Summary
גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs.
Abstract
elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט מקובל בקנה מידה גדולה קדימה לאחור מסכי גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד הסינפטי. חשיפת APD מייצרת עיכוב ו / או קטלני בנמטודות התפתחותיים באופן תלוי ריכוז. פנוטיפים אלה נגרמים, בין שאר, על ידי עיכוב הנגרם APD של בלוע שאיבת 1,2. לפיכך, פנוטיפ התפתחותית יש בסיס התוקפת, מה שהופך אותו לשימושי ללימודי pharmacogenetic של נוירולפטיות. כאן אנו מדגימים נהלים מפורטים לבדיקת השפעות APD בפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע. עבור assay התפתחותי, עוברים מסונכרנים מונחים על מדיום נמטודות צמיחת צלחות (NGM) המכילות APDs, והשלבים של פיתוח aniאז Mals הם הבקיע יומי. עבור assay קצב שאיבת בלוע, מבוים בעלי חיים מבוגרים צעירים נבדקים על צלחות NGM המכילות APDs. מספר משאבות בלוע ליחידת זמן הוא רשם, ושיעור השאיבה מחושב. מבחני אלה יכולים לשמש ללימוד סוגים רבים אחרים של מולקולות קטנות או אפילו מולקולות גדולות.
Introduction
elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט נוח למסכים בקנה מידה גדולה קדימה לאחור גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג elegans הוא רגיש לספקטרום רחב של תרכובות ביו ולכן שמש בהצלחה להגדיר את מנגנוני פעולה של מגוון רחב של תרכובות מסוג זה. לדוגמא, תרכובות ביו למדו באמצעות פרמקוגנטיקה התולעת כוללת אגוניסטים קולטן האצטילכולין (למשל levamisole, ניקוטין, morantel, וpyrantel), חומרי הרדמה (למשל halothane), קפאין, חוסמי כולינסטרז (למשל aldicarb, lannate, וtrichlorfon), פלואוריד, GABA-קשורים תרכובות (למשל GABA וmuscimol), ivermectin, Paraquat, אסטרים phorbol, ותרופות הקשורים לסרוטונין (למשל סרוטונין וimiprimine) 3. יתר על כן, ג elegans שמש במשך מסכי מולקולה קטנה בקנה מידה גדולה, המאפשר גילוי של מתחם ביו חדשים וזיהוי של מטרות גנטיות רומן 4.
ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד 5 הסינפטי. לכן, ג elegans Neurogenetics והצעת נוירוביולוגיה שיטות לגילוי מנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs. בנמטודות, חשיפת APD מוקדם בהתפתחות מייצרת עיכוב התפתחותי, ובריכוזים גבוהים יותר, קטלני 2,6. חשיפת APD במהלך הבגרות מייצרת פנוטיפים התנהגותיים. לדוגמא, חשיפת קלוזאפין מעכבת תנועה ושאיבת בלוע ומשפרת את הטלת ביצים 1,2,7.
עיכוב התפתחותי מושרה APD וקטלני הם פנוטיפים רבי עוצמה למסכים גנטיים כימיים בקנה מידה גדולה. פנוטיפים אלה הם מורכבים במידה שסבירה להניח שיש להם בשיא יותר מפעם אחת תאי והגנטיs. לכן, מסכי גנטיים כגון צפויים להניב מגוון רחב של מטרות תרופה עקיפות. עם זאת, המעבדה שלנו ביצעה מסכי גן מועמד ומסך RNAi הגנום למדכאים של עיכוב התפתחותי מושרה APD והקטלניות והתאוששה בהצלחה גנים אשר צפוי לקודד יעדים ישירים, ובם דופאמין, אינסולין, וקולטני אצטילכולין ניקוטינית 2,8. גם מסכי גנטיים המבוססים על התנהגויות הנגרמות APD במבוגרים הביאו לזיהוי מטרות APD רומן, וכעת אנו מאמתים מטרות ממסכים הן התפתחות והתנהגות ביונקים 7. לפיכך, גישה חסר חוליות כימיות גנטית כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs מופיעה להיות ריאלי 5,8.
