Summary
Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos.
Abstract
Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos. Para modelar gliomas malignos de grado III e IV de la OMS en ensayos de trasplante, las células tumorales humanas se xenoinjerten en un sitio ortotópico, el cerebro, de ratones inmunocomprometidos. En contraste con los xenoinjertos secundarios que utilizan las células cultivadas del tumor, las células humanas de la glioma se disocian de especímenes resecados y se trasplantan sin el paso anterior en cultura del tejido para generar xenoinjertos primarios. El procedimiento en este informe detalla la preparación de la muestra del tumor, el trasplante intracraneal en ratones immunocompromised, la supervisión para el engraftment del tumor y la cosecha del tumor para el paso subsecuente en animales o análisis receptores. La preparación de células tumorales requiere 2 horas y el procedimiento quirúrgico requiere 20 min/animal.
Introduction
Los gliomas malignos son tumores gliales primarios del sistema nervioso central que ocurren en el cerebro y ocasionalmente en la médula espinal. Los gliomas son clasificados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) según el parecido histológico con los astrocitos, oligodendrocitos o células ependimarias y luego se clasifican numéricamente (I a IV) por las características patológicas de la malignidad. Los subtipos histológicos más comunes son astrocitomas, oligodendrogliomas y oligoastrocitomas mixtos. Los gliomas malignos que abarcan los grados II a IV de la OMS se caracterizan por un crecimiento invasivo y una recalcitrante a las terapias actuales. Cada año en los Estados Unidos, aproximadamente 15,750 individuos son diagnosticados con un glioma maligno y se estima que 12,740 pacientes sucumben a esta enfermedad. Estas estadísticas destacan la naturaleza particularmente mortal de gliomas malas y la necesidad importante de la eficacia terapéutica aumentada.
Los modelos de cáncer son esenciales para investigar la biología y las terapias tumorales. Las variedades de células humanas del cáncer representan un primer paso importante para las manipulaciones ines vitro y los estudios in vivo del xenografting (xenoinjertos secundarios)1. Sin embargo, los cultivos celulares de cáncer estándar experimentan la transformación fenotípica y genotípica2-4 que puede no ser restaurada en xenoinjertos secundarios5. Además, las alteraciones genéticas como las mutaciones de la isocitrato deshidrogenasa(IDH)6,las distintas poblaciones de células madre7 y la dependencia de las vías de señalización clave8 pueden perderse en cultivos de células cancerosas. Los perfiles genómicos pueden mantenerse en mayor medida en el cultivo de la esfera del cáncer, aunque todavía no reflejan plenamente el genotipo de los tumores primarios2,3. El trasplante ortotópico directo niega las influencias del cultivo in vitro, proporciona un microambiente adecuado y preserva la integridad de las células iniciadoras de tumores9,10. Por lo tanto, los xenoinjertos primarios representan un modelo preclínico potente y relevante para probar rigurosamente agentes dirigidos para ayudar en el diseño racional de futuros ensayos clínicos5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de la suspensión de células tumorales
Nota: Las aprobaciones institucionales apropiadas para el uso del material paciente y de los animales se requieren para establecer y para mantener xenoinjertos ortotopic primarios de la glioma. En el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, el material tumoral resecado que excede el requerido para fines de diagnóstico se recopila con el consentimiento del paciente para un repositorio de tejidos de investigación. Las muestras se etiquetan con un número de base de datos REDcap aleatorio de 5 dígitos y se eliminan todos los identificadores específicos del paciente. La base de datos REDcap contiene datos clínicos desidentificados para cada muestra en el repositorio de tejidos que incluyen el sexo, la edad (en años), la raza, el estado de supervivencia, la patología, los tratamientos contra el cáncer, el año de resección y el tiempo hasta la progresión. Para mantener esterilidad y optimizar el éxito del método primario del xenoinjerto, todos los reactivos, los instrumentos quirúrgicos vapor-autoclavados, y el sitio quirúrgico se deben ensamblar o preparar de antemano.
Nota: Los especímenes de glioma a menudo contienen grandes cantidades de mielina y escombros. Dependiendo del tamaño de la muestra, puede ser necesario utilizar más de 4 tubos de gradiente discontinuos para la eliminación adecuada de mielina y escombros.
