Summary
घातक ग्लियोमास अलग नैदानिक और आणविक सुविधाओं के साथ अत्यधिक घुसपैठ दार ग्लियल नियोप्लाज्म्स का एक विषम समूह है। प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में घातक ग्लियोमा उपप्रकारों की हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक विशेषताओं को फिर से अपडेट करते हैं।
Abstract
घातक ग्लियोमास अलग नैदानिक और आणविक सुविधाओं के साथ अत्यधिक घुसपैठ दार ग्लियल नियोप्लाज्म्स का एक विषम समूह है। प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में घातक ग्लियोमा उपप्रकारों की हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक विशेषताओं को फिर से अपडेट करते हैं। प्रत्यारोपण परख में डब्ल्यूएचओ ग्रेड III और चतुर्थ घातक ग्लियोमा के मॉडल के लिए, मानव ट्यूमर कोशिकाओं को इम्यूनोकॉम् वादा किए गए चूहों के एक ऑर्थोटोपिक साइट, मस्तिष्क में ज़ेनोबेड़ा किया जाता है। सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करने वाले माध्यमिक ज़ेनोग्राफ्ट के विपरीत, मानव ग्लियोमा कोशिकाओं को पुनः प्राप्त नमूनों से अलग किया जाता है और प्राथमिक ज़ेनोग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए ऊतक संस्कृति में पूर्व मार्ग के बिना प्रत्यारोपित किया जाता है। इस रिपोर्ट में प्रक्रिया ट्यूमर नमूना तैयारी, इम्यूनोसमझौता चूहों में इंट्राक्रैनियल प्रत्यारोपण, ट्यूमर engraftment और प्राप्तकर्ता जानवरों या विश्लेषण में बाद में पारित होने के लिए ट्यूमर कटाई के लिए निगरानी विवरण । ट्यूमर सेल तैयार करने के लिए 2 घंटे की आवश्यकता होती है और सर्जिकल प्रक्रिया के लिए 20 मिनट/पशु की आवश्यकता होती है ।
Introduction
घातक ग्लियोमास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्राथमिक ग्लियल ट्यूमर होते हैं जो मस्तिष्क में होते हैं और कभी-कभी रीढ़ की हड्डी। ग्लियोमास को विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स या एपेंडिमल कोशिकाओं के लिए हिस्टोलॉजिक समानता के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है और फिर द्रोह की विकृति के लिए संख्यात्मक रूप से वर्गीकृत (आई से चतुर्थ) होता है। सबसे आम हिस्टोलॉजिक उपप्रकार एस्ट्रोसाइटोमा, ओलिगोडेन्ड्रोग्लियोमा और मिश्रित ओलिगोस्ट्रोसाइटोमा हैं। डब्ल्यूएचओ ग्रेड द्वितीय से चतुर्थ तक शामिल घातक ग्लियोमास को आक्रामक विकास और वर्तमान उपचारों के लिए अड़ियल की विशेषता है। संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल, लगभग 15,750 व्यक्तियों को एक घातक ग्लियोमा का निदान किया जाता है और अनुमानित 12,740 रोगी इस बीमारी का शिकार होते हैं। ये आंकड़े घातक ग्लियोमा की विशेष रूप से घातक प्रकृति और बढ़ी हुई चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता को उजागर करते हैं ।
कैंसर मॉडल ट्यूमर जीव विज्ञान और चिकित्सा की जांच के लिए आवश्यक हैं। मानव कैंसर सेल लाइनें इन विट्रो जोड़तोड़ के लिए और वीवो ज़ेनोबेड़ाइंग अध्ययन (माध्यमिक ज़ेनोबेड़ा)1में एक महत्वपूर्ण पहला कदम का प्रतिनिधित्व करती हैं। हालांकि, मानक कैंसर सेल संस्कृतियों को फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक परिवर्तन2-4 से गुजरना पड़ता है जिसे माध्यमिक ज़ेनोग्राफ्ट5में बहाल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के आइसोसेट डेहाइड्रोजनेज(आईडीएच)उत्परिवर्तन 6, अलग स्टेम सेलआबादी 7और प्रमुख सिग्नलिंगरास्तों पर निर्भरता8 कैंसर सेल संस्कृतियों में खो जा सकते है के रूप में आनुवंशिक परिवर्तन । जीनोमिक प्रोफाइल कैंसर क्षेत्र संस्कृति में बेहतर हद तक बनाए रखा जा सकता है, हालांकि अभी भी पूरी तरह से प्राथमिक ट्यूमर2,3के जीनोटाइप दर्पण करने में विफल । प्रत्यक्ष ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण इन विट्रो संस्कृति के प्रभावों को नकारता है, एक उचित माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करता है, और ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं की अखंडता को बरकरार रखता है9,10। इसलिए, प्राथमिक ज़ेनोग्राफ्ट भविष्य के नैदानिक परीक्षणों5,11,12के तर्कसंगत डिजाइन में सहायता करने के लिए लक्षित एजेंटों के कड़ाई से परीक्षण के लिए एक शक्तिशाली और प्रासंगिक प्रीक्लिनिकल मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं।
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Protocol
1. ट्यूमर सेल निलंबन की तैयारी
