afledt af en given myokardieprøve. Ved at bruge pericardium som en in-frame reference^12,13, algoritmen reproduceribly kvantificerer variation i sonografiske signal intensitet distributioner og tilbyder en forbedret surrogat måling af myokardie mikrostruktur. I en trinvis protokol beskriver vi metoder til forberedelse af billeder til brug, stikprøver af interesse og behandling af data inden for udvalgte interesseområder. Vi viser også repræsentative resultater fra anvendelse af algoritmen til ekkokardiografiske billeder erhvervet fra mus og mennesker med variabel eksponering for efterbelastningsstress på venstre hjertekammer.

Protocol

1. Forberedelse af billeder til analyser

1. Få billeder i murine eller humant ekkokardiografisk B-tilstand i den parasternale langaksevisning. Juster indstillinger for tidsgevinstkompensation og placering af overførselsfokus for at optimere visualiseringen af LV'en og andre hjertestrukturer i den parasterale visning pr. sædvanlig praksis. Kontroller, at alle billeder er gemt i DICOM-filformat. Standardiserede billedvisninger placerer den inferolaterale venstre ventrikelvæg i bunden af rammen. Rammer skal vise hele venstre ventrikulært myokardie og pericardium. Opløsningen skal være høj nok til at afgrænse den perikardielle grænse, myokardievæggen og den endocardiale kant af venstre hjertekammer. Slet billeder med overskydende dropout eller billedartefakter.
2. Importer en billedfil til analyse i ImageJ-softwareplatformen v1.46 som en DICOM-fil. Konverter filen til en 8-bit billedfil.
3. Rul gennem fortløbende rammer af hjertecyklussen, indtil du når en passende end-diastolisk ramme af høj kvalitet. Du kan også vælge den end-diastoliske ramme i et ekkokardiografisk visningsprogram og derefter eksportere til et .jpg filformat med høj opløsning til brug i ImageJ. Identificer de rammer, der er tættest på end-diastole, ved hjælp af R-bølgen af EKG-sporingen, og identificer derefter den bedste enkeltramme, der fanger LV'en med maksimal intern dimension. Overvej denne enkelt ramme den end-diastoliske ramme.
4. Det foreslås, at brugerne blindes for emneidentitet, når de vælger interesseområder.

2. Stikprøver af investeringsafkast

1. Valg af pericardial reference. Når du vælger den pericardial region af interesse (ROI), har til formål at fange heterogeniteten af pericardial væv. Bemærk, at billedets lysstyrke og kontrast kan justeres for valg af investeringsafkast efter behov uden nogen effekt på analyseresultaterne.
   1. Brug ImageJ's rektangel tegneværktøj, skal du vælge et rektangel med længde tilnærmelse af den midterste tredjedel af den basale inferolaterale pericardial væg.
   2. Tilpas størrelsen på det rektangulære investeringsafkast, så det strækker sig over perikardiets bredde ved hjælp af værktøjet til størrelse af investeringsafkast.
   3. Drej investeringsafkastet, så det ligger inden for pericardialområdet ved hjælp af ImageJ's rotationsværktøj.
   4. Foretag de nødvendige justeringer af hjørnerne af det pericardiale INVESTERINGSAFKAST. Fang en sidste pericardial region af interesse, der ligger inden for den midterste tredjedel af pericardial væggen, og omfatter bredden af pericardial væggen uden at strække sig ind i myokardie eller ekstra-hjerte regioner. Formål at fange den samme relative placering og procentdel af det samlede pericardialområde for alle foranstaltninger, der træffes i en given undersøgelse.
   5. Anvend algoritmen på markeringen via ImageJ-analyseværktøjer (se afsnit 3).
2. Myokardievalg. Endnu en gang, har til formål at fange heterogenitet myokardie væv inden for den midterste tredjedel af den basale inferolateral myokardie væg. Bemærk, at billedets lysstyrke og kontrast kan justeres for valg af investeringsafkast efter behov uden nogen effekt på analyseresultaterne.
   1. Vælg et rektangel, der strækker sig over bredden af den myokardievæg, bortset fra endocardium og epicardium. Sørg for, at den myokardievalg ligger ved siden af den perikardielle udvælgelse og i samme theta vinkel. Medtag ikke områder af papillær muskel inden for udvælgelsesområdet.
   2. Roter myokardie ROI sådan, at det ligger parallelt med den pericardial udvælgelse.
   3. Foretag de nødvendige justeringer af hjørnerne af det myokardie-investeringsafkast. Isoler en endelig myokardieregion af interesse, der ligger inden for den midterste tredjedel af myokardievæggen, og indfanger bredden af væggen uden at strække sig ind i de perikardielle eller intraluminale regioner.
   4. Anvend algoritmen på markeringen via en ImageJ-makro.

