Summary
L’échocardiographie est couramment utilisée pour caractériser et quantifier de manière non invasive les changements de la structure et de la fonction cardiaques. Nous décrivons un algorithme ultrason-basé de formation image qui offre une mesure de substitution augmentée de la microstructure myocardique et peut être exécuté utilisant le logiciel d’analyse d’image en libre accès.
Abstract
L’échocardiographie est une modalité largement accessible de formation image qui est généralement employée pour caractériser et quantifier non envahissantement des changements de structure et de fonction cardiaques. Les évaluations ultrasoniques du tissu cardiaque peuvent inclure des analyses de l’intensité du signal de rétrodiffusion dans une région d’intérêt donnée. Les techniques précédemment établies se sont appuyées principalement sur la valeur intégrée ou moyenne des intensités de signal de rétrodiffusion, qui peuvent être sensibles à la variabilité des données aliasées à partir de faibles fréquences d’images et de retards de temps pour les algorithmes basés sur la variation cyclique. Ci-dessus, nous décrivons un algorithme ultrason-basé d’imagerie qui s’étend des méthodes précédentes, peut être appliqué à une trame d’image simple et tient compte de la distribution complète des valeurs d’intensité de signal dérivées d’un échantillon myocardique donné. Lorsqu’il est appliqué à des données d’imagerie représentatives de souris et d’humains, l’algorithme fait la distinction entre les sujets avec et sans exposition à une résistance chronique après charge. L’algorithme offre une mesure de substitution améliorée de la microstructure myocardique et peut être effectué à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image en libre accès.
Introduction
L’échocardiographie est une modalité largement accessible de formation image qui est généralement employée pour caractériser et quantifier non envahissantement des changements de structure et de fonction cardiaques. Les évaluations par ultrasons du tissu cardiaque peuvent inclure des analyses de l’intensité du signal de rétrodiffusion dans une région d’intérêt donnée à un seul moment dans le temps, ainsi qu’au cours du cycle cardiaque. Des études antérieures ont suggéré que les mesures de l’intensité sonore du signal puissent identifier la présence sous-jacente du désarroi myocardique de fibres, viable contre le tissu myocardique non viable, et de la fibrose interstitielle1-3. Nous nous référons à la « microstructure » myocardique comme l’architecture tissulaire qui peut être caractérisée, utilisant l’analyse échographique, au-delà des mesures linéaires de la taille brute et de la morphologie. En conséquence, des analyses de l’intensité du signal échographique ont été utilisées pour évaluer les altérations microstructurales du tissu myocardique dans le cadre de la cardiomyopathie hypertrophique et dilaté4,5,de la coronaropathie chronique6,7et de la cardiopathie hypertensive8,9. Cependant, les techniques précédemment établies se sont principalement appuyées sur la valeur intégrée ou moyenne des intensités de signal de rétrodiffusion, qui peuvent être sensibles à la variabilité du bruit aléatoire5,des données aliasées à partir de faibles fréquences d’images10et des délais pour les algorithmes basés sur la variation cyclique11.
Ici, nous décrivons la méthode d’utilisation d’un algorithme d’analyse d’image basé sur ultrasons qui s’étend des méthodes précédentes; cet algorithme se concentre sur une seule trame diastolique finale pour l’analyse d’image et tient compte de la distribution complète des valeurs d’intensité du signal dérivées d’un échantillon myocardique donné. En utilisant le péricarde comme référence dans le cadre12,13,l’algorithme quantifie de manière reproductible la variation des distributions d’intensité du signal échographique et offre une mesure de substitution améliorée de la microstructure myocardique. Dans un protocole étape par étape, nous décrivons les méthodes de préparation des images à utiliser, d’échantillonnage des régions d’intérêt et de traitement des données dans des régions d’intérêt sélectionnées. Nous montrons également des résultats représentatifs de l’application de l’algorithme à des images échocardiographiques acquises auprès de souris et d’humains avec une exposition variable au stress après charge sur le ventricule gauche.