नोट: रोगी सामग्री और जानवरों के उपयोग के लिए उचित संस्थागत अनुमोदन प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ग्लियोमा ज़ेनोग्राफ्ट को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। वैंडरबिल्ट विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र में, नैदानिक प्रयोजनों के लिए आवश्यक है कि से अधिक है कि पुनः प्राप्त ट्यूमर सामग्री एक अनुसंधान ऊतक भंडार के लिए रोगी की सहमति के साथ एकत्र किया जाता है । नमूनों को यादृच्छिक 5-अंकों के रीडकैप डेटाबेस नंबर के साथ लेबल किया जाता है और सभी रोगी-विशिष्ट पहचानकर्ताओं को हटा दिया जाता है। REDcap डेटाबेस ऊतक भंडार में प्रत्येक नमूने के लिए deidentified नैदानिक डेटा होता है कि लिंग, उंर (साल में), दौड़, अस्तित्व की स्थिति, विकृति, कैंसर उपचार, resection के वर्ष, और प्रगति के लिए समय भी शामिल है । प्राथमिक ज़ेनोबेड़ा विधि की बंध्यता को बनाए रखने और सफलता का अनुकूलन करने के लिए, सभी अभिकर्दक, भाप-ऑटोक्लेव सर्जिकल उपकरण, और शल्य चिकित्सा साइट को पहले से इकट्ठा या तैयार किया जाना चाहिए।
नोट: ग्लियोमा नमूनों में अक्सर बड़ी मात्रा में मायलिन और मलबे होते हैं। नमूना आकार के आधार पर, मायलिन और मलबे को पर्याप्त रूप से हटाने के लिए 4 से अधिक असतत ढाल ट्यूबों का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है।
नोट: प्रक्रिया पूरी हो जाती है जब कोई, या कम, स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले असितीय ऊतक शेष होते हैं। ट्रिट्यूशन प्रक्रिया के दौरान बुलबुले की शुरूआत से बचें।
नोट: वियोजन के बाद सेल व्यवहार्यता आमतौर पर >90% होती है। कम वायाबिलिटी ऑपरेटिंग रूम, क्रायोप्रिजर्वेशन मेथड, या पैपिन डिससोशेशन तकनीक से सबऑप्टिमल टिश्यू हैंडलिंग या ट्रांसपोर्ट टाइम सहित कई चरों को प्रतिबिंबित कर सकती है। कम सेलुलर वायाबिलिटी अभी भी पर्याप्त हो सकती है, हालांकि, जब तक उचित मात्रा में पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य प्रत्यारोपित किया जा सकता है। प्रत्येक माउस के लिए, 50,000-200,000 व्यवहार्य कोशिकाओं को 2 माइक्रोन की मात्रा में प्रत्यारोपित किया जाता है। सिरिंज सुई के बेवल टिप के कारण, प्रत्येक इंजेक्शन के लिए सिरिंज में पर्याप्त सामग्री तैयार की जा सकती है, यह सुनिश्चित करने के लिए अंतिम मात्रा में सेल निलंबन का एक अतिरिक्त 5 माइक्रोन शामिल किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 5 चूहों के लिए 2 μl/माउस इंजेक्ट करने के लिए अंतिम मात्रा 15 माइक्रोल (15 माइक्रोल = (5 x 2 माइक्रोल) + 5 माइक्रोन होना चाहिए।
- प्रयोगशाला में परिवहन के लिए बर्फ पर एक बाँझ, छाया कंटेनर में हौसले से पुनः प्राप्त, deidentified रोगी सामग्री रखें । नमूने को सीधे प्रत्यारोपण या क्रायोप्रिजर्वर्व के लिए तरल नाइट्रोजन में नमूने को संसाधित करें (नीचे देखें) तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए और बाद में उपयोग करें।
- निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए किट घटकों और निर्देशों के साथ बाँझ हुड में पैपिन वियोजन समाधान (पापीन समाधान, वॉश/प्रोटीज अवरोधक समाधान और असतत ढाल समाधान) तैयार करें। बाँझ 15 मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन शंकु नलियों को लेबल करें और समाधानों को इस प्रकार वितरित करें:
- ट्यूब 1: 5 मिलीलीटर पापीन समाधान
- ट्यूब 2: 3 मिलीलीटर वॉश/प्रोटीज़ अवरोधक समाधान
- ट्यूब 3-6: 5 मिलीलीटर असतत ढाल समाधान के प्रत्येक
- ट्यूब 1 में ग्लियोमा नमूना 5 मिलीलीटर पापीन समाधान के साथ रखें और 10-20 मिनट की समय अवधि में 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ ट्राइटरेट करें।
- सामग्री को 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें और फिर ट्रिट्यूशन के अगले चक्र को शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए सामग्री को इनक्यूबेट करें।
- 5 मिली लीटर पिपेट की नोक को ट्रिट्यूशन के प्रत्येक चक्र के साथ शंकु नली के नीचे के करीब रखें ताकि टिप पिछले 2 चक्रों के लिए ट्यूब के नीचे को छू सके।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट निकालें और धोने के 3 मिलीलीटर में 10x ऊपर और नीचे गोली पिपेट/
- ध्यान से 5 मिलीलीटर असतत ढाल समाधान (ट्यूब 3-6) में से प्रत्येक पर निलंबन की एक समान मात्रा परत, एक पाइपटटर "गुरुत्वाकर्षण" वितरण गति पर सेट के साथ ।
- ट्यूबों को झूलते-बाल्टी रोटर से लैस एक अपकेंद्रित्र में रखें, जिसमें त्वरण गति सबसे कम सेटिंग तक कम हो गई और ब्रेक बंद हो गया। कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए 76 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ब्रेक बंद होने के साथ, अपकेंद्रित्र आम तौर पर 20 मिनट के बाद पूरा हो जाता है।
- सुपरनैंट निकालें, रिसिपेंड करें और प्रत्येक गोली को 5 मिलीलीटर बाँझ संतुलित नमक समाधान में मिलाएं और कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
- कोशिका निलंबन के एक हिस्से (10-100 माइक्रोन) को हटा दें और हीमोसाइटोमीटर के साथ नीले बहिष्कार को ट्राइपैन करके व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण करें।
- 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनैंट निकालें और सेल पेलेट को 25,000-125,000 व्यवहार्य कोशिकाओं प्रति माइक्रोन के घनत्व पर फिर से खर्च करें।
- सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा को 200 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (पीसीआर ट्यूब) में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
2. सर्जिकल साइट और उपकरणों की तैयारी
नोट: प्रक्रिया के दौरान बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहने जाते हैं। प्रत्येक संस्थान की आवश्यकताओं के आधार पर, सर्जिकल गाउन, टोपियां और चेहरा गार्ड की आवश्यकता हो सकती है।
- जानवरों की तैयारी, ऑपरेटिंग फील्ड और पशु वसूली के लिए अलग आसपास के क्षेत्रों के साथ कृंतक सर्जरी के लिए एक कीटाणुरहित बेंचटॉप तैयार करें।
- एक भाप ऑटोक्लेव में सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें। इसके बाद, एक जानवर से अगले करने के लिए संक्रमण करते समय उपकरणों को फ्लैश-स्टरलाइज करने के लिए एक गर्म मनका स्टरलाइजर का उपयोग करें।
3. इंडक्शन, एनेस्थीसिया, और एनाल्जेसिया
नोट: चूहों के एनेस्थेटाइज्ड होने के समय से 15 मिनट से अधिक की सर्जरी के लिए संपर्क गर्मी स्रोत की आवश्यकता होती है। हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, चूहों को पूर्व और पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि के दौरान एक गर्मी स्रोत (गर्म पानी के कंबल परिसंचारी) के साथ प्रदान किया जाता है।
- इंडक्शन एनेस्थीसिया के लिए केटामाइन/जाइलाज़ीन कॉकटेल तैयार करें ताकि प्रत्येक माउस को शरीर के वजन के प्रति ग्राम कॉकटेल के 10 माइक्रोन का इंजेक्शन देकर केटामाइन १०० मिलीग्राम/किलोग्राम और जाइलाजिन 10 मिलीग्राम/किलोग्राम प्राप्त हो ।
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तालिका 1. एनेस्थीसिया कॉकटेल।
स्टॉक एकाग्रता मात्रा के लिए तैयार करने के लिए एक माउस पांच चूहे दस चूहे केटामाइन 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर 25 माइक्रोन 125 माइक्रोन 250 माइक्रोन जाइलाज़ीन 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर 2.5 माइक्रोन 12.5 माइक्रोन 25 माइक्रोन आइसोटोनिक नमकीन 223 माइक्रोन 1,113 माइक्रोन 2,225 माइक्रोन कुल 250 उल 1,250 माइक्रोन 2,500 माइक्रोन - बाँझ, पायजन मुक्त पानी में स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम/मिलीलीटर) 1:20 को कमजोर करके एनाल्जेसिया के लिए केटोरोफेन समाधान तैयार करें ताकि प्रत्येक माउस शरीर के वजन के प्रति ग्राम समाधान के 10 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा 5 मिलीग्राम/किलो की खुराक प्राप्त करे ।
- वजन और पूर्वसर्जन वजन रिकॉर्ड। व्यक्तिगत माउस वजन भिन्न होते हैं, लेकिन आम तौर पर 18-22 ग्राम से होते हैं।
- इंसुलिन सिरिंज के साथ इंट्रापेरिटोनियल स्पेस में माउस बॉडी वेट के प्रति ग्राम केटामाइन/जाइलाज़ीन कॉकटेल के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें । उदाहरण के लिए, 20 ग्राम माउस के लिए 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- निर्धारित करें कि माउस पूरी तरह से पिछले पैर के पैर की अंगुली चुटकी द्वारा एनेस्थेटाइज्ड है या नहीं। यह आम तौर पर माउस के लिए 3-5 मिनट लेता है अब चुटकी से वापस लेने के लिए ।
- इंसुलिन सिरिंज के साथ पार्श्व की ढीली त्वचा में माउस शरीर के वजन के प्रति ग्राम केटोप्रोफेन समाधान के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें। उदाहरण के लिए, 20 ग्राम माउस के लिए 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- कतरनी के साथ खोपड़ी पर बाल दाढ़ी, एक कपास टिप एप्लिकेटर का उपयोग कर povidone-आयोडीन के साथ उजागर खोपड़ी साफ़ और फिर एक शराब पैड पोंछ । इन स्टेप्स को दोहराएं, पोविडोन-आयोडीन स्क्रब और अल्कोहल वाइप, दो बार और।
- माउस की आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- एक 1 सेमी मिडलाइन चीरा कान के पीछे से सिर्फ एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ आंखों के सामने करने के लिए विस्तार करें ।
- माउस को विच्छेदन दायरे में रखें और सीवन लाइनों की पहचान करने के लिए खोपड़ी का पर्दाफाश करें। ड्रिल के साथ परिपत्र गति का उपयोग करके, एक बर्र होल 2.5 मिमी पार्श्व को ब्रेग्मा और 1 मिमी पीछे कोरोनल सीवन में केंद्र करें।
4. इंट्राक्रैनियल प्रत्यारोपण
नोट: इंजेक्शन की मात्रा 2.5 माइक्रोन से अधिक चूहों के लिए घातक हो सकती है।
- छेदक बार पर ऊपरी छेदियों को हुक करके और नाक क्लैंप को लागू करके एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर माउस की स्थिति रखें ताकि खोपड़ी को तटस्थ स्थिति में दृढ़ता से आयोजित किया जा सके।
- निलंबन मिश्रण और बुलबुले को खत्म करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक जोड़तोड़ के जांच धारक में क्लैंप किए गए 10 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज में कई बार माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं के 5-10 माइक्रोन को ड्रा करें। प्लंजर को दबाना ताकि सिरिंज 2 माइक्रोन (एक जानवर को इंजेक्ट करने के लिए पर्याप्त मात्रा) से भरी हुई हो।
- बर्र छेद को बेनकाब करने के लिए त्वचा चीरा के पार्श्व किनारे खींचें और, माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ, सुई को बर्र छेद में पेश करें ताकि बेवलित हिस्सा खोपड़ी की सतह के ठीक नीचे हो।
- सुई को 3 मिमी आगे बढ़ाएं और फिर इंजेक्शन के लिए जगह बनाने के लिए सुई 0.5 मिमी वापस लें।
- प्लंजर को धीरे-धीरे 30 सेकंड से अधिक आगे बढ़ाते हैं और फिर सुई को अतिरिक्त 2 मिनट के लिए मस्तिष्क में रहने की अनुमति देते हैं। 0.5 मिमी आरोही और मस्तिष्क से सुई को हटाने से पहले एक अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए इंतजार कर के धीरे-धीरे सुई वापस ले लें।
- स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें और एक ऑटोक्लिप के साथ घाव को बंद करें।
- शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस को एक वार्मिंग पैड पर रखें और लगातार श्वसन पैटर्न और म्यूकस झिल्ली और उजागर ऊतकों (पैरों के तलवों) के रंग की निगरानी करें।
- माउस को एक बाँझ माइक्रोइसोलेटर पिंजरे में रखें एक बार यह संज्ञाहरण (स्टर्नल और आंचल) से पूरी तरह से ठीक हो जाता है, और इसे पशु आवास सुविधा में वापस कर देता है।
5. प्रत्यारोपण पशु देखभाल और अवलोकन के बाद
नोट: ट्यूमर engraftment और घुसपैठ के विकास का सबसे विश्वसनीय संकेत धीरे, निरंतर वजन घटाने कूबड़ मुद्रा और किसी न किसी बाल कोट के विकास के साथ है । दुर्लभ अवसरों पर, न्यूरोलॉजिकल घाटे का उल्लेख किया जाता है जिसमें एटैक्सिया, पैरेसिस और दौरे शामिल हैं। ऑर्थोटोपिक प्राथमिक ज़ेनोग्राफ्ट अत्यधिक आक्रामक होते हैं और लंबे समय तक विकसित होते हैं। चूहों आमतौर पर प्रत्यारोपण के बाद 3-6 महीने ट्यूमर विकास के लक्षण प्रकट करते हैं।
- चीरा साइट पर भोजन और पानी के सेवन, व्यवहार, सौंदर्य और संक्रमण के संकेतों के लिए प्रतिदिन ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट के साथ चूहों का निरीक्षण करें।
- यदि दर्द या संकट को पश्चात रूप से मनाया जाता है तो केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किलोग्राम एक दिन में, 1-2x) का प्रबंध करें।
- सर्जरी के 8-10 दिन बाद ऑटोक्लिप्स निकालें।
- चूहों का वजन साप्ताहिक।
- ट्यूमर एनग्रेफ्टमेंट के संकेतों और लक्षणों के लिए मॉनिटर करें।
6. ट्यूमर हार्वेस्टिंग
नोट: इस विधि से, पहले कोरोनल स्लाइस (#1) में घ्राण बल्बों के पीछे के पहलू और ललाट पालि के पूर्वकाल पहलू शामिल हैं। Engrafted ट्यूमर बाद के 3 कोरोनल स्लाइस (स्लाइस #2, #3, और #4) के सही गोलार्द्ध में सबसे प्रचुर मात्रा में है और इंजेक्शन दृष्टि नियमित रूप से कोरोनल स्लाइस #3 में निहित है । प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर, सामग्री का उपयोग ट्यूमर मार्ग, जमे हुए ऊतक वर्गों, फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक वर्गों, अलग ऊतकों के प्रवाह साइटोमेट्री, सेल संस्कृति या डीएनए, आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए लाइसेट्स के लिए किया जा सकता है। ट्यूमर के कुछ हिस्सों को 80-95% से लेकर सेल व्यवहार्यता के साथ भविष्य की जरूरतों के लिए क्रायोप्रीयरेय किया जा सकता है।
- कार्बन डाइऑक्साइड के लंबे समय तक संपर्क में रहने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु।
- सर्जिकल कैंची की एक बड़ी जोड़ी के साथ मस्तिष्क (foramen मैग्नम स्तर) के आधार पर इच्छामृत्यु चूहों को काटना, और पूरी तरह से खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए चीरा से त्वचा को आगे खींचें।
- मस्तिष्क को हटा दें।
- खोपड़ी के बाईं ओर ऑक्सीपिटल हड्डी को काटने के लिए बाएं बाहरी श्रवण मीटस के स्तर तक फोरमेन मैग्नम के पार्श्व पहलू में ठीक सर्जिकल कैंची की जोड़ी की एक टिप डालें। दाईं ओर एक ही कट का प्रदर्शन करें।
- एक बाहरी श्रवण मीटस से दूसरे में कोरोनल विमान के साथ ऑक्सीपिटल हड्डी काटें और सेरिबैलम को बेनकाब करने के लिए हड्डी को हटा दें।
- नाक की हड्डी की प्लेटों को आंखों के बीच काट लें।
- नाक की हड्डी प्लेटों से ब्रेग्मा के लिए sagittal सीवन के साथ पीछे से काटकर sagittal सीवन काटें। लैम्ब्डा से ब्रेग्मा तक पूर्वकाल में काटकर सगितल सीवन के साथ मिडलाइन चीरा पूरा करें।
- ध्यान से मस्तिष्क के लिए खोपड़ी के किसी भी ड्यूरल आसंजन आंसू और फिर मस्तिष्क और घ्राण बल्ब dorsally बेनकाब करने के लिए बाद में दो खोपड़ी आधा छील करने के लिए प्रत्येक पक्ष पर sagittal खोलने के साथ संदंश की एक अच्छी जोड़ी की नोक डालें ।
- किसी भी आसंजन को मुक्त करने के लिए घ्राण बल्ब और खोपड़ी के वेंट्रल पहलू के बीच संदंश स्लाइड करें।
- खोपड़ी को वापस झुकाएं ताकि मस्तिष्क को मुकर जाने दिया जा सके ताकि ऑप्टिक और अन्य कपाल तंत्रिकाएं उजागर हो सकें। कपाल नसों को तोड़ने के लिए एक बाँझ PBS युक्त पकवान में मस्तिष्क जारी ।
- एक वजन स्पैटुला के साथ मस्तिष्क को मैट्रिक्स स्लाइसर में स्थानांतरित करें और रेजर ब्लेड के साथ 2 मिमी कोरोनल स्लाइस उत्पन्न करें।
- आगे दृश्य निरीक्षण और आगे ऊतक प्रसंस्करण के लिए बाँझ PBS युक्त पकवान में कोरोनल स्लाइस की व्यवस्था करें।
7. ट्यूमर क्रायोप्रिजर्वेशन
- क्रायोप्रिजर्वेशन मीडियम का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें।
- प्रसार पूरक के 50 मिलीलीटर, 100x पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और 0.2% हेपरिन के 450 μl बेसल माध्यम के लिए।
- प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर करें।
- क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम का एक कार्य समाधान तैयार करें।
- 50 मिली पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में 47.5 मिलीलीटर क्रायोप्रिजर्वेशन मीडियम और 2.5 मिलीलीटर बाँझ डीएमएसओ मिलाएं और अच्छी तरह से मिलाएं।
- प्रत्येक क्रायोवियल के लिए काम समाधान के 1.0 मिलीलीटर और प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक 2 मिमी कोरोनल स्लाइस ज़ेनोबेड़ा मस्तिष्क को बर्फ पर क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम युक्त क्रायोवियल में रखें।
- शीशी को कसकर कैप करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें। अगले दिन क्रायोवियल को लंबे भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
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Representative Results
वियोजन ग्लियोमा कोशिकाओं को प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्रॉफ्ट लाइनों को प्राप्त करने के लिए इम्यूनोसमझी चूहों के दिमाग में सीधे प्रत्यारोपित किया जाता है। प्रत्येक ट्यूमर नमूना प्रत्यारोपण से पहले एक यादृच्छिक संख्या सौंपा है, deidentification प्रक्रिया के भाग के रूप में संरक्षित स्वास्थ्य जानकारी को दूर करने के लिए । हम इस उद्देश्य के लिए 5 अंकों की रीडकैप डेटाबेस संख्या का उपयोग करते हैं। चित्र 1 एक ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम 17182) से आइसोसिएट डेहाइड्रोजनेज़ 1 (आईडीएच 1) उत्परिवर्तन आर्जिनिन 132 से हिस्टिडीन (आर 132एच) से एक ज़ेनोबेड़ा लाइन स्थापित करने के लिए प्रक्रिया और नामकरण दिखाता है। प्रत्यारोपण के बाद एक "एक्स" ट्यूमर पहचान संख्या में जोड़ा जाता है xenografted ट्यूमर निरूपित करने के लिए, एक "पी" के बाद पारित होने की संख्या को ट्रैक करने के लिए । पी 0 प्रारंभिक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता को नामित करता है और पी 1 पहले ज़ेनोबेड़ा मार्ग के प्राप्तकर्ता चूहों को नामित करता है। आमतौर पर, 3-5 चूहों को शुरू में एक लाइन स्थापित करने के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है और ज़ेनोबेड़ा ट्यूमर को भविष्य के अध्ययनों के लिए लाइन का विस्तार करने के लिए 10 प्राप्तकर्ता चूहों (पी1) में पारित किया जाता है।
ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के बाद, प्राप्तकर्ता चूहों को ट्यूमर एनग्रेफ्टमेंट और विकास के संकेतों और लक्षणों के लिए निगरानी की जाती है। ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट का सबसे संवेदनशील संकेत महत्वपूर्ण और निरंतर वजन घटाने है। चूंकि चूहों को कम उम्र में प्रत्यारोपित किया जाता है, इसलिए पोस्ट-ऑपरेटिव वजन बढ़ने की उम्मीद है । माउस वजन सप्ताह से सप्ताह के लिए प्रतीत होता है नाटकीय फैशन में उतार चढ़ाव हो सकता है, लेकिन अधिक से अधिक 3 ग्राम के निरंतर नुकसान आम तौर पर ट्यूमर engraftment का एक अच्छा संकेत है । आमतौर पर, एक ज़ेनोबेड़ा पलटन में अधिकांश चूहों ट्यूमर के आधार पर 350 दिनों तक 60 दिनों तक कम समय तक वजन घटाने का विकास करते हैं। एक दिया ट्यूमर के लिए औसत अस्तित्व के समय आम तौर पर पारित होने से पारित होने के समान है जब ट्यूमर कोशिकाओं की एक ही संख्या हर बार प्रत्यारोपित कर रहे हैं । चित्रा 2 में सचित्र 5 चूहों की एक पलटन है जो एक GBM (17182XP2) के साथ प्रत्यारोपित किया गया था जो पहले एक बार जुड़ा हुआ था और एक बार पहले पारित हो गया था। पांच 17182XP2 चूहों में से चार प्रत्यारोपण के बाद 17 सप्ताह महत्वपूर्ण वजन घटाने का प्रदर्शन किया । शेष माउस (माउस 3) वजन घटाने का प्रदर्शन नहीं किया और कोई ट्यूमर पोस्टमार्टम परीक्षा में पाया गया था, प्राप्तकर्ताओं के केवल ८०% में ट्यूमर engraftment का संकेत है ।
जब एक रोगसूचक माउस के मस्तिष्क काटा जाता है, एक मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक अत्यंत मूल्यवान उपकरण है। प्रत्येक मस्तिष्क से कई, शारीरिक रूप से परिभाषित वर्गों की पीढ़ी कुछ भागों और ऊतक के अन्य भागों के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ विश्लेषण के कई तरीकों के लिए अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, आईडीएच1 की उत्परिवर्तनीय स्थिति का आकलन एक भाग से सामग्री के साथ सेंगर अनुक्रमण या दूसरे(चित्र 3)के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा किया जा सकता है। कोरोनल खंडों के दृश्य निरीक्षण से ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट आसानी से स्पष्ट हो सकता है, हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ हिस्टोलॉजी कुछ ज़ेनोग्राफ्ट(आंकड़े 4 और 5)के लिए आवश्यक हो सकता है। धारावाहिक पारित होने या अन्य अध्ययनों के लिए एक ज़ेनोबेड़ा को अलग करते समय, सामग्री के एक छोटे और परिभाषित हिस्से के साथ यह महत्वपूर्ण शुरुआत है ताकि माइलिन और मलबे को पर्याप्त रूप से हटाया जा सके(चित्र 6)। पापिन वियोजन प्रणाली का असतत ढाल वयस्क माउस मस्तिष्क के छोटे हिस्सों को संसाधित करने के लिए सबसे उपयुक्त है। हम मिडलाइन के साथ प्रत्येक कोरोनल अनुभाग को काटने और प्रत्येक छमाही के लिए दो असतत ढाल का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
चित्रा 1. प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्रॉफ लाइनों को इम्यूनोसमझी चूहों के दिमाग में सीधे अलग ग्लियोमा कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके स्थापित किया जाता है और फिर धारावाहिक प्रत्यारोपण द्वारा विस्तारित किया जाता है। आईडीएच1 जीन के आर्जिनिन 132 में हेट्रोज़िगस दैहिक उत्परिवर्तन 70% से अधिक फैलाना एस्ट्रोसाइटोमा, ओलिगोडेन्ड्रोग्लियोमा, ओलिगोस्ट्रोसाइटोमा और माध्यमिक ग्लियोब्लास्टोमा के 7% से कम में होते हैं। जीबीएम 17182 में सबसे आम आईडीएच1 म्यूटेशन, आर्जिनिन 132 से हिस्टिडीन (R132H) शामिल है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2। जीबीएम 17182XP1 के धारावाहिक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के विकास घटता 5 GBM 17182XP2 चूहों में से 4 में सर्जरी के बाद महत्वपूर्ण वजन घटाने 130-150 दिनों का प्रदर्शन । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3। रोगी ट्यूमर (जीबीएम 17182) और प्राथमिक ज़ेनोग्राफ (17182XP0) में विषम आईडी 1 आर 132एच उत्परिवर्तन का पता सेंगर अनुक्रमण या एंटीबॉडी धुंधला द्वारा लगाया जा सकता है। एक IDH1 R132H विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री रक्त वाहिकाओं के आसपास या रोगी नमूने और माउस मस्तिष्क के अधिक फैलाना घुसपैठ क्षेत्रों में उत्परिवर्ती ग्लियोमा कोशिकाओं को दर्शाता है । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4. प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट अत्यधिक घुसपैठ वृद्धि प्रदर्शित करते हैं जिसे अकेले हेमैटोक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) दाग द्वारा पूरी तरह से सराहना करना मुश्किल हो सकता है। मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री मानव कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी तरीका है। एंटी-ह्यूमन विमेंटिन एक एनालप्लास्टिक ओलिगोस्ट्रोसाइटोमा ज़ेनोग्राफ्ट (14175XP2) के विशिष्ट विशेषताओं का पता चलता है जिसमें एक डिफ्यूज ट्यूमर द्रव्यमान के साथ घुसपैठ की गई ग्लियोमा कॉर्पस कैलोसम (एस्टेरिस) और स्ट्राइटोपल्लील फाइबर (ब्लैक एरोहेड) और लेप्टोमेनेनेगल प्रसार (काला तीर) के माइलिनेटेड ट्रैक्ट के साथ सही गोलार्द्ध और आक्रामक विकास का इंजेक्शन लगाया। इस आवर्धन (1.25X) पर सराहना नहीं की गई है, जो हमला किए गए कॉर्टेक्स में माउस न्यूरॉन्स (पेरिनेरोर्नल सैटेलिटोसिस) के आसपास मानव ट्यूमर कोशिकाओं का क्लस्टरिंग है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5। बॉक्स्ड क्षेत्रों में उच्च शक्ति (40X) में एनालप्लास्टिक ओलिगोस्ट्रोसाइटोमा 14175XP2 कोरोनल खंडों का विश्लेषण ए-सी रक्त वाहिकाओं (क्षेत्र ए) के आसपास आईडीएच उत्परिवर्ती मानव कोशिकाओं का पता चलता है, स्ट्राइटोपल्लीडल ट्रैक्ट्स ("पेंसिल फाइबर;" क्षेत्र बी) और कॉर्पस कैलोसम (क्षेत्र सी)। जीबीएम 17182XP2 के साथ, आईडीएच1 आर132एच एनाप्लास्टिक ओलिगोस्ट्रोसाइटोमा 14175XP2 का धुंधला दर्शाता है कि प्राप्तकर्ता चूहों में सीरियल मार्ग के बाद प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट में आईडीएच उत्परिवर्तन बनाए रखा जाता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6. मानव ट्यूमर कोशिकाओं को आकार के आधार पर अलग xenografts में माउस कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। धारावाहिक मार्ग के लिए एक अलग xenograft में मानव ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, मानव कोशिकाओं को उनके बड़े आकार और गहरे हरे रंग की चिकनाई (तीर) द्वारा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत एक हीमोसाइटोमीटर में पहचाना जाता है । प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा, मानव कोशिकाओं में माउस सामग्री से अलग स्कैटर गुण होते हैं और आगे के विश्लेषण के लिए गेट किया जा सकता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सुसंस्कृत सेल लाइनें, ज़ेनोग्राफ्ट और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे ग्लियोमा मॉडलिंग के लिए सबसे आम तरीके हैं, और प्रत्येक मॉडल प्रणाली3,13,14के लिए अलग-अलग लाभ और सीमाएं हैं। प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ग्लियोमा ज़ेनोग्राफ्ट के प्रासंगिक लाभों में घुसपैठ विकास शामिल है जो फैलाना ग्लियोमा और आनुवंशिक परिवर्तन और महत्वपूर्ण सिग्नलिंग तंत्र को बनाए रखता है जो सुसंस्कृत ग्लियोमा कोशिकाओं में बनाए रखने के लिए बेहद मुश्किल हो सकता है। उदाहरण के लिए, मैंसोसिएटर डिहाइड्रोजनेज़ म्यूटेशन और सोनिक हेजहोग लिगांड उत्पादन प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट15,16 में बनाए रखा जा सकता है लेकिन केवल शायद ही कभी सुसंस्कृत ग्लियोमा कोशिकाओं में14,17-19। हालांकि, प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट के महत्वपूर्ण नुकसान पर विचार करना महत्वपूर्ण है। पर्याप्त रोगी सामग्री तक पहुंच के बावजूद, विषमपोनिक साइट की तुलना में मस्तिष्क में समय के साथ ग्लियोमा विकास को मापना अधिक कठिन है। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट हेट्रोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट की तुलना में काफी धीमी दर से बढ़ते हैं। इस प्रकार जांचकर्ता कोशिकाओं को इम्यूनोसमझौता माउस के पार्श्व में प्रत्यारोपण करना पसंद कर सकते हैं, जहां महत्वपूर्ण हिस्टोलॉजिकल और आणविक विशेषताओं को भी4बनाए रखा जा सकता है।
प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट की स्थापना के लिए दो महत्वपूर्ण विचार इम्यूनोसमझौता माउस प्राप्तकर्ता के प्रकार और ग्लियोमा द्रोह के ग्रेड हैं। हमें एथिमिक (एनयू-नू) चूहों में प्राथमिक विद्वेष स्थापित करने और एन ओडी/एससीआईडी/इंटरल्यूकिन-2 रिसेप्टर जीअम्मा चेन की कमी के साथ समान रूप से अच्छी सफलता प्राप्त करने में गंभीर रूप से सीमित सफलता मिली है । एनएसजी चूहों को बेहतर प्राप्तकर्ता हैं क्योंकि एन मंजूरी/एससीआईडी चूहों की तुलना में ट्यूमरिक कोशिकाओं की बढ़ी हुई वृद्धि दर और लंबी उम्र20,21. डब्ल्यूएचओ ट्यूमर ग्रेड के संबंध में, हमने ग्रेड III और IV ट्यूमर के ग्लियोमा एनग्रेफ्टमेंट का अवलोकन किया है लेकिन ग्रेड I और II नहीं।
प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ग्लियोमा ज़ेनोग्राफ्ट के लिए, अलग ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे इम्यूनोसमझी चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित किया जा सकता है9 या ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को प्रत्यारोपण22के लिए संभावित रूप से अलग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए CD133-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं का चयन करके) । कोशिकाओं का या तो स्रोत हमारे अनुभव15,16में सफल ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट के लिए उपयुक्त है, हालांकि सीडी 133-समृद्ध कोशिकाओं के उपयोग के लिए अधिक प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। चाहे प्रत्यारोपण के लिए क्रमबद्ध या अनसोर्ट कोशिकाओं की तैयारी करना, अलग ग्लियोमा नमूनों से मायलिन और मलबे को पर्याप्त रूप से हटाना महत्वपूर्ण है। पर्याप्त रूप से myelin और मलबे को दूर करने में विफलता स्पष्ट रूप से एक हैमिल्टन सिरिंज में निलंबन आकर्षित करने और प्रत्येक प्राप्तकर्ता में कोशिकाओं की एक समान संख्या प्रत्यारोपण करने की क्षमता में बाधा । पापिन वियोजन के बाद, हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एक छोटे से एलिकोट का मूल्यांकन करना उपयोगी है ताकि असतत ढाल ट्यूबों की संख्या निर्धारित की जा सके जो मायलिन और मलबे को पर्याप्त रूप से खत्म करने के लिए आवश्यक होंगे। पूर्ण निष्कासन संभव नहीं है, लेकिन कोई भी मायलिन को हटाने से पहले एक अलग नमूने में कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने में कठिनाई के लिए प्रशंसा प्राप्त कर सकता है और असतत ढाल के साथ हटाने के बाद सापेक्ष आसानी।
अलग रोगी नमूनों से व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती है। इष्टतम, १०५ कोशिकाओं को पांच प्राप्तकर्ता चूहों में से प्रत्येक में प्रत्यारोपित कर रहे है हालांकि हम के रूप में कुछ के रूप में ३,००० कोशिकाओं के साथ engraftment प्राप्त किया है/ प्राथमिक घातक ग्लियोमा नमूनों (डब्ल्यूएचओ ग्रेड III और चतुर्थ) है कि हम प्रत्यारोपित किया है की लगभग आधे प्रारंभिक प्राप्तकर्ता चूहों के 40-100% में engrafted है । ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के बाद, प्राप्तकर्ता चूहों को साप्ताहिक रूप से तौला जाना चाहिए और ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट और विकास के संकेतों और लक्षणों के लिए नियमित रूप से निगरानी की जानी चाहिए। प्राथमिक ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट प्रदर्शित करते हैं कि फैलता है, घुसपैठ की वृद्धि और फोकल न्यूरोलॉजिकल लक्षण जैसे हीमिपरेसिस या दौरे केवल दुर्लभ अवसरों पर देखे जाते हैं। ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट का सबसे संवेदनशील संकेत महत्वपूर्ण और निरंतर वजन घटाने है जो कूबड़ मुद्रा, किसी न किसी बाल कोट या गुंबद वाली खोपड़ी के विकास के साथ हो सकता है। जिस दर पर चूहों निरंतर वजन घटाने का विकास करते हैं, वह रोगी नमूने के आधार पर अत्यधिक परिवर्तनशील होता है और 60-350 दिनों से हो सकता है। एनएसजी चूहों आम तौर पर प्रत्यारोपण में 18-25 ग्राम वजन और बाद ऑपरेटिव 28-33 ग्राम के वयस्क वजन प्राप्त करने । बिस्तर सामग्री को नियमित रूप से बदला जाना चाहिए क्योंकि पिंजरे की स्थिति जानवरों के वजन को काफी हद तक बदल सकती है। एक जानवर के वजन के रूप में ज्यादा के रूप में एक सप्ताह से अगले करने के लिए एक ग्राम के रूप में उतार चढ़ाव हो सकता है, और निर्धारित है कि क्या यह ट्यूमर engraftment का प्रतिनिधित्व करता है मुश्किल हो सकता है । वयस्क वजन हासिल करने वाले एनएसजी चूहों में ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट का एक अच्छा संकेत 3 ग्राम से अधिक वजन घटाने का निरंतर वजन कम करना है। हालांकि engrafted चूहों आम तौर पर क्रमिक वजन घटाने है कि एक कई सप्ताह की अवधि में मापा जा सकता है विकसित, कभी कभार एक जानवर के स्वास्थ्य में तेजी से ट्यूमर के विकास के कारण गिरावट आ सकती है, उदाहरण के लिए हाइड्रोसेफलस के विकास के बाद, या इस तरह के संक्रमण के रूप में असंबंधित कारणों से ।
इच्छामृत्यु के बाद, मस्तिष्क के सकल निरीक्षण से ट्यूमर एनग्रफ्टमेंट आसानी से स्पष्ट नहीं हो सकता है और हिस्टोलॉजिकल पुष्टि आवश्यक है। प्रारंभिक ट्यूमर प्राप्तकर्ताओं के लिए, हम प्रत्येक मस्तिष्क को एक ही फैशन में संसाधित करते हैं ताकि एक भाग का मूल्यांकन हिस्टोलॉजिकल रूप से किया जा सके और अन्य भागों को बाद में ट्यूमर पारित होने के लिए क्रायोप्रीड किया जाए यदि एनग्रफ्टमेंट सत्यापित किया जाता है। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, मस्तिष्क को एक मैट्रिक्स स्लाइसर में रखा गया है ताकि प्रत्येक स्लाइस के साथ 2 मिमी कोरोनल स्लाइस उत्पन्न किया जा सके जो पूर्वकाल के साथ पीछे की धुरी के साथ मस्तिष्क के एक परिभाषित क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। कोरोनल स्लाइस #3, जिसमें नियमित रूप से इंजेक्शन साइट होती है, फॉर्मेलिन में तय की जाती है और शेष स्लाइस में से प्रत्येक को एक अलग, लेबल वाले क्रायोवियल में रखा जाता है जिसमें 1 मिलीलीटर क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम होता है। फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफएपी) स्लाइड्स को हिस्टोलॉजी का मूल्यांकन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन और इओसिन से सना हुआ है और कि 67 और मानव विमेंटिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संलग्न कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए।
एक बार engraftment सत्यापित किया जाता है, ट्यूमर पारित किया जा सकता है और माध्यमिक प्राप्तकर्ताओं में engraftment दर आम तौर पर 80-100% पर अधिक हैं । हम प्राप्तकर्ता चूहों की एक बड़ी संख्या में पहली बार ट्यूमर को पास करने की सलाह देते हैं ताकि भविष्य के अध्ययनों के लिए कम मार्ग (2-5) पर दिए गए ट्यूमर लाइन को बनाए रखने के लिए पर्याप्त क्रायोप्रर्वीवित सामग्री उत्पन्न की जा सके। एक दिया ट्यूमर के लिए औसत अस्तित्व के समय आम तौर पर पारित होने से पारित होने के समान है जब ट्यूमर कोशिकाओं की एक ही संख्या हर बार प्रत्यारोपित कर रहे हैं ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम विशेष रूप से वैंडरबिल्ट विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र में रोगियों के ऋणी हैं जिन्होंने आणविक न्यूरोसर्जिकल ऊतक बैंक के लिए अमूल्य अनुसंधान सामग्री प्रदान की। हम उन लोगों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने टिशू बैंक, रीड सी थॉमसन एमडी (प्रमुख अन्वेषक), चेरील किनार्ड आरएन (रिसर्च नर्स) और लैरी ए पियर्स एमएस (प्रबंधक) की स्थापना और रखरखाव की । हिस्टोलॉजिकल सेवाओं का प्रदर्शन, भाग में, वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (VUMC) ट्रांसलेशनल पैथोलॉजी साझा संसाधन (पुरस्कार 5P30 CA068485 द्वारा वैंडरबिल्ट-इंगराम कैंसर सेंटर को समर्थित) द्वारा किया गया था। इस काम को एनआईएनएस (1R21NS070139), बुर्के वेलकम फंड और वीएमसी डेवलपमेंट फंड से एमकेसी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एमकेसी को अनुदान 1 I01 BX000744-01 के माध्यम से दिग्गजों मामलों, दिग्गजों स्वास्थ्य प्रशासन, अनुसंधान और विकास कार्यालय, जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास विभाग द्वारा समर्थित है। सामग्री दिग्गजों मामलों के विभाग या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
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