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Neuroscience

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법 Published: February 4, 2014 doi: 10.3791/50864
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Mailman Research Center, McLean Hospital

Summary

예쁜 꼬마 선충에서 항 정신병 약물 (APDS)의 효과를 테스트하기위한 접근 방법을 설명합니다. 분석법 개발과 생존에와 인두 펌핑 속도에 약물 효과를 테스트하기 위해 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 APDS 이외의 다른 약 종류와 약물 유전 학적 실험에 적용 할 수 있습니다.

Abstract

예쁜 꼬마 선충은 앞으로 대규모의 의무와 유전 화면과 화학 유전 화면을 반전 간단한 유전 유기체이다. C. elegans의 게놈은 신경 전달 물질의 합성과 시냅스의 구조와 기능에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 잠재적 인 항 정신병 약물 (APD) 인간의 보존 목표를 포함한다. APD 노출은 농도 의존적​​으로 발달 지연 및 / 또는 선충의 치사율을 생성한다. 이러한 표현형 1,2 펌핑 인두의 APD 유발 억제에 의해 부분적으로 발생합니다. 따라서, 개발 표현형 진통제의 약물 유전 학적 연구에 유용하고, 신경 근육 학 기초를 가지고 있습니다. 여기에서 우리는 선충 개발 및 인두 펌핑에 APD의 효과를 시험하기위한 세부 절차를 보여줍니다. 개발 분석의 경우, 동기화 된 배아는 선충의 성장 매체 APDS를 포함 (NGM) 접시, 및 애니을 개발하는 단계에 배치됩니다MALS 그런 다음 매일 채점됩니다. 인두 펌핑 속도 분석을 위해, 젊은 성인 동물 APDS를 포함 NGM 플레이트에 시험 무대. 단위 시간당 인두 펌프의 개수가 기록되고, 펌핑 속도가 계산된다. 이러한 분석법은 작은 분자 또는 큰 분자의 다른 많은 유형을 연구를 위해 사용될 수있다.

Introduction

예쁜 꼬마 선충은 대규모의 순방향 및 역방향 유전자 화면과 화학 유전 화면에 순종 간단한 유전 유기체이다. C. elegans의 생리 활성 화합물의 광범위에 민감하고, 따라서 이러한 화합물의 여러 가지의 작용 메커니즘을 정의하는 데 성공적으로 사용되어왔다. 예를 들어, 생체 활성 화합물은 웜 약물 유전학은 아세틸 콜린 수용체 작용제 (예를 들어 레바 미솔, 니코틴, morantel 및 pyrantel), 마취제 (예 : 할로 탄), 카페인, 콜린 에스 테라 제 억제제 (예 알디 카르 브, lannate 및 trichlorfon), 플루오 라이드, GABA-관련을 포함하여 연구 화합물 (예를 들어, GABA 및 muscimol), 이버 멕틴, 파라콰트, 포르 볼 에스테르, 세로토닌 관련 약물 (예, 세로토닌과 imiprimine) 3. 또한, C. 엘레하므로 대규모 저분자 스크린에 사용 된 새로운 생리 활성 화합물의 발견s 및 새로운 유전자 표적 4의 식별.

C. elegans의 게놈은 신경 전달 물질의 합성과 시냅스의 구조와 기능 5에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 잠재적 인 항 정신병 약물 (APD) 인간의 보존 목표를 포함한다. 따라서, C. 엘레 neurogenetics와 APDS의 행동의 새로운 분자 메커니즘을 발견하기위한 신경 생물학 제공 방법. 선충에서 APD 노출은 개발 초기 발달 지연, 그리고 더 높은 농도에서 치사 2,6를 생성합니다. 성인기 동안 APD 노출 행동 표현형을 생산하고 있습니다. 예를 들어, 클로자핀 노출은 운동과 인두 펌프를 억제하고 1,2,7 누워 계란을 향상시킵니다.

APD 유도 발달 지연 및 치사율은 대규모 화학 유전 스크린에 대한 강력한 표현형이다. 그들은 아마도 더 이상의 세포 및 유전자 BASI이 이러한 표현형은 지금까지의 복잡의. 따라서, 이러한 유전 스크린은 간접 약물 표적의 다양성을 수득 할 것으로 예상된다. 그러나, 우리의 실험실은 후보 유전자 화면과 APD 유도 발달 지연과 치사율의 억제를위한 게놈 전체의 RNAi 화면을 수행하고 성공적으로 가능성이 도파민, 인슐린 및 니코틴 아세틸 콜린 수용체 2,8 등의 직접적인 목표를 인코딩 유전자를 회복했다. 성인의 APD-유도 행동에 따라 유전 스크린은 새로운 APD 목표의 식별을 이끌고있다, 우리는 지금 포유류 7 발달과 행동 두 화면에서 대상의 유효성을 검사합니다. 따라서, APDS의 행동의 새로운 분자 메커니즘을 발견하는 무척추 화학 물질의 유전 방식은 5,8 가능한 것으로 보인다.