Nota: El proceso se completa cuando no queda ningún tejido no disociado claramente visible, o poco. Evite la introducción de burbujas durante el proceso de trituración.
Nota: La viabilidad celular después de la disociación es típicamente >90%. Las viabilidades más bajas pueden reflejar muchas variables incluyendo la manipulación subóptima del tejido o el tiempo de transporte desde el quirófano, el método de criopreservación o la técnica de disociación de papaína. Sin embargo, las viabilidades celulares más bajas pueden seguir siendo adecuadas, siempre y cuando se pueda trasplantar un número suficiente de viables en el volumen apropiado. Por cada ratón, se implantan entre 50.000 y 200.000 células viables en volumen de 2 μl. Debido a la punta biselinada de la aguja de la jeringuilla, un adicional 5 μl de la suspensión de la célula se debería incluir en el volumen final para asegurarse de que el material adecuado se pueda dibujar en la jeringuilla para cada inyección. Por ejemplo, para inyectar 2 μl/ratón para 5 ratones el volumen final debe ser de 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
- Coloque el material paciente recién resecado y desidentificado en un recipiente estéril y tapado sobre hielo para su transporte al laboratorio. Procesar la muestra directamente para su trasplante o criopreserva la muestra en nitrógeno líquido (ver más abajo) para su almacenamiento en nitrógeno líquido y su posterior uso.
- Prepare las soluciones de disociación de papaína (solución de papaína, solución inhibidora de lavado/proteasa y solución de gradiente discontinuo) en una campana estéril con los componentes del kit y las instrucciones suministradas por el fabricante. Etiquete los tubos cónicos estériles de poliestireno de 15 ml y distribuya las soluciones de la siguiente manera:
- Tubo 1: 5 ml de solución de papaína
- Tubo 2: 3 ml de solución inhibidora de lavado/proteasa
- Tubos 3-6: 5 ml cada uno de solución de gradiente discontinuo
- Coloque la muestra de glioma en el tubo 1 con 5 ml de solución de papaína y triturar con una pipeta de 5 ml durante un período de tiempo de 10-20 min.
- Pipetear el material hacia arriba y hacia abajo 10 veces y luego incubar el material durante 2-3 minutos a temperatura ambiente antes de iniciar el siguiente ciclo de trituración.
- Coloque la punta de la pipeta de 5 ml más cerca de la parte inferior del tubo cónico con cada ciclo de trituración de tal manera que la punta esté tocando la parte inferior del tubo durante los últimos 2 ciclos.
- Centrífuga a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y pipetee el pellet hacia arriba y hacia abajo 10 veces en 3 ml de la solución inhibidora de lavado/proteasa.
- Cuidadosamente capa un volumen igual de la suspensión sobre cada una de las soluciones de gradiente discontinuo de 5 ml (tubos 3-6), con un pipeteador establecido a la velocidad de dispensación "gravedad".
- Coloque los tubos en una centrífuga equipada con un rotor de cubo oscilante, con la velocidad de aceleración reducida al ajuste más bajo y el freno apagado. Centrífuga a 76 x g durante 12 min a temperatura ambiente. Con el freno apagado, la centrifugación generalmente se completa después de 20 minutos.
- Retiramos el sobrenadante, resuspend y combinamos cada pellet en 5 ml de solución salina balanceada estéril y colocamos las células sobre hielo.
- Retire una porción (10-100 μl) de la suspensión celular y determine la densidad de células viables por exclusión de tripano azul con un hemocitómetro.
- Centrífuga a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend el pellet celular a una densidad de 25,000-125,000 células viables por μl.
- Transferir un volumen adecuado de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 200 μl (tubo PCR) y colocarlo sobre hielo.
2. Preparación del sitio quirúrgico y los instrumentos
Nota: Guantes quirúrgicos estériles se usan durante el procedimiento. Dependiendo de los requisitos de cada institución, se pueden requerir batas quirúrgicas, gorras y protectores faciales.
- Prepare un banco desinfectado para la cirugía de roedores con áreas contiguas separadas para la preparación de animales, el campo operativo y la recuperación de animales.
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos en un autoclave de vapor. Posteriormente, utilice un esterilizador de perlas calientes para flash-esterilizar instrumentos al hacer la transición de un animal sujeto a otro.
