Summary
Abordagens para testar os efeitos de drogas antipsicóticas (APDs) em Caenorhabditis elegans são demonstrados. Os ensaios estão descritos para testar efeitos de drogas sobre o desenvolvimento ea viabilidade e sobre a taxa de bombeamento da faringe. Estes métodos também são aplicáveis para as experiências de farmacogenética com outras classes de drogas que APD.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de grande escala para a frente e reverter telas genéticos e telas genéticos químicos. O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica. Exposição APD produz atraso e / ou letalidade em nemátodos desenvolvimento de uma forma dependente da concentração. Estes fenótipos são causados, em parte, pela inibição induzida por TPA de bombeamento da faringe 1,2. Assim, o fenótipo de desenvolvimento tem uma base neuromuscular, tornando-o útil para estes estudos de neurolépticos. Aqui demonstramos procedimentos detalhados para testar efeitos APD sobre o desenvolvimento do nematóide e da faringe de bombeamento. Para o ensaio de desenvolvimento, os embriões são sincronizados colocado em meio de crescimento de nemátodos placas (NGM) contendo APD, e as fases de desenvolvimento de animals são, então, marcou diária. Para o ensaio de taxa de bombeamento da faringe, encenado animais adultos jovens são testados em placas NGM contendo APDs. O número de bombas da faringe por unidade de tempo é gravado, ea taxa de bombeamento é calculado. Estes ensaios podem ser utilizados para estudar muitos outros tipos de moléculas pequenas ou até mesmo moléculas grandes.
Introduction
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de telas genéticos frente e verso em grande escala e telas genéticos químicos. C. elegans é sensível a um amplo espectro de compostos bioactivos e, por conseguinte, tem sido usado com sucesso para definir os mecanismos de acção de uma variedade de tais compostos. Por exemplo, os compostos bioactivos estudada usando farmacogenética vermes incluem agonistas de receptor de acetilcolina (por exemplo, levamisole, nicotina, morantel, pirantel e), anestésicos (p.ex. halotano), cafeína, os inibidores da colinesterase (por exemplo, aldicarbe, Lannate, e TRICLORFOM), flúor, relacionadas-GABA compostos (por exemplo, GABA e muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol e drogas relacionados com a serotonina (por exemplo, serotonina e imiprimine) 3. Além disso, C. elegans foi usado para telas de pequenas moléculas de grande escala, permitindo a descoberta de novos compostos bioactivoss e identificação de alvos genéticas novas 4.
O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica 5. Assim, C. elegans neurogenetics e métodos oferta neurobiologia para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs. Em nematóides, exposição DPA no início do desenvolvimento produz atraso do desenvolvimento, e em concentrações mais elevadas, a letalidade 2,6. Exposição APD durante a idade adulta produz fenótipos comportamentais. Por exemplo, a exposição a clozapina inibe locomoção e bombeamento da faringe e aumenta a postura de ovos 1,2,7.
Atraso de desenvolvimento e letalidade induzida pela APD são fenótipos poderosas para telas genéticos químicos em larga escala. Estes fenótipos são complexa na medida em que eles provavelmente têm mais do que um basi celulares e genéticass. Portanto, tais telas genéticas são esperados para produzir uma variedade de alvos de drogas indirectos. No entanto, o nosso laboratório tem conduzido telas de genes candidatos e uma tela de RNAi de todo o genoma para supressores de atraso e a letalidade induzida por TPA de desenvolvimento e foi recuperado com sucesso genes que codificam provavelmente alvos directos, incluindo a dopamina, a insulina, e os receptores de acetilcolina nicotínicos 2,8. Telas genéticos baseados em comportamentos induzidos-APD no adulto também levaram à identificação de alvos APD novela, e agora estamos validando alvos das telas tanto de desenvolvimento e comportamentais em mamíferos 7. Assim, uma abordagem genética química invertebrados para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs parece ser viável 5,8.
O C. elegans faringe é um órgão que inclui 20 neurônios, células musculares, 20 e 20 células acessórias, envolto por uma membrana basal. Semelhante ao coração dos mamíferos, a faringe é um autónomaª constantemente bombas alimentos a partir do ambiente externo 9. A inibição da taxa de bombeamento da faringe comprometendo a absorção de alimentos e, portanto, mutações ou drogas que inibem bombeamento da faringe causa atraso no desenvolvimento ou prender 9. APDs inibir a taxa de bombeamento da faringe, o que representa, em parte, por seus efeitos sobre o desenvolvimento e viabilidade 1,2. Aqui, usamos a clozapina APD atípico como um exemplo para demonstrar testes de drogas para o desenvolvimento de nematóides e da faringe de bombeamento.
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Protocol
1. Developmental Delay / Letalidade Ensaio: The Wild-Type (N2) e Dois Mutant (Mut1 e Mut2) Cepas são testadas em três concentrações de clozapina em 12 poços da placa
- No dia 1, 2 ml de derramar NGM médio de 10 em cada cavidade de uma placa de 12 poços (cada poço com um diâmetro de 2 cm) e deixa-se endurecer sobre o banco, à temperatura ambiente (RT) durante a noite. No mesmo dia, escolher uma colônia de bactérias Escherichia coli OP50, infectar uma garrafa de 50 ml de solução de LB e cultura-lo em um shaker 37 ° C a 220 rpm de rotação durante a noite.