C. elegans의 인두 (20) 신경 (20) 근육 세포 및 기저막에 의해 래핑 (20) 액세서리 세포를 포함하는 기관이다. 포유 동물의 심장과 유사하게, 인두는 자율입니다ND 지속적으로 외부 환경 9에서 음식을 펌프. 인두 펌핑 속도의 억제는 음식의 흡수를 저해하고, 따라서 돌연변이 또는 약물 인두 펌핑 원인 발달 지연을 억제하거나 9를 체포하는. APDS 개발과 생존의 1,2에 미치는 영향에 대한 부분에서 회계, 인두 펌핑 속도를 억제한다. 여기, 우리는 선충 개발 및 인두 펌핑 약물 분석을 설명하기 위해 예를 들어 전형적인 APD의 클로자핀을 사용합니다.

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Protocol

1. 발달 지연 / 치사율 분석 : 야생형 (N2)와 두 개의 돌연변이 (Mut1 및 Mut2) 균주가 12 - 웰 플레이트에 세 클로자핀 농도 테스트

  1. 1 일에 (2cm 직경 아니라 각) 12 - 웰 플레이트의 각 웰에 2 ㎖ NGM 매체 (10)을 부어 하룻밤 실온 (RT)에 벤치에 강화 할 수 있습니다. 같은 날, 하룻밤 220 rpm으로 회전에서 대장균 OP50 박테리아의 식민지를 선택 50 ㎖ LB 솔루션의 병을 감염, 그리고 37 ° C 통 문화를.
  2. 2 일에, 각 웰 NGM의 중심에 20 μL OP50 박테리아 문화를 전송할 수 있습니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 품어 또는 세균 잔디가 두껍게 성장 할 수 있도록 실온에서 밤새을 둡니다.
  3. DMSO (디메틸 설폭 사이드) 용매에 클로자핀을 용해하여 80 mM의 클로자핀 주식 솔루션을 확인합니다. 그 후 1.7 mM의 아세트산 B에게 희석 원액과 80 ㎕의 작업 솔루션을표 1에 ased.
    참고 : 관심의 특정 약물에 대한 작업 솔루션은 돌연변이 체에서 야생 유형을 구별하기위한 가장 적절한 농도를 찾기 위해 예비 농도 일련의 테스트를 수행하여 결정해야합니다.
  4. 전송 80 μL 클로자핀 잘 시드 NGM 판에 솔루션을 작동 액이 표면에 균등하게 분배 할 수 있도록 판을 소용돌이 친다. 플레이트가 마를 때까지 기다립니다. 같은 날에 분석을 위해 플레이트를 사용하거나 다음 날 사용할 수 있도록 20 ° C의 배양기에 배치합니다.
    참고 : 작업 솔루션은 특히 높은 농도로 인해 클로자핀의 낮은 용해도에 약 서스펜션입니다. 따라서, 약물 농도가 정확하다는 것을 보장하기 위해 약물 플레이트 용액을 전송하기 전에 튜브를 소용돌이.
  5. M9 버퍼 많은 임신하는 성인을 포함하는 3.5 cm 플레이트 웜을 세척 한 다음 15 ㎖의 튜브를 스핀 다운1 분 동안 2,000 rpm에서.
  6. 뜨는을 대기음. 5 ㎖ 표백제 용액 (: 차아 염소산 : NaOH를 4시 1분 5초에서 DDH 2 O)를 추가하고 부드럽게 튜브를 반전하여 선충을 방해.
  7. 그 중 절반이 약 5 분에서 용해 될 때까지 동물을 관찰한다. 1 분 동안 2,000 rpm에서 계란을 스핀 다운.
  8. 뜨는을 대기음 빠르게 14 ㎖의 M9 버퍼를 추가합니다.
  9. 1 분 동안 2,000 rpm에서 계란을 회전 약 100 ㎕의 솔루션을 남겨 뜨는을 대기음. 계란을 일시 중단 소용돌이.
  10. 전송 2 μL 달걀 전송 얼마나 많은 계란을 테스트 할 수있는 정기적 인 NGM 플레이트에 M9에서 일시 중단. 약 30 ~ 35 알을 각 전송에 있다는 것을 확인하기 위해 일시​​ 중단 된 계란의 볼륨을 조정합니다. 분석 플레이트의 각 웰에 30 ~ 35 알을 전송 한 후 24 시간 동안 20 ° C 배양기에서 배양한다.
  11. 검정 첫날, 부화 계란의 개수 점수. picki에 의해 25/well에 부화 동물의 총 수를 조정필요한 경우 별도의 벌레를 겨.
  12. 다음과 같은 일에, 동물을 관찰하고 그들에게 매 24 시간을 점수. 발달 단계는 동물의 크기 및 외음부 (11)의 형상에 기초하여 획득된다. 실험은 일반적으로 세 번째 또는 네 번째 날에 본 가장 강력한 효과 5-6 일을 지속.
  13. Excel 파일에 입력 데이터와 실험의 매일 각 발달 단계에서 동물의 비율을 계산합니다. '100 % 메뉴 ''2-D 열에서'열 스택 기능을 그래프를 생성합니다.