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Protocol
1. Préparation des images pour les analyses
- Obtenez des images murines ou humaines échocardiographiques en mode B dans la vue parasternal à long axe. Ajustez les paramètres de compensation de gain de temps et le placement de la mise au point de transmission pour optimiser la visualisation du V et d’autres structures cardiaques dans la vue parasternal, par pratique habituelle. Assurez-vous que toutes les images sont enregistrées au format de fichier DICOM. Les vues d’image standardisées placent la paroi ventriculaire gauche inférolatérale à la base du cadre. Les cadres doivent afficher l’intégralité du myocarde ventriculaire gauche et du péricarde. La résolution doit être assez haute pour délimiter la frontière péricardique, le mur myocardique, et la frontière endocardiaque du ventricule gauche. Ignorez les images avec un excès d’abandon ou d’artefacts d’image.
- Importez un fichier image pour analyse dans la plate-forme logicielle ImageJ v1.46 en tant que fichier DICOM. Convertissez le fichier en fichier image 8 bits.
- Faites défiler les trames consécutives du cycle cardiaque jusqu’à atteindre un cadre fin-diastolique de qualité appropriée. Vous pouvez également sélectionner le cadre diastolique de fin dans un programme de visualisation échocardiographique, puis l’exporter vers un format de fichier .jpg haute résolution pour une utilisation dans ImageJ. Identifiez les trames les plus proches de la diastole d’extrémité utilisant l’onde R du tracé d’ECG, et puis identifiez la meilleure trame simple qui capture le LV avec la dimension interne maximale. Considérez cette image unique comme la trame diastolique de fin.
- Il est suggéré que les utilisateurs soient aveuglés par l’identité du sujet lors de la sélection des régions d’intérêt.
2. Échantillonnage du retour sur investissement
- Sélection de référence péricardique. Lors de la sélection de la région péricardique d’intérêt (ROI), visez à capturer l’hétérogénéité du tissu péricardique. Notez que la luminosité et le contraste de l’image peuvent être ajustés pour la sélection du retour sur investissement, si nécessaire, sans aucun effet sur les résultats d’analyse.
- À l’aide de l’outil de dessin rectangle d’ImageJ, sélectionnez un rectangle dont la longueur se rapproche du tiers central de la paroi péricardique inferolatérale basale.
- Redimensionnez le retour sur investissement rectangulaire pour couvrir la largeur du péricarde à l’aide de l’outil de dimensionnement du retour sur investissement.
- Faites pivoter le roi pour qu’il se trouve dans la région péricardique à l’aide de l’outil de rotation d’ImageJ.
- Apportez les ajustements nécessaires aux coins du roi péricardique. Capturez une région péricardique finale d’intérêt qui se trouve dans le tiers moyen de la paroi péricardique et comprend la largeur de la paroi péricardique sans s’étendre dans les régions myocardiques ou extra-cardiaques. Viser à saisir le même emplacement relatif et le même pourcentage de la superficie péricardique totale pour toutes les mesures prises dans une étude donnée.
- Appliquez l’algorithme à la sélection via les outils d’analyse ImageJ (voir section 3).
- Sélection myocardique. Encore une fois, visez à capturer l’hétérogénéité du tissu myocardique dans le tiers moyen de la paroi myocardique inferolatérale basale. Notez que la luminosité et le contraste de l’image peuvent être ajustés pour la sélection du retour sur investissement, si nécessaire, sans aucun effet sur les résultats d’analyse.
- Sélectionnez un rectangle qui s’étend sur la largeur de la paroi myocardique, à l’exclusion de l’endocarde et de l’épicarde. Assurez-vous que la sélection myocardique se trouve à côté de la sélection péricardique et au même angle thêta. N’incluez pas de zones de muscle papillaire dans la zone de sélection.
- Faites pivoter le roi myocardique de telle sorte qu’il soit parallèle à la sélection péricardique.
- Apportez les ajustements nécessaires aux coins du roi myocardique. Isoler une région myocardique finale d’intérêt qui se trouve dans le tiers moyen de la paroi myocardique, et capture la largeur de la paroi sans s’étendre dans les régions péricardiques ou intraluminales.
- Appliquez l’algorithme à la sélection via une macro ImageJ.
3. Analyse et traitement des données
- Installez la macro ImageJ appelée « getHistogramValues .txt ».
- Utilisez l’outil d’analyse d’histogramme ImageJ pour prévisualiser la distribution des valeurs d’intensité du signal dans le ROI (effectuez cette étape pour la sélection péricardique et pour la sélection myocardique).