- No dia 2, transferir 20 ul de cultura bacteriana OP50 para o centro de cada NGM bem. Incubar as placas numa incubadora a 37 ° C, ou deixá-los à TA durante a noite para permitir que a camada de bactérias que crescem mais espessa.
- Adicione uma solução de estoque 80 mM de clozapina por dissolução de clozapina em DMSO (dimetilsulfóxido) solvente. Em seguida, faça uma solução de trabalho de 80 mL com a solução estoque diluída em 1,7 mM de ácido acético based na Tabela 1.
Nota: A solução de trabalho para uma droga em particular de interesse pode ser determinada fazendo uma série de provas preliminares de concentração para obter a concentração mais adequada para distinguir o tipo selvagem a partir dos mutantes. - Transferência de 80 uL de solução de trabalho clozapina na placa NGM semeado bem e agita-se a placa para permitir que a solução para distribuir uniformemente sobre a superfície. Esperar para a placa secar. Usar a placa para o ensaio, no mesmo dia ou colocá-lo em uma incubadora a 20 ° C até ser utilizado no dia seguinte.
Nota: A solução de trabalho é uma suspensão do fármaco, devido à baixa solubilidade da clozapina, especialmente em concentrações mais elevadas. Portanto, vortex do tubo antes de se transferir a solução para a placa de droga, a fim de garantir que a concentração de fármaco é preciso. - Lave vermes de uma placa 3,5 centímetros contendo muitos adultos grávidas com tampão M9 e então colocá-los para baixo em um tubo de 15 mla 2.000 rpm durante 1 min.
- Aspirar o sobrenadante. Adicionar 5 ml de solução de lixívia (NaOH: hipoclorito: DDH 2 O em 4:1:5) e perturbar os nematóides invertendo os tubos.
- Observar os animais até a metade deles são dissolvidos em cerca de 5 min. Girar os ovos a 2.000 rpm por 1 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 14 ml de tampão M9 rapidamente.
- Girar os ovos a 2.000 rpm por 1 min e aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 100 mL solução. Vortex para suspender os ovos.
- Transferência de 2 ovos ul suspensa em M9 em uma placa NGM regulares para testar quantos ovos são transferidos. Ajustar o volume dos ovos em suspensão para assegurar que existem aproximadamente 30-35 ovos em cada transferência. Transferir 30-35 ovos de cada poço da placa de ensaio, e depois incubar numa incubadora a 20 ° C durante 24 hr.
- No primeiro dia do ensaio, marcar o número de ovos eclodidos. Ajuste o número total de animais eclodidos para 25/well por Picking fora os vermes suplementares, se necessário.
- Nos dias seguintes, observar os animais e pontuá-los a cada 24 horas. Estágio de desenvolvimento é pontuada com base no tamanho do animal, e a forma da vulva 11. O experimento dura 5-6 dias, com o efeito mais forte, tipicamente visto no terceiro ou no quarto dia.
- Introduza os dados em um arquivo de Excel e calcular a percentagem de animais em cada fase de desenvolvimento para todos os dias do experimento. Gerar gráficos com a função '100% Stacked Column 'no '2-D coluna' menu.
2. Pharyngeal Bombeamento Ensaio: Jovem Adulto Animais para o tipo selvagem e estirpes mutantes são pontuados em placas Clozapina Ensaio
- A placa de ensaio é feito seguindo o mesmo protocolo utilizado para o ensaio de atraso / letalidade desenvolvimento.
- Escolha 50 animais L4 para cada estirpe de placas NGM semeadas 24 horas antes do ensaio e incubar os vermes, a 20 ° C.
- Escolha 10 animais para uma assay placa também. Em seguida, escolher 10 animais para o próximo bem a cada 15-20 min.
- Depois de os animais no primeiro poço foram expostas ao fármaco durante 30 minutos, iniciar o ensaio, observando bombeamento da faringe sob um microscópio de dissecção e marcar as bombas durante 20 seg 9. Uma vez bombeamento da faringe é marcado, pegar o verme para fora do prato.