2. 인두 양수 분석 : 야생형과 돌연변이 균주에 대한 젊은 성인 동물은 클로자핀 분석 플레이트에 채점

  1. 분석 플레이트가 발달 지연 / 사멸 분석에 사용되는 동일한 프로토콜 뒤에 이루어진다.
  2. 24 시간 분석하기 전에 시드 NGM 플레이트에 각 변형 50 L4 동물을 선택하고 20 ℃에서 벌레를 품어
  3. ASSA에 10 마리를 선택Y는 잘 접시. 그런 다음 잘 때마다 15 ~ 20 분에 10 마리를 선택합니다.
  4. 첫 번째 잘 동물이 30 분 동안 약물에 노출 된 후, 해부 현미경으로 인두 펌프를 관찰하여 분석을 시작하고 20 초 9의 펌프를 점수. 인두 펌핑이 득점되면, 플레이트 떨어져 웜을 선택합니다.

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Representative Results

1. 발달 지연 / 주죠 분석 결과

발달 지연 / 주죠 분석의 전형적인 결과는도 1a에서 설명하고 1B된다. 컨트롤 그룹에있는 야생 형 동물이 임신하는 성인 단계 (그림 1a)로 성장했을 때, 클로자핀에 노출 된 야생 형 동물은 죽은 (그림 1b). 그림 1C는 비교 대표적인 결과를 보여줍니다 젊은 유생 단계에 아직도 또는이다 억제 돌연변이 (Mut1)와 세 가지 클로자핀 농도에서 야생 유형 증강 돌연변이 (Mut2). 세 클로자핀 농도에서, Mut1의 치사율은 야생형보다 낮은와 Mut2의 치사율은 높다. 생존 Mut2 동물 야생형에 비해 발달 지연을 표시하면서 생존 Mut1 동물, 야생 타입보다 더 진보 된 애벌레 단계로 진행. </ P>

2. 인두 펌핑 속도 분석 결과

그림 2는 두 개의 클로자핀 농도에서 야생 유형의 억제 돌연변이 (Mut1) 및 증강 돌연변이 (Mut2)를 비교 대표 인두 펌핑 분석 결과를 보여줍니다. 클로자핀 노출은 농도 의존적​​으로 야생형 및 돌연변이 균주의 인두 펌핑 속도를 감소시킨다. Mut2의 감소 인두 펌핑 속도가 야생형보다 더 우수하지만 Mut1의 감소 인두 펌핑 속도는 야생형에 비해 작다.

그림 1
그림 1. 클로자핀에 의한 발달 지연과 치사율의 데모. 야생 형 동물 (N2)의 제어에 성장 NGM 플레이트 (A), 200 ㎍ / ㎖ (612 μM)로 보충 NGM 플레이트에 클로자핀 (B). (C) 야생형 (N2), 억제 돌연변이 (Mut1) 및 증강 돌연변이 (Mut2)에 클로자핀의 효과를 보여주는 발달 지연 / 주죠 분석의 대표적인 결과. (a) 및 (b) <복각되어있는 이미지 http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html Neuropsychopharmacology에서>. 34 (8), 1968년에서 1978년까지 (7 월 , 2009). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 2. 인두 펌프의 클로자핀에 의한 억제의 데모. 야생형 (N2), 억제 돌연변이 (Mut1) 및 증강 돌연변이 (Mut2)에 클로자핀의 효과를 보여주는 인두 펌핑 분석의 일반적인 결과입니다. 데이터는 양방향 ANOVA가 통계 소프트웨어 프로그램 R.를 사용하여 분석 하였다 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하세요 .

표 1. 클로자핀의 작업 용액의 제조. 금액은 각각의 농도에서 4 우물입니다.

클로자핀 농도 0 μM 300 μM 400 μM 500 μM
HAC 솔루션 270 μL 270 μL 270 μL 270 μL
클로자핀 원액 - 30 μL 40 μL 50 μL
DMSO 50 μL 20 μL 10 μL 0 μL

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Discussion

여기, 우리는 C의 개발 및 행동에 APDS의 효과를 테스트하는 방법을 설명합니다 엘레. 약이 물에 상대적으로 불용성이기 때문에 DMSO 또는 에탄올, 클로자핀을 용해하는 데 사용됩니다. 용매는 C. 영향을 미치는 것으로보고되었다 있으므로 엘레 생물학 (12), DMSO 형 또는 에탄올 형 제어 그룹은 필수적이다. 우리의 분석에 사용 된 DMSO의 높은 농도는 C.에 명백한 영향을주지 않습니다 최대 3 %이며, 개발 엘레 간스. DMSO 심지어 많은 작은 분자, 또는 큰 분자, 예를 들면 지질 류에 사용될 수있다.

이러한 분석에 사용 된 APD 농도는 인간에게 주어진 것보다 더 높다. 이것은 C에서 가장 작은 분자 연구에 일반적입니다 elegans의 높은 농도는 C의 침투에 필요하기 때문에 표피 엘레 간스. HPLC 연구 나타낸다고 C.에서 클로자핀의 레벨 개발 ASSA에서 엘레 조직Y는 인간의 두뇌 2에서 예상에 가까운 있습니다.

표피의 침투는 큰 분자의 연구를위한 특별한 관심사입니다. 이러한 ACS-20 돌연변이 버스 (B acterially U N-S의를 wollen) 돌연변이와 같은 표피 장벽에 결함을 가진 돌연변이는이 문제 (13)를 우회하는 한 가지 방법을 제공합니다. 버스 돌연변이 병원체 Microbacterium의 nematophilum 의한 감염과 그들의 저항의 기초 절연되었다. 예를 들어, 버스 (8)의 약한 대립 유전자는이 유전자는 표피 표면의 생산에 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 박테리아가 숙주의 표면에 결합 할 수 없기 때문에 이러한 돌연변이, 감염에 내성이다. 중요한 것은, 표피 형성의 장애는 유전 적 배경이 14 증가 약물 민감도가 발생합니다.

여기에 기술 발달 분석은 액체 cultu의 분석을 수행하여 대규모 유전 화면에 확장 할 수 있습니다재. 게놈 전체 RNA 간섭 (RNAi의) 스크린, 예를 들면, 프로토콜은 위에서 설명 된 것과 유사하지만, 먹이 RNAi의 박테리아 OP50 균 (15)로 대체된다. 액체 배양 분석 플레이트 분석 (게시되지 않은 관찰)보다 낮은 약물 농도를 필요로합니다. 우리 연구소는 클로자핀에 의한 발달 지연의 억제를 위해 이러한 게놈 전체의 RNAi 화면을 수행 ~ 17,000 ℃의 화면에서 40 억 제기를 얻을 elegans의 유전자 8.

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Disclosures

저자는 참여 관심 충돌이없는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

작품은 NIH 임상 과학자 개발 수상 K08NS002083, Shervert 프레이 연구소 그랜트, 에드거 A. Buttner에 NARSAD 젊은 탐정 수상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clozapine Sigma C6305
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Acetic acid (HAC) Fisher BP2401
Sodium hydroxide (NaOH) EMD SX0590-13
Hypochlorite Sigma-Aldrich 425044
Centrifuge 5810 Eppendorf 5810 000.017
Incubator shaker New Brunswick Scientific M1246-0006
Low temperature incubator 815 Precision Scientific J1790-1B
Stereomicroscope Olympus SZX12
Petri dish 35 x 10 mm Fisher Scientific NC9434271
12-well Tissue culture plate BD Falcon REF 353043

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References

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Hao, L., Buttner, E. A. Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (84), e50864, doi:10.3791/50864 (2014).

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