- Utilisez la macro ImageJ pour enregistrer ces valeurs de densité de signal pour le ROI (effectuez cette étape pour la sélection péricardique et pour la sélection myocardique).
- Attribuez une valeur d’intensité comprise entre 0 (le plus foncé) et 255 (le plus brillant) unités à chaque pixel de la sélection.
- Disposez les valeurs d’intensité hiérarchiquement, par ordre d’intensité croissante, pour produire une distribution de l’intensité du signal.
- Sélectionnez et indiquez les valeurs de centile suivantes pour la distribution :20 e centile,50 e centile (médiane) et 80e centile.
- Normaliser les intensités myocardiques en utilisant la référence péricardique.
- Normaliser en divisant les valeurs centiles myocardiques de l’intensité par les valeurs centiles péricardiales correspondantes de l’intensité12,ou en soustrayant la valeur centile myocardique de l’intensité de la valeur centile péricardique de l’intensité13.
- Indiquez les valeurs pour les quatre méthodes analytiques : valeurs myocardiques à péricardiques normalisées pour les valeurs du20 e centile, du50 e centile (médiane) et du80 e centile.
4. Quantification de la variabilité cyclique
- Appliquez l’algorithme aux sélections myocardiques à travers des images consécutives du fichier DICOM, en se déplaçant dans le cycle cardiaque. Comparez les différences de distribution d’intensité entre les images, en accordant une attention particulière aux images systoliques et diastoliques finales.
Toutes les analyses d’images décrites ci-dessus sont effectuées hors ligne sur des images échocardiographiques non invasives précédemment acquises et stockées numériquement au format DICOM. Tous les protocoles d’étude ont été approuvés par le brigham and women’s institutional review board et le Harvard Medical Area standing Institutional Animal Care and Use Committee.
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Representative Results
L’analyse de l’intensité du signal est effectuée en 4 étapes principales(Figure 1),y compris: 1) la sélection et le formatage de l’image, 2) le retour sur investissement et les zones de référence de l’échantillonnage, 3) l’application de l’algorithme et 4) le traitement des valeurs finales pour produire des rapports d’intensité myocardique / péricardique. La sélection et la taille du retour sur investissement sont normalisées pour limiter la variabilité inter-utilisateurs et intra-utilisateur (Figure 2). Le positionnement de chaque ROI est également normalisé par rapport aux structures anatomiques de chaque sujet pour limiter la variabilité intersubjecte et intrasubjecte.
En tant que mesure de la densité myocardique, l’algorithme devrait révéler des changements dans l’intensité du signal tout au long du cycle cardiaque, correspondant à l’augmentation prévue de la densité myocardique dans la systole par rapport à la diastole. Comme le montre la figure 3,des valeurs centiles plus élevées de l’intensité du signal accentuent la variabilité cyclique chez les souris avec et sans 7 semaines d’exposition à la résistance après charge(c.-à-d. une souris qui a subi une constriction aortique ascendante par rapport à une souris témoin de véhicule qui a subi une chirurgie simulée).
L’analyse d’un seul cadre diastolique final(figure 4)a également permis de noter des différences significatives pour les souris et les sujets humains exposés à un stress chronique après charge (cas) par rapport à leurs homologues représentatifs (témoins). La plage et l’ampleur de l’intensité du signal diffèrent d’un cas à l’autre et d’un contrôle à l’autre. Comme on le voit dans les analyses de la variabilité cyclique, 80e par rapport aux valeurs du 50e centile dans chaque distribution de l’intensité du signal suggèrent une plus grande différence relative dans l’intensité du signal entre les cas et les témoins.
L’algorithme présenté ici fournit une sortie sous la forme de rapports myocardiques/péricardiques d’intensité du signal, où les valeurs péricardiques servent de référent dans la trame(Figure 5). Le rapport myocardique-à-péricardique d’intensité de signal a été déterminé basé sur l’analyse de simple-trame des images acquises des commandes représentatives et des cas de l’effort d’afterload. Concordant avec les résultats ci-dessus, le rapport myocardique-à-péricardique des valeurs d’intensité de signal de 80e centile offre la plus grande capacité de différencier entre les contrôles et les cas. Les différences attendues dans la microstructure myocardique, d’après les résultats de notre analyse d’images, étaient compatibles avec les résultats de l’histologie des tissus myocardiques chez les souris témoins et les souris cas 7 semaines suivant une chirurgie par feinte ou par bande aortique, respectivement(figure 6).