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Representative Results
1. Atraso no desenvolvimento / resultado do ensaio de letalidade
Um resultado típico para o ensaio de atraso / letalidade no desenvolvimento, é demonstrada nas Figuras 1a e 1b. Quando os animais do tipo selvagem no grupo de controle têm crescido para a fase adulta gravídico (Figura 1a), do tipo selvagem animais expostos à clozapina ainda estão nos estágios larvais jovens ou estão mortos (Figura 1b). Figura 1c mostra um resultado representativo comparando um mutante supressor (Mut1) e um mutante de intensificador (Mut2) com o tipo selvagem, em três concentrações diferentes de clozapina. Em todas as três concentrações de clozapina, a letalidade de Mut1 é menor do que o tipo selvagem e a letalidade de Mut2 é maior. Sobrevivendo animais Mut1 progredir para estágios larvais mais avançados do que do tipo selvagem, enquanto que os animais sobreviventes Mut2 apresentar atraso no desenvolvimento em relação ao tipo selvagem. </ P>
2. Resultado do ensaio taxa de bombeamento da faringe
A Figura 2 mostra um resultado do ensaio representativo bombeamento da faringe comparando um mutante supressor (Mut1) e um mutante de intensificador (Mut2) com o tipo selvagem, a duas concentrações de clozapina. Clozapina exposição reduz as taxas de bombeamento da faringe das estirpes de tipo selvagem e mutante de uma forma dependente da concentração. No entanto, a velocidade de bombeamento da faringe diminuiu de Mut1 é menor do que a do tipo selvagem, enquanto que a velocidade de bombeamento da faringe diminuiu de Mut2 é maior do que a do tipo selvagem.
Figura 1. Demonstração de atraso e a letalidade do desenvolvimento induzido pela clozapina. Animais de tipo selvagem (N2) cultivadas em um controle Placa NGM (a) e em uma placa NGM suplementado com 200 ug / ml (612 pM) clozapina (b). (C) Um resultado representativo do ensaio demora / letalidade desenvolvimento mostrando o efeito da clozapina com o tipo selvagem (N2), um mutante supressor (Mut1), e um mutante de intensificador (Mut2). As imagens (a) e (b) são reimpressos < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > de Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (julho , 2009). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 2. Demonstração da inibição induzida pela clozapina de bombeamento da faringe. Um resultado típico para o ensaio de bombeamento da faringe que mostra o efeito da clozapina com o tipo selvagem (N2), um mutante supressor (Mut1), e um mutante de intensificador (Mut2). Os dados foram analisados com ANOVA de duas vias, utilizando o software estatístico R. programa Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Tabela 1. Preparação de solução de trabalho da clozapina. A quantidade é de 4 poços para cada concentração.
| Concentração Clozapina | 0 mM | 300 uM | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| Solução HAC | 270 mL | 270 mL | 270 mL | 270 mL |
| Solução estoque Clozapina | - | 30 ul | 40 ul | 50 ul |
| DMSO | 50 ul | 20 ul | 10 ul | 0 mL |
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Discussion
Aqui, descrevemos métodos para testar os efeitos de APDs sobre o desenvolvimento e comportamento de C. elegans. DMSO ou o etanol é usado para dissolver a clozapina, uma vez que o fármaco é relativamente insolúvel em água. Porque os solventes foram relatados para afectar C. elegans biologia 12, grupos de controle de etanol-alone DMSO-alone ou são essenciais. A concentração mais elevada de DMSO utilizada nos ensaios é superior a 3%, o que não tem um efeito óbvio sobre C. elegans desenvolvimento. DMSO podem ser utilizados para muitas moléculas pequenas, ou mesmo algumas moléculas grandes, por exemplo, ácidos de lípidos.
As concentrações de DPA utilizados nestes ensaios são maiores do que os indicados para os seres humanos. Isso é comum para a maioria dos estudos de moléculas pequenas em C. elegans, uma vez que são necessárias concentrações elevadas para a penetração da C. elegans cutícula. Estudos de HPLC indicam que os níveis de clozapina em C. tecido elegans no assa desenvolvimentoy são próximos aos esperados nos cérebros humanos 2.
A penetração na cutícula é uma preocupação particular para estudos de moléculas grandes. Os mutantes com defeitos na barreira cutícula, como ACS-20 mutantes e Bus (B acterially U n-S wollen) mutantes, oferecem uma abordagem para contornar este problema 13. Mutantes Bus foram isolados com base na sua resistência à infecção pelo agente patogénico nematophilum Microbacterium. Por exemplo, os alelos fracos de barramento-8 demonstram que este gene tem um papel na produção de superfície da cutícula. Estes mutantes são resistentes à infecção, pois a bactéria não pode ligar-se à superfície de acolhimento. É importante ressaltar que a interrupção da formação de cutícula também provoca aumento da sensibilidade às drogas neste fundo genético 14.
O ensaio de desenvolvimento descrito aqui pode ser ampliada para as telas genéticos em grande escala através da realização do ensaio em cultu líquidore. Por interferência de ARN de todo o genoma telas (RNAi), por exemplo, o protocolo é semelhante ao descrito acima, mas que alimentam as bactérias RNAi é substituído por bactérias OP50 15. O ensaio de cultura de líquido requer uma concentração de fármaco mais baixa do que o ensaio de placa (observação não publicada). Nosso laboratório realizou uma tal tela RNAi do genoma para supressores de atraso no desenvolvimento induzida por clozapina e obteve 40 supressores de uma tela de ~ 17.000 C. elegans genes 8.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse envolvidos.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pelo NIH um prêmio Desenvolvimento Scientist Clínica K08NS002083, um Grant Instituto de Pesquisa Shervert Frazier, e uma Investigator Award NARSAD Young para Edgar A. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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