ג לוע elegans הוא איבר הכולל 20 נוירונים, 20 תאי שריר, ו20 תאי אבזר, עטופים בקרום במרתף. דומה ללב היונקים, הלוע הוא אוטונומיnd משאבות כל הזמן אוכל מהסביבה החיצונית 9. עיכוב של קצב שאיבת בלוע פשרות ספיגת מזון, וכך מוטציות או תרופות המעכבים עיכוב גורם שאיבת בלוע התפתחותית או לעצור 9. APDs לעכב את קצב שאיבת בלוע, והיוו בחלקו להשפעות שלהם על פיתוח ו1,2 כדאיות. כאן, אנו משתמשים קלוזאפין APD לא טיפוסי לדוגמא ירושלים להפגין מבחני תרופה לפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דיליי / הקטלני Assay התפתחותית: סוג Wild-(N2) ושני הזנים מוטנטים (Mut1 וMut2) נבדקים בריכוזי Clozapine שלושה בפלייט 12 גם
- , ביום 1 לשפוך 2 מיליליטר NGM בינוני 10 לבאר כל צלחת 12 היטב (גם כל אחד בקוטר 2 סנטימטר) ולאפשר להקשות על הספסל בטמפרטורת חדר (RT) למשך לילה. באותו היום, לקחת מושבה של חיידקי OP50 Escherichia coli, להדביק בקבוק 50 פתרון מיליליטר LB, ותרבותה שייקרה 37 מעלות צלזיוס ב220 סיבוב סל"ד לילה.
- ביום 2, להעביר 20 תרבות חיידקי OP50 μl על מרכזו של כל NGM היטב. דגירה הצלחות בחממה 37 מעלות צלזיוס או להשאיר אותם על RT לילה כדי לאפשר את דשא החיידקים לגדול עבה יותר.
- תן פתרון מניות קלוזאפין 80 מ"מ על ידי המסת קלוזאפין בDMSO (sulfoxide דימתיל) ממס. ואז להפוך את הפתרון עובד 80 μl עם פתרון המניות בדילול מלא ב1.7 מ"מ ב חומצה אצטיתased בטבלה 1.
הערה: הפתרון עובד לתרופה מסוימת של ריבית צריך להיקבע על ידי ביצוע סדרה של בדיקות ריכוז ראשוניות כדי למצוא את הריכוז המתאים ביותר להבחנה מהסוג בר מהמוטציות. - ההעברה 80 μl קלוזאפין עובדת פתרון לצלחת NGM seeded היטב ולערבל את הצלחת על מנת לאפשר הפתרון לחלק באופן שווה על פני השטח. חכה לצלחת לייבוש. השתמש בצלחת עבור assay באותו היום או למקם אותו בחממה 20 מעלות צלזיוס לשימוש ביום שלמחרת.
הערה: הפתרון עובד הוא השעיית סמים בשל המסיסות הנמוכה של קלוזאפין, במיוחד בריכוז גבוה יותר. לכן, מערבולת הצינור לפני העברת הפתרון לצלחת התרופה על מנת להבטיח כי ריכוז התרופה הוא מדויק. - לשטוף תולעים את צלחת 3.5 סנטימטר המכילה רבים מבוגרים הרה להולדת עם חיץ M9 ואז לסובב אותם בצינור 15 מיליליטרב2,000 סל"ד דקות 1.
- לשאוב supernatant. הוסף 5 מיליליטר פתרון אקונומיקה (NaOH: היפוכלוריט: 2 DDH O ב4:01:05) ולשבש את נמטודות בעדינות על ידי היפוך הצינורות.
- שים לב לבעלי החיים עד שהחצי מהם הם מומסים בסביבות 5 דקות. ספין למטה הביצים על 2,000 סל"ד דקות 1.
- לשאוב supernatant ולהוסיף 14 מיליליטר חיץ M9 במהירות.
- ספין למטה הביצים על 2,000 סל"ד דקות 1 ולשאוב supernatant, עוזב כ 100 פתרון μl. ורטקס להשעות את הביצים.
- 2 ביצי μl העברה תלויות בM9 על צלחת NGM קבועה כדי לבדוק כמה ביצים מועברים. כוון את עוצמת הקול של הביצים הושעו על מנת להבטיח כי ישנם כ 30-35 ביצים בכל העברה. העבר 30-35 ביצים היטב בכל צלחת assay, ואז דגירה בחממה 20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- ביום הראשון של assay, ציון את מספר הביצים בקעו. התאם את המספר הכולל של בעלי חיים שבקעו ל25/well ידי picking את התולעים נוספים במידת צורך.
- בימים שלאחר מכן, לבחון את בעלי החיים ואת ציונם בכל שעה 24. שלב התפתחותי הוא הבקיע בהתבסס על גודלו של בעל החיים ואת הצורה של 11 הפות. הניסוי נמשך 5-6 ימים עם האפקט חזק ביותר שנראה בדרך כלל ביום השלישי או רביעי.
- קלט את הנתונים לקובץ Excel ולחשב את האחוז של בעלי חיים בכל שלב התפתחותי, לכל יום של הניסוי. ליצור גרפים עם הפונקציה '100% Stacked טור 'בעמודת '2-D' התפריט.
2. Assay שאיבת בלוע: בעלי חיים מבוגרים צעירים לWild-type וזנים מוטנטים האם קלעו על צלחות Clozapine Assay
- צלחת assay נעשתה בעקבות אותו הפרוטוקול המשמש עבור assay עיכוב / הקטלניות התפתחותית.
- פיק 50 חיות L4 עבור כל זן לצלחות NGM seeded 24 שעות לפני assay דגירה התולעים ב20 ° C.
- פיק 10 חיות לאסאy צלחת היטב. לאחר מכן לבחור 10 בעלי חיים ולכל דקות 15-20 הבאה.
- אחרי בעלי החיים בבאר הראשונה שנחשפו לתרופה ל30 דקות, להתחיל assay על ידי התבוננות שאיבת בלוע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואת ציון המשאבות ל20 שניות 9. פעם אחת שאיבת בלוע הוא הבקיע, להרים את התולעת מהצלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. עיכוב התפתחותי / תוצאת assay הקטלניות
תוצאה אופיינית לassay עיכוב / הקטלניות התפתחותית מודגמת באיורי 1 א ו 1 ב. כאשר חיות בר מסוג בקבוצת הביקורת גדלו השלב הרה להולדת למבוגרים (איור 1 א), חיות בר מהסוג שנחשפו לקלוזאפין נמצאות עדיין בשלבי הזחל הצעירים או שהם (איור 1b). איור 1 ג מת מראה תוצאת נציג השוואה מוטציה מדכאת (Mut1) ומוטציה משפר (Mut2) עם הסוג בר בשלושה ריכוזי קלוזאפין שונים. בכל שלושת ריכוזי קלוזאפין, הקטלניות של Mut1 נמוכה מסוג בר והקטלניות של Mut2 היא גבוהות יותר. בעלי החיים Mut1 לשרוד להתקדם לשלבי זחל מתקדמים יותר מסוג בר, ואילו בעלי חיים ששרדו Mut2 להציג עיכוב התפתחותי בהשוואה לסוג בר. </ P>
2. תוצאת assay קצב שאיבת בלוע
איור 2 מראה תוצאת נציג assay שאיבת בלוע השוואת מוטציה מדכאת (Mut1) ומוטציה משפר (Mut2) עם הסוג בר בשני ריכוזי קלוזאפין. חשיפת קלוזאפין מפחיתה את שיעורי שאיבת בלוע של זני wild-type ו מוטציה באופן תלוי ריכוז. עם זאת, קצב שאיבת בלוע הירידה של Mut1 הוא פחות מזה של הסוג בר, בעוד שקצב שאיבת בלוע הירידה של Mut2 הוא גדול יותר מזה של הסוג בר.