Figure 1. Processus de flux de travail pour une image individuelle. Le processus comprend quatre étapes principales qui peuvent être répétées lors de la comparaison des sujets ou lors de la quantification de la variabilité cyclique.
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Figure 2. Technique d’échantillonnage de la région d’intérêt (ROI). L’algorithme d’analyse d’image est normalisé pour une application chez la souris(A)et chez l’homme(B). Des sélections myocardiques et péricardiques pour des images représentatives de souris et d’homme, respectivement, sont montrées.
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Figure 3. Variation de l’intensité du signal échographique tout au long du cycle cardiaque. L’algorithme a été appliqué à une région myocardique d’intérêt sur des images consécutives de DICOM acquises à partir d’une souris témoin représentative(A)et d’une souris à bandes aortiques(B). La fréquence d’images était de 212 pour les deux images. Pour ces images, la variabilité cyclique a été évaluée à l’aide de 3 points de coupe :20 e centile (losange),50 e centile (carré) et 80e centile (triangle). La variabilité cyclique relative est plus élevée pour les valeurs du80 e centile que pour les valeurs de point de coupure inférieures. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 4. Les distributions d’intensité du signal sont indiquées à partir de l’analyse à trame unique d’images représentatives de souris et d’humains. Les histogrammes montrent des distributions de l’intensité du signal dérivées du myocarde d’une souris témoin à 7 semaines après la chirurgie simulée(A),une souris à bandes aortiques à 7 semaines après la chirurgie(B),un humain normot lumineux(C)et un humain hyperténieur(D). Les lignes verticales bleues indiquent les valeursdu 20 e centile, du50 e centile et du80 e centile. Les distributions de l’intensité du signal sont décalées vers la droite, et sont plus grandes dans la gamme, pour les sujets avec le stress chronique d’après charge(c.-à-d. aortique-banded comparé à la souris de contrôle, et hypertendus comparé à l’humain normotensive).
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Figure 5. Données représentatives produites par l’algorithme d’analyse d’image. (A) montre les données d’une souris à feinte (témoin) par rapport à la souris à bandes aortiques (cas) à 7 semaines. (B) montre les données d’un humain avec une pression artérielle normale (contrôle) par rapport à un humain avec l’hypertension chronique (cas). Le rapport myocardique-à-péricardique d’intensité de signal a été déterminé utilisant 3 méthodes analytiques dans l’algorithme : rapport des valeurs de 20e centile ; rapport des valeurs du50 e centile; et rapport des valeurs du80 e centile. La plus grande différence entre les contrôles et les cas est démontrée en utilisant des rapports des valeurs du 80e centile de l’intensité du signal.
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Figure 6. Différences dans l’histologie myocardique de tissu entre les souris avec et sans exposition au stress d’afterload. Les sections tachées trichromes du ventricule gauche du représentant Masson sont montrées pour une souris qui a subi une chirurgie simulée(A: contrôle) et une souris qui a subi une bande aortique(B: cas) à 7 semaines après la chirurgie. Les sections montrent la présence du dépôt substantiel de collagène et de la fibrose interstitielle dans le cas comparé au contrôle. Les barres d’échelle représentent 50 μm.
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Discussion
Nous décrivons le protocole pour un algorithme d’analyse d’image qui quantifie la distribution échographique d’intensité de signal et, à son tour, offre une mesure de substitution de microstructure myocardique. Les fonctionnalités normalisées du protocole, y compris la sélection, le dimensionnement et le positionnement du retour sur investissement et de la région de référence, servent à minimiser la variabilité basée sur l’utilisateur et le sujet. Nous démontrons qu’une fois appliqué aux images échocardiographiques de simple-trame de fin-diastolique, l’algorithme peut convenablement distinguer entre le myocarde normal contre le myocarde exposé à l’effort d’afterload.
Le protocole détaille comment l’algorithme peut être utilisé en utilisant le logiciel open-source ImageJ. Dans cet environnement d’analyse d’image, l’algorithme peut être utilisé pour produire des données sur la distribution des valeurs d’intensité du signal à partir d’un échantillon de tissu myocardique donné. Les distributions d’intensité du signal résultantes peuvent être affichées sous la forme d’histogrammes. Les histogrammes des valeurs d’intensité dans des sélections myocardiques montrent que les tissus myocardiques malades démontrent un bon décalage dans la distribution, et une plus grande gamme de valeurs, une fois comparées au myocarde nondiseased. Ce modèle est vu quand l’algorithme est appliqué aux images échocardiographiques humaines et murines.