3. Dataanalyse og -behandling

1. Installer makroen ImageJ med navnet "getHistogramValues.txt".
2. Brug imageJ-analyseværktøjet til at få vist fordelingen af signalintensitetsværdier i investeringsafkastet (udfør dette trin for det pericardielle valg og for myokardievalget).
3. Brug imageJ-makroen til at indspille disse værdier for signaltæthed for investeringsafkastet (udfør dette trin for den pericardielle markering og for det myokardievalg).
   1. Tildel en intensitetsværdi fra 0 (mørkeste) til 255 (lyseste) enheder til hver pixel i markeringen.
   2. Arranger intensitetsværdierne hierarkisk i rækkefølge efter stigende intensitet for at producere en fordeling af signalintensiteten.
   3. Vælg og rapporter følgende fraktilværdier for fordelingen:^{20 th} percentil,^{50 th} percentil (median) og^{80 th} percentil.
4. Normalisere myokardieintensiteter ved hjælp af den perikardielle reference.
   1. Normaliser ved at dividere intensitetsværdierne for myokardie fraktil med de tilsvarende pericardial fraktilværdier for intensitet¹²eller ved at trække intensitetens myokardie fra intensitetens perikardielle fraktilværdi på intensitet¹³.
   2. Rapportværdier for de fire analytiske metoder: normaliserede myokardie-til-pericardialværdier for de 20^th percentil, 50^th percentil (median) og 80^th percentilværdier.

4. Kvantificering af konjunkturvariation

1. Anvend algoritmen på myokardievalg gennem fortløbende rammer af DICOM-filen, der bevæger sig gennem hjertecyklussen. Sammenlign forskelle i intensitetsfordelinger mellem rammer med fokus på end-systoliske og end-diastoliske rammer.
   Alle de billedanalyser, der er beskrevet ovenfor, udføres offline på ikke-invasive ekkokardiografiske billeder, der tidligere er erhvervet og digitalt gemt i DICOM-format. Alle undersøgelsesprotokoller blev godkendt af Brigham and Women's institutionelle review board og Harvard Medical Area stående Institutional Animal Care and Use Committee.

Representative Results

Signalintensitetsanalyse udføres i 4 hovedtrin (Figur 1), herunder: 1) billedvalg og -formatering, 2) prøvetagning af ROI og referenceområder, 3) algoritmeapplikation og 4) behandling af endelige værdier for at give myokardie-til-pericardial intensitetsforhold. Udvælgelsen og størrelsen af investeringsafkastet standardiseres for at begrænse interbruger- og intrabrugervariationen (figur 2). Placeringen af hvert investeringsafkast er også standardiseret med hensyn til hvert emnes anatomiske strukturer for at begrænse intersubject samt intrasubject variation.

Som et mål for myokardietæthed forventes algoritmen at afsløre ændringer i signalintensiteten gennem hele hjertecyklussen, svarende til den forventede stigning i myokardietætheden i systole sammenlignet med diastole. Som vist i figur 3fremhæver højere fraktilværdier af signalintensitet cyklisk variation hos mus med og uden 7 ugers eksponering for efterlastmodstand(dvs. en mus, der gennemgik stigende aortasnævring sammenlignet med en køretøjskontrolmus, der gennemgik en falsk operation).

Fra analyse af en enkelt end-diastolisk ramme (Figur 4) bemærkes der også betydelige forskelle for både mus og mennesker, der udsættes for kronisk efterbelastningsstress (tilfælde) sammenlignet med deres repræsentative modstykker (kontroller). Både signalintensitetens rækkevidde og størrelse varierer mellem tilfælde og kontroller. Som det ses i analyser af cyklisk variabilitet, tyder 80^th sammenlignet med^{50 th} percentilværdier inden for hver signalintensitetsfordeling på en større relativ forskel i signalintensitet mellem tilfælde og kontroller.

Den algoritme, der præsenteres heri, giver output i form af myokardie-til-pericardialt forhold mellem signalintensitet, hvor de pericardielle værdier tjener som reference i rammen (Figur 5). Forholdet mellem myokardie og perikardial signalintensitet blev bestemt på grundlag af en enkeltrammeanalyse af billeder fra repræsentative kontroller og tilfælde af efterbelastningsstress. I overensstemmelse med ovenstående resultater giver myokardie-til-pericardial-forholdet på 80^th percentil signalintensitetsværdier den største evne til at skelne mellem kontroller og tilfælde. Forventede forskelle i myokardie mikrostruktur, baseret på vores billede analyseresultater, var i overensstemmelse med resultaterne fra myokardie væv histologi i kontrol og tilfælde mus på 7 uger efter fingeret eller aorta-banding kirurgi, henholdsvis (Figur 6).

Figur 1. Arbejdsproces for et enkelt billede. Processen omfatter fire hovedtrin, der kan gentages, når man sammenligner emner, eller når man kvantificerer cykliske variabilitet. Klik her for at se større billede.

Figur 2. Prøvetagningsteknik for interesseområder. Billedanalysealgoritmen er standardiseret til anvendelse i mus (A) og hos mennesker (B). Myokardie og pericardial valg til henholdsvis repræsentative muse- og menneskelige billeder vises. Klik her for at se større billede.

Figur 3. Variation af sonografisk signalintensitet gennem hele hjertecyklussen. Algoritmen blev anvendt på en myokardie region af interesse over på hinanden følgende rammer af DICOM billeder erhvervet fra en repræsentativ kontrol mus (A) og en aorta-banded mus (B). Billedhastigheden var 212 for begge billeder. For disse billeder blev cyklisk variabilitet vurderet ved hjælp af 3 cutpoints: 20^th percentil (diamant), 50^th percentil (kvadrat) og 80^th percentil (trekant). Den relative cykliske variabilitet er højere for de^{80 th} fraktilværdier end for de lavere cutpoint-værdier. Klik her for at se større billede.

Figur 4. Signalintensitetsfordelinger vises fra enkeltrammeanalyse af repræsentative muse- og menneskelige billeder. Histogrammerne viser fordelinger af signalintensiteten afledt af myokardie af en kontrolmus 7 uger efter en falsk operation (A), en aortabåndet mus 7 uger efter operationen (B), et normotensivt menneske (C) og et hypertensive menneske (D). Blå lodrette linjer angiver 20^th fraktil,^{50 th} fraktil, og 80^th percentil værdier. Fordelingen af signalintensiteten er højre-forskydet, og er større inden for rækkevidde, for de forsøgspersoner med kronisk efterbelastning stress(dvs. aorta-banded i forhold til kontrol mus, og hypertensive i forhold til normotensive menneske). Klik her for at se større billede.

Figur 5. Repræsentative data produceret af billedanalysealgoritmen. (A)viser data fra en sham-opereret (kontrol) i forhold til aorta-banded (sag) mus på 7 uger. (B) viser data fra et menneske med normalt blodtryk (kontrol) sammenlignet med et menneske med kronisk hypertension (sag). Det myokardie-til-pericardial signalintensitetsforhold blev bestemt ved hjælp af 3 analytiske metoder inden for algoritmen: forholdet mellem^{20 th} percentilværdier; forholdet mellem^{50 th} fraktilværdier; og forholdet mellem^{80 th} fraktilværdier. Den største forskel mellem kontroller og tilfælde påvises ved at bruge forholdet mellem signalintensitetens^80. Klik her for at se større billede.

Figur 6. Forskelle i myokardievæv histologi mellem mus med og uden udsættelse for efterbelastningsstress. Repræsentant Masson's trichrome farvede dele af venstre hjertekammer er vist for en mus, der gennemgik fingeret kirurgi(A:kontrol) og en mus, der gennemgik aorta banding (B: sag) på 7 uger efter operationen. Afsnit viser tilstedeværelsen af betydelig kollagenaflejring og interstitiel fibrose i sagen sammenlignet med kontrollen. Skalastænger repræsenterer 50 μm. Klik her for at se større billede.

Discussion

Vi beskriver protokollen for en billedanalysealgoritme, der kvantificerer sonografisk signalintensitetsfordeling og til gengæld tilbyder et surrogatmål for myokardiemikrostruktur. Standardiserede funktioner i protokollen, herunder udvælgelse, størrelse og placering af ROI og referenceområdet, tjener til at minimere bruger- og emnebaseret variation. Vi viser, at når algoritmen anvendes på end-diastoliske ekkokardiografiske billeder med en enkelt ramme, kan den passende skelne mellem normalt myokardiium versus myokardiium, der udsættes for efterbelastningsstress.

Protokollen beskriver, hvordan algoritmen kan anvendes ved hjælp af open source ImageJ-softwarepakken. I dette billedanalysemiljø kan algoritmen bruges til at producere data om fordelingen af signalintensitetsværdier fra en given myokardievævsprøve. De resulterende signalintensitetsfordelinger kan vises i form af histogrammer. Histogrammer af intensitetsværdier inden for myokardievalg viser, at syge myokardievæv viser et rigtigt skift i distributionen og et større værdiområde sammenlignet med ikke-udvisket myokardie. Dette mønster ses, når algoritmen anvendes på både menneskelige og murin ekkokardiografiske billeder.

Variabilitet i signalintensiteten over hjertecyklussen observeres for at svare til fysiologiske ændringer i myokardietætheden. En analytisk metode, der konsekvent skelner mellem tæthedsændringer gennem hele hjertecyklussen, menes at være følsom over for forskelle i myokardietæthed, der opstår som reaktion på patologiske processer^1,6. Faktisk observeres cyklisk variation ved anvendelse af algoritmen til fortløbende rammer inden for murinklykardiogrammer. Der observeres en større variation i intensiteten i forhold til hjertecyklussen for billedintensitetsværdier ved højere sammenlignet med lavere percentiler inden for den samlede signalintensitetsfordeling.

Når algoritmen anvendes på repræsentative prøver af ekkokardiografiske billeder erhvervet fra forsøgspersoner med og uden eksponering for efterlastresistens, observeres myokardie-til-pericardial ratio-tæthed ved udvalgte fraktilværdier for at være særlig effektiv til at skelne mellem emner sammenlignet med uden eksponering for kronisk efterbelastningsresistens. Dette fund observeres i analyser af repræsentative musedata og humane data. Forhøjede myokardietætheder forventes at blive set i myokardievævet hos forsøgspersoner, der udsættes for kronisk efterbelastningsstress, da en sådan stress er kendt for at fremme interstitiel kollagenaflejring og udviklingen af myokardiefibrose¹⁴. Måling af myokardievævsændringer over tid kan bruges til at give en bedre forståelse af vævsresponsen på langvarig stress og sygdomsprogression. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, om variationer i signalintensiteten korrelerer med histologiske ændringer over tid samt med stigende sværhedsgrad af en given sygdomsphoenotype.

Billedanalysealgoritmen har begrænset anvendelighed på billeder med artefakter, der ville forstyrre ROI og / eller referencevalg, ufuldstændig visualisering af endocardialgrænserne eller generelt dårlig kvalitet. Algoritmen kan muligvis ikke sammenligne myokardie- og pericardielle interesseområder nøjagtigt, når fraktilværdier viser et ikke-lineært mønster ved gråtonekortlægning, eller når der anvendes et utilstrækkeligt dynamisk område. Selv om sådanne tilfælde forventes at være sjældne inden for 10^th til 90^th percentil værdier signalintensitet i de fleste fænotyper, foreløbig vurdering af backscatter linearitet og dynamikområde kan være berettiget til at studere nye fænotyper af interesse og / eller analysere billeder erhvervet ved hjælp af ukonventionelle ultralyd teknikker. Algoritmen er også begrænset af manglende automatisering af ROI og referenceprøveudvælgelsesprocessen. Derudover har algoritmen begrænset kapacitet til brug i krydssammenligninger af billeder, der er taget ved hjælp af markant forskellige ekkokardiografiske anskaffelsesparametre. I den aktuelle rapport blev billeder i mus erhvervet ved hjælp af en 18-38 MHz transducer ved billedhastigheder fra 225-247 fps; billeder hos mennesker blev erhvervet ved hjælp af en 1-5 MHz transducer ved billedhastigheder fra 34-54 fps. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme mulige protokolrevisioner, der kan være nødvendige for billeder, der er erhvervet ved hjælp af forskelligt udstyr og ved billedhastigheder, der er markante ud over de ovennævnte rapporterede intervaller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ v 1.46	NIH (Bethesda, MD)		open access software
Power ShowCase	Trillium Technology (Ann Arbor, MI)		commercial software