איור 1. הפגנה של עיכוב התפתחותי מושרה קלוזאפין וקטלני. חיות בר מסוג (N2) גדל על שליטה צלחת NGM (א) ועל צלחת NGM בתוספת 200 מיקרוגרם / מיליליטר (612 מיקרומטר) קלוזאפין (ב). (ג) תוצאת נציג של assay עיכוב / הקטלניות מתפתח המראה את ההשפעה של קלוזאפין בסוג בר (N2), מוטציה מדכאת (Mut1), ומוטציה משפר (Mut2). התמונות ב( א) ו (ב) הם נדפסו <http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html 34 (8), 1968-1978 (יולי> מNeuropsychopharmacology. 2009). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
"Width =" ig1.jpg "/> 600px
איור 2. הפגנה של עיכוב הנגרם קלוזאפין שאיבת בלוע. תוצאה אופיינית עבור assay שאיבת בלוע מראה ההשפעה של קלוזאפין בסוג בר (N2), מוטציה מדכאת (Mut1), ומוטציה משפר (Mut2). הנתונים נותחו עם דו סטרי ANOVA באמצעות ר 'תכנית תוכנה סטטיסטית, לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
טבלת 1. הכנת פתרון עבודה של קלוזאפין. הסכום הוא עבור 4 בארות בכל ריכוז.
| ריכוז קלוזאפין | 0 מיקרומטר | 300 מיקרומטר | 400 מיקרומטר | 500 מיקרומטר |
|---|---|---|---|---|
| פתרון HAC | 270 μl | 270 μl | 270 μl | 270 μl |
| פתרון מניות קלוזאפין | - | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
| DMSO | 50 μl | 20 μl | 10 μl | 0 μl |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטות לבדיקת ההשפעות של APDs על ההתפתחות וההתנהגות של ג elegans. DMSO או אתנול משמש כדי לפזר קלוזאפין, שכן התרופה היא יחסית בלתי מסיס במים. מכיוון שכבר דיווחו ממסים להשפיע ג הביולוגיה elegans 12, DMSO-לבד או בקבוצות שליטת אתנול לבד הן חיוניות. הריכוז הגבוה ביותר של DMSO משמש במבחנים שלנו הוא עד 3%, שאין לה השפעה ברורה על ג elegans פיתוח. DMSO יכול לשמש להרבה מולקולות קטנות, או אפילו כמה מולקולות גדולות, כגון: חומצות שומנים בדם.
ריכוזי APD שימוש במבחנים אלה הם גבוהים יותר מאלה שניתנו לבני אדם. זה נפוץ עבור רוב מחקרי מולקולה הקטנים בג elegans, שכן ריכוזים גבוהים נדרשים לחדירה של ג elegans לציפורן. מחקרים מצביעים על כך שHPLC הרמות של קלוזאפין בג רקמת elegans באסא התפתחותייםy קרוב לאלה צפויים במוחות אנושיים 2.
חדירה של הציפורן היא דאגה מיוחדת ללימודים של מולקולות גדולות. מוטאנטים עם מומים במחסום לציפורן, כגון מוטציות ומוטציות האוטובוס (acterially U wollen n-S B) ACS-20, מציעים גישה אחת לעקוף בעיה זו 13. מוטציות אוטובוס היו מבודדות על בסיס התנגדותם לזיהום על ידי nematophilum Microbacterium הפתוגן. לדוגמא, אללים חלשים של אוטובוס-8 מראים כי גן זה ממלא תפקיד בייצור של פני השטח הציפורן. מוטציות אלה הן עמידות לזיהום, כי החיידק לא יכול להיקשר אל פני השטח המארח. חשוב לציין, שיבוש היווצרות ציפורן גורם גם לרגישות מוגברת בסמים ברקע גנטי זה 14.
Assay ההתפתחותי שתואר כאן ניתן לשנותם עד למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה על ידי ביצוע assay בcultu נוזליתמחדש. להתערבות RNA הגנום כל מסכים (RNAi), למשל, הפרוטוקול דומה לזה שתואר לעיל, אך חיידקי RNAi האכלה מוחלפים לחיידקים OP50 15. Assay התרבות הנוזלי דורש ריכוז תרופה נמוך יותר מאשר הצלחת assay (תצפית לא פורסם). המעבדה שלנו שבוצעה מסך RNAi הגנום כגון למדכאים של עיכוב התפתחותי מושרה קלוזאפין והשיגה 40 מדכאי ממסך של ~ 17,000 ג elegans גנים 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין סכסוך העניין המעורב.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי הפרס פיתוח מדען הקליני K08NS002083-NIH, גרנט Shervert פרייזר מכון המחקר, ופרס לחוקר צעיר NARSAD לאדגר א Büttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