3. Inducción, anestesia y analgesia
Nota: Las cirugías que exceden los 15 minutos desde el momento en que los ratones son anestesiados requieren una fuente de calor de contacto. Para prevenir la hipotermia, los ratones reciben una fuente de calor (manta de agua caliente circulante) durante los períodos pre y postoperatorio.
- Prepare un cóctel de ketamina/xilazina para la anestesia por inducción de manera que cada ratón reciba ketamina 100 mg/kg y xilazina 10 mg/kg inyectando 10 μl del cóctel por gramo de peso corporal.
-
Tabla 1. Cóctel de anestesia.
Concentración de existencias Volumen para prepararse un ratón cinco ratones diez ratones ketamina 100 mg/ml 25 μl μl 125 250 μl Xilazina 100 mg/ml 2,5 μl μl 12.5 25 μl Solución salina isotónica 223 μl μl 1.113 2.225 μl total 250 ul 1.250 μl 2.500 μl - Prepare la solución de ketoprofeno para la analgesia diluyendo la solución común (10 mg/ml) 1:20 en agua estéril y libre de piógenos de tal manera que cada ratón reciba una dosis de 5 mg/kg inyectando 10 μl de la solución por gramo de peso corporal.
- Pesar y registrar el peso prequirúrgico. Los pesos individuales de los ratones varían, pero generalmente oscilan entre 18 y 22 g.
- Inyecte 10 μl del cóctel de ketamina/xilazina por gramo de peso corporal del ratón en el espacio intraperitoneal con una jeringa de insulina. Por ejemplo, inyecte 200 μl para un ratón de 20 g.
- Determine si el ratón está completamente anestesiado por la pizca del dedo del pie de la pata trasera. Por lo general, toma 3-5 minutos para que el ratón ya no se retire del pellizco.
- Inyecte 10 μl de la solución de ketoprofeno por gramo de peso corporal del ratón por vía subcutánea en la piel suelta del flanco con una jeringa de insulina. Por ejemplo, inyecte 200 μl para un ratón de 20 g.
- Afeite el cabello sobre el cráneo con cortadoras, frote el cuero cabelludo expuesto con povidona-yodo usando un aplicador de punta de algodón y luego limpie una almohadilla de alcohol. Repita estos pasos, exfoliante de povidona y yodo y toallita con alcohol, dos veces más.
- Aplique ungüento oftálmico a los ojos del ratón.
- Haga una incisión de línea media de 1 cm que se extienda desde detrás de las orejas hasta justo delante de los ojos con una hoja de bisturí estéril.
- Coloque el ratón bajo un ámbito de disección y exponga el cráneo para identificar las líneas de sutura. Usando movimientos circulares con un taladro, centre un agujero de rebabas 2,5 mm lateral a la bregma y 1 mm posterior a la sutura coronal.
4. Trasplante intracraneal
Nota: Los volúmenes de inyección superiores a 2,5 μl pueden ser letales para los ratones.
- Coloque el ratón en un marco estereotáctico enganchando los incisivos superiores sobre la barra incisivo y aplicando la abrazadera de la nariz para que el cráneo se sostengan firmemente en una posición neutra.
- Extraiga 5-10 μl de las células en un tubo de microcentrífuga hacia arriba y hacia abajo varias veces en una jeringa Hamilton de 10 μl sujetada en el soporte de la sonda del manipulador estereotáctico para mezclar la suspensión y eliminar burbujas. Deprima el émbolo para que la jeringa se cargue con 2 μl (el volumen adecuado para inyectar un animal).
- Tire del borde lateral de la incisión de la piel para exponer el orificio de las rebabas y, con el micromanipulador, introduzca la aguja en el orificio de las rebabas para que la parte biselinada esté justo debajo de la superficie del cráneo.
- Avance la aguja 3 mm y luego retire la aguja 0.5 mm para crear un espacio para la inyección.
- Avance el émbolo lentamente durante 30 segundos y luego deje que la aguja permanezca en el cerebro durante 2 minutos adicionales. Retire la aguja gradualmente ascendiendo 0,5 mm y esperando 30 segundos adicionales antes de retirar la aguja del cerebro.
- Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la herida con un autoclip.
- Coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal y controlar continuamente el patrón de respiración y el color de las membranas mucosas y los tejidos expuestos (plantas de los pies).
- Coloque el ratón en una jaula microisoladora estéril una vez que se recupere completamente de la anestesia (esternal y ambulatoria), y devuélvalo a la instalación de alojamiento de animales.
5. Cuidado y observación de animales después de la implantación
Nota: La indicación más confiable del engraftment del tumor y del crecimiento infiltrativo es pérdida de peso gradual, continua acompañada por el desarrollo de la postura encorvada y de la capa áspera del pelo. En raras ocasiones, se observan déficits neurológicos que incluyen ataxia, paresia y convulsiones. Los xenoinjertos primarios ortotópicos son altamente invasivos y se desarrollan durante un largo período de tiempo. Los ratones suelen manifestar síntomas de crecimiento tumoral 3-6 meses después del trasplante.
- Observe a ratones con xenoinjertos ortotópicos diariamente para la ingesta de alimentos y agua, el comportamiento, el acicalamiento y los signos de infección en el sitio de la incisión.
- Administrar ketoprofeno (5 mg/kg por vía subcutánea, 1-2 veces al día) si se observa dolor o angustia postoperatoriamente.
- Retire los autoclips 8-10 días después de la cirugía.
- Pesar ratones semanalmente.
- Vigile si hay muestras y síntomas del engraftment del tumor.
6. Cosecha de tumores
Nota: Por este método, la primera rebanada coronal (#1) contiene el aspecto posterior de los bulbos olfativos y el aspecto anterior de los lóbulos frontales. El tumor injertado es el más abundante en el hemisferio correcto de las 3 rebanadas coronales subsecuentes (#2 de la rebanada, #3, y #4) y la vista de la inyección se contiene rutinario en la rebanada coronal #3. Dependiendo de las necesidades experimentales, el material se puede utilizar para el paso del tumor, secciones de tejido congelado, secciones de tejido incrustado de parafina fija de formol, citometría de flujo de tejido disociado, cultivo celular o lisatos para análisis de ADN, ARN o proteínas. Las porciones del tumor se pueden cryopreserved para las necesidades futuras con la viabilidad de la célula que se extiende de de 80-95%.
- Euthanize ratones por la exposición prolongada al dióxido de carbono seguido por la dislocación cervical.
- Decapitar ratones eutanásicos en la base del cerebro (nivel de foramen magnum) con un par más grande de tijeras quirúrgicas, y tire de la piel de la incisión hacia adelante para exponer completamente el cráneo.
- Extirpar el cerebro.
- Inserte una punta de par de tijeras quirúrgicas finas en el aspecto lateral del foramen magno al nivel del meato auditivo externo izquierdo para cortar el hueso occipital a lo largo del lado izquierdo del cráneo. Realice el mismo corte en el lado derecho.
- Corte el hueso occipital a lo largo de un plano coronal de un meato auditivo externo al otro y retire el hueso para exponer el cerebelo.
- Corte las placas óseas nasales entre los ojos.
- Corte la sutura sagital cortando posteriormente a lo largo de la sutura sagital de las placas óseas nasales al bregma. Complete la incisión de la línea media a lo largo de la sutura sagital cortando anterior de la lambda a la bregma.
- Inserte cuidadosamente la punta de un par fino de fiórceps a lo largo de la abertura sagital a cada lado para romper cualquier adhesión dural del cráneo al cerebro y luego pelar las dos mitades del cráneo lateralmente para exponer el cerebro y los bulbos olfativos dorsalmente.
- Deslice las esrcepillas entre el aspecto ventral de los bulbos olfativos y el cráneo para liberar cualquier adherencia.
- Incline el cráneo hacia atrás para permitir que el cerebro se retraiga para que los nervios ópticos y otros nervios craneales estén expuestos. Cortar los nervios craneales para liberar el cerebro en un plato que contiene PBS estéril.
- Transfiera el cerebro con una espátula de pesaje a una rebanadora de matriz y genere rebanadas coronales de 2 mm con cuchillas de afeitar.
- Coloque las rebanadas coronales en un plato que contenga PBS estéril para una inspección visual adicional y un mayor procesamiento de tejidos.
7. Criopreservación tumoral
- Preparar una solución común de medio de criopreservación.