On observe que la variabilité de l’intensité du signal au cours du cycle cardiaque correspond à des changements physiologiques dans la densité myocardique. Une méthode analytique qui distingue systématiquement les changements de densité tout au long du cycle cardiaque est considérée comme sensible aux différences de densité myocardique qui se produisent en réponse aux processus pathologiques1,6. En effet, la variabilité cyclique est observée lors de l’application de l’algorithme à des trames consécutives au sein d’échocardiogrammes murins. Une plus grande variation d’intensité au cours du cycle cardiaque est observée pour les valeurs d’intensité d’imagerie à des pourcentages plus élevés par rapport aux centiles inférieurs dans la distribution totale de l’intensité du signal.
Lorsque l’algorithme est appliqué à des échantillons représentatifs d’images échocardiographiques acquises auprès de sujets avec et sans exposition à la résistance après charge, on observe que la densité du rapport myocardique/péricardique à des valeurs de centile sélectionnées est particulièrement efficace pour distinguer les sujets par rapport à l’exposition sans exposition à la résistance chronique après charge. Ce résultat est observé dans les analyses de données représentatives de souris et d’humains. Des densités myocardiques élevées devraient être observées dans le tissu myocardique des sujets exposés à un stress chronique après charge, car un tel stress est connu pour favoriser le dépôt interstitiel de collagène et le développement de la fibrose myocardique14. La mesure des altérations des tissus myocardiques au fil du temps pourrait être utilisée pour fournir une meilleure compréhension de la réponse tissulaire au stress prolongé et à la progression de la maladie. D’autres études sont nécessaires pour évaluer si les variations de l’intensité du signal se corrèlent avec les changements histologiques au fil du temps aussi bien qu’avec la sévérité croissante d’un phénotype donné de la maladie.
L’algorithme d’analyse d’image a une applicabilité limitée aux images avec des artefacts qui interféreraient avec le retour sur investissement et / ou la sélection de référence, la visualisation incomplète des bordures endocardiaques ou la mauvaise qualité globale. L’algorithme peut ne pas être en mesure de comparer avec précision les régions myocardiques et péricardiques d’intérêt lorsque les valeurs de centile démontrent un motif non linéaire lors du mappage en niveaux de gris, ou lorsque la plage dynamique est insuffisante. Bien que de tels cas soient censés être rares dans les valeurs du 10e au 90e centile de l’intensité du signal dans la plupart des phénotypes, l’évaluation préliminaire de la linéarité et de la plage dynamique de rétrodiffusion peut être justifiée pour étudier de nouveaux phénotypes d’intérêt et/ou analyser des images acquises à l’aide de techniques ultrasonores non conventionnelles. L’algorithme est également limité par le manque d’automatisation du retour sur investissement et du processus de sélection des échantillons de référence. En outre, l’algorithme a une capacité limitée pour une utilisation dans les comparaisons croisées d’images capturées à l’aide de paramètres d’acquisition échocardiographiques nettement différents. Dans le rapport actuel, des images chez la souris ont été acquises à l’aide d’un transducteur de 18-38 MHz à des fréquences d’images allant de 225-247 fps; des images chez l’homme ont été acquises utilisant un transducteur de 1-5 MHz à des fréquences d’images s’étendant de 34-54 fps. D’autres études sont nécessaires pour déterminer les révisions de protocole possibles qui pourraient être nécessaires pour les images acquises à l’aide de différents équipements et à des fréquences d’images nettement supérieures aux plages signalées ci-dessus.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants des ressources fournies par le Laboratoire central de physiologie cardiovasculaire de la Harvard Medical School/Brigham and Women’s Hospital. Ce travail a été soutenu en partie par le financement des national institutes de la santé subventions HL088533, HL071775, HL093148 et HL099073 (RL). MB a reçu une bourse postdoctorale de l’American Heart Association. KU est récipiendaire d’une bourse postdoctorale affiliée aux fondateurs de l’American Heart Association. SC a été soutenu par un prix de la Fondation Ellison.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
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