- Añadir 50 ml de suplemento de proliferación, 5 ml de solución de penicilina y estreptomicina 100x, y 450 μl de heparina al 0,2% a 450 ml de medio basal.
- Guarde la solución común a 4 °C protegida de la luz.
- Preparar una solución de trabajo de medio de criopreservación.
- Combinar 47,5 ml de medio de criopreservación y 2,5 ml de DMSO estéril en un tubo cónico de polipropileno de 50 ml y mezclar bien.
- Alícuota 1,0 ml de solución de trabajo a cada criovial y conservar a 4 °C protegido de la luz.
- Coloque una rebanada coronal de 2 mm de cerebro xenoinjertado en un medio de criopreservación que contenga criopreservación sobre hielo.
- Tapar firmemente el vial y colocarlo en un recipiente de congelación a -80 °C. Transfiera el criovial al día siguiente a un tanque de nitrógeno líquido para un almacenamiento más largo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las células disociadas del glioma se trasplantan directamente en los cerebros de ratones immunocompromised para obtener líneas ortotopic primarias del xenoinjerto. A cada muestra de tumor se le asigna un número aleatorio antes del trasplante, como parte del proceso de desidentificación para eliminar la información de salud protegida. Utilizamos un número de base de datos REDcap de 5 dígitos para este propósito. La Figura 1 ilustra el proceso y la nomenclatura para establecer una línea de xenoinjerto desde un glioblastoma (GBM 17182) con la mutación arginina 132 de la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) hasta la histidina (R132H). Después del trasplante se agrega una "X" al número de identificación del tumor para denotar el tumor xenografted, seguido por una "P" para seguir el número del paso. P0 señala al receptor inicial del trasplante y P1 designa a los ratones receptores del primer paso del xenoinjerto. Típicamente, 3-5 ratones se trasplantan inicialmente para establecer una línea y el tumor xenografted entonces se pasa en 10 ratones receptores (P1) para ampliar la línea para los estudios futuros.
Después del trasplante orthotopic, los ratones receptores se supervisan para las muestras y los síntomas del engraftment y del crecimiento del tumor. La indicación más sensible del engraftment del tumor es pérdida de peso significativa y continua. Como los ratones se trasplantan a una edad temprana, se espera un aumento de peso postoperatorio. Los pesos del ratón pueden fluctuar de manera aparentemente dramática de una semana a otra, no obstante la pérdida continua de mayor de 3 g es generalmente una buena indicación del engraftment del tumor. Típicamente, la mayoría de los ratones en una cohorte de xenoinjerto desarrollan pérdida de peso durante un período de tiempo similar que va desde tan corto como 60 días hasta 350 días dependiendo del tumor. Los tiempos de supervivencia medianos para un tumor dado son generalmente similares de un paso a otro cuando se trasplanta el mismo número de células tumorales cada vez. En la Figura 2 se ilustra una cohorte de 5 ratones trasplantados con un GBM (17182XP2) que había sido previamente injertado y pasado una vez antes. Cuatro de los cinco ratones 17182XP2 demostraron una pérdida de peso significativa 17 semanas después del trasplante. El ratón restante (ratón 3) no exhibió pérdida de peso y no se detectó ningues tumor en la autopsia, indicando el engraftment del tumor en el solamente 80% de los recipientes.
Cuando se cosecha el cerebro de un ratón sintomático, una matriz de rebanadora cerebral es una herramienta extremadamente valiosa para el procesamiento de tejidos. La generación de múltiples secciones definidas anatómicamente de cada cerebro permite múltiples modos de análisis con algunas porciones y criopreservación de otras porciones del tejido. Por ejemplo, el estado mutacional de IDH1 puede ser evaluado por secuenciación de Sanger con material de una porción o inmunohistoquímica con otra(Figura 3). El engraftment del tumor puede ser fácilmente evidente por la inspección visual de las secciones coronales, sin embargo, la histología con immunohistochemistry se puede requerir para algunos xenografts (figuras 4 y 5). Al disociar un xenoinjerto para el paso en serie u otros estudios, es importante comenzar con una porción pequeña y definida de material para que la mielina y los desechos puedan eliminarse adecuadamente (Figura 6). El gradiente discontinuo del sistema de disociación de papaína es el más adecuado para procesar pequeñas porciones de un cerebro de ratón adulto. Recomendamos cortar cada sección coronal a lo largo de la línea media y usar dos gradientes discontinuos para cada mitad.
Figura 1. Las líneas ortotópicas primarias del xenoinjerto son establecidas trasplantando las células disociadas de la glioma directamente en los cerebros de ratones immunocompromised y después ampliadas por el trasplante serial. Las mutaciones somáticas heterozigóticas en la arginina 132 del gene IDH1 ocurren en más el de 70% de astrocytomas difusos, de oligodendrogliomas, de oligoastrocytomas y de glioblastomas secundarios, y menos el de 7% de glioblastomas primarios. GBM 17182 contiene la mutación más común de IDH1, arginina 132 a la histidina (R132H). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Las curvas de crecimiento de los receptores de trasplantes en serie de GBM 17182XP1 demuestran una pérdida de peso significativa 130-150 días después de la cirugía en 4 de 5 ratones GBM 17182XP2. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. La mutación heterozigótica, somática de IDH1 R132H en el tumor paciente (GBM 17182) y el xenoinjerto primario (17182XP0) se pueden detectar por la secuencia de Sanger o la coloración del anticuerpo. Immunohistochemistry con un anticuerpo IDH1 R132H-specific demuestra las células del glioma del mutante agrupadas densamente alrededor de los vasos sanguíneos o en regiones más difusamente infiltradas del cerebro paciente del espécimen y del ratón. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Los xenoinjertos ortotópicos primarios exhiben un crecimiento altamente infiltrativo que puede ser difícil de apreciar completamente por hematoxilina y eosina (H + E) que mancha sola. Immunohistochemistry con un anticuerpo humano-específico es un método particularmente útil para identificar las células humanas engrafted. la coloración Anti-humana del vimentin de un xenograft analplastic del oligoastrocytoma (14175XP2) revela características típicas de una glioma infiltrativa con una masa de tumor difusa en el hemisferio derecho inyectado y el crecimiento invasor a lo largo de las zonas myelinated del callosum de la recopilación (asteriscos) y de las fibras striatopallidal (puntas de flecha negras) y de la difusión leptomeningeal (flecha negra). No apreciado en esta ampliación (1.25X) es el agrupamiento de las células tumorales humanas alrededor de las neuronas de ratón (satellitosis perineuronal) en la corteza invadida. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 5. El análisis del oligoastrocytoma analplastic 14175XP2 secciones coronales en la potencia más alta (40X) en las regiones encajonadas A-C revela las células humanas del mutante de IDH alrededor de los vasos sanguíneos (región A), en las zonas estriatopallidales ("fibras del lápiz;" región B) y el callosum de la recopilación (región C). Al igual que con GBM 17182XP2, IDH1 R132H tinción de oligoastrocitoma anaplásico 14175XP2 demuestra que la mutación IDH se mantiene en un xenoinjerto ortotópico primario después de pasajes en serie en ratones receptores. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 6. Las células humanas del tumor se pueden distinguir de las células del ratón en xenoinjertos disociados basados sobre tamaño. Para cuantificar las células tumorales humanas en un xenoinjerto disociado para el paso en serie, las células humanas se identifican en un hemocitómetro bajo microscopía de luz por su gran tamaño y luminiscencia verde oscuro (puntas de flecha). Por citometría de flujo, las células humanas tienen propiedades de dispersión distintas del material del ratón y pueden ser cerradas para su posterior análisis. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las líneas celulares cultivadas, los xenoinjertos y los ratones genéticamente modificados son los métodos más comunes para modelar gliomas, y existen distintos beneficios y limitaciones para cada sistema modelo3,13,14. Las ventajas relevantes de xenoinjertos ortotópicos primarios del glioma incluyen el crecimiento infiltrativo que tipifica gliomas difusos y la retención de alteraciones genéticas y de los mecanismos importantes de la señalización que pueden ser excesivamente difíciles de mantener en células cultivadas del glioma. Por ejemplo, lasmutaciones de la socitrato deshidrogenasa y la producción de ligandos de sonic hedgehog se pueden mantener en xenoinjertos ortotópicos primarios15,16 pero sólo raramente en células de glioma cultivadas14,17-19. Es importante considerar desventajas significativas de xenoinjertos ortotópicos primarios, sin embargo, dependiendo de las necesidades experimentales. A pesar del acceso al material adecuado para el paciente, es más difícil medir el crecimiento del glioma con el tiempo en el cerebro que en un sitio heterotópico. Además, los xenoinjertos ortotópicos primarios crecen a un ritmo significativamente más lento que los xenoinjertos heterotópicos. Así, los investigadores pueden preferir trasplantar células al flanco de un ratón inmunodeprimido, donde también pueden conservarse importantes características histológicas y moleculares4.
Dos consideraciones importantes para establecer xenografts orthotopic primarios son el tipo de recipiente immunocompromised del ratón y el grado de malignidad de la glioma. Hemos tenido un éxito severamente limitado el establecimiento de xenoinjertos primarios en ratones atrímicos (nu-nu) e igualmente buen éxito con NOD / SCID y NSG (NOD /SCID / Interleukin-2 receptor gamma cadena deficiente) ratones. Los ratones NSG son recipientes preferibles debido a la tasa creciente del engraftment de células tumorigenic y de una vida útil más larga con respecto a los ratones de NOD/SCID20,21. Con respecto al grado tumoral de la OMS, hemos observado injerto de glioma de tumores de grado III y IV, pero no de grados I y II.
Para los xenoinjertos primarios de glioma ortotópico, las células tumorales disociadas pueden trasplantarse directamente a los cerebros de ratones inmunocomprometidos9 o las células iniciadoras de tumores pueden aislarse prospectivamente (por ejemplo, seleccionando células que expresan CD133) para el trasplante22. Cualquiera de las dos fuentes de células es adecuada para el injerto tumoral exitoso en nuestra experiencia15,16,aunque el uso de células enriquecidas con CD133 requiere más material de partida. Ya sea preparando células clasificadas o no clasificadas para el trasplante, es importante eliminar adecuadamente la mielina y los desechos de las muestras de glioma disociadas. La falta de eliminar adecuadamente la mielina y los desechos dificulta notablemente la capacidad de dibujar la suspensión en una jeringa de Hamilton y trasplantar un número uniforme de células en cada receptor. Después de la disociación de la papaína, es útil evaluar una pequeña alícuota usando un hemocytometer para determinar el número de tubos discontinuos del gradiente que serán requeridos para eliminar suficientemente el myelin y la ruina. El retiro completo no es factible, pero uno puede ganar un aprecio para la dificultad que cuantifica las células en un espécimen disociado antes del retiro del myelin y de la facilidad relativa después del retiro con gradientes discontinuos.
El rendimiento de células viables de especímenes pacientes disociados puede ser altamente variable. De manera óptima, 105 células se trasplantan en cada uno de los cinco ratones receptores, aunque hemos obtenido injerto con tan solo 3.000 células / animal. Aproximadamente la mitad de los especímenes primarios del glioma malo (grados III y IV del WHO) que hemos trasplantado han engrafted en 40-100% de los ratones receptores iniciales. Después del trasplante orthotopic, los ratones receptores se deben pesar semanalmente y supervisar regularmente para las muestras y los síntomas del engraftment y del crecimiento del tumor. Los xenografts orthotopic primarios demuestran crecimiento difuso, infiltrativo y los síntomas neurológicos focales tales como hemiparesis o asimientos se observan solamente en ocasiones raras. La indicación más sensible del injerto del tumor es la pérdida de peso significativa y sostenida que se puede acompañar por el desarrollo de la postura encorvada, de la capa áspera del pelo o del cráneo abovedado. La velocidad a la que los ratones desarrollan una pérdida de peso sostenida es muy variable dependiendo de la muestra del paciente y puede variar de 60 a 350 días. Los ratones NSG típicamente pesan 18-25 g en el trasplante y postoperatoriamente alcanzan pesos adultos de 28-33 g. El material de la ropa de cama debe cambiarse regularmente, ya que las condiciones de la jaula pueden alterar el peso de los animales en gran medida. Los pesos de un animal pueden fluctuar hasta en un gramo de una semana a la siguiente, y determinar si esto representa el injerto tumoral puede ser difícil. Una buena indicación del injerto del tumor en los ratones de NSG que han alcanzado pesos adultos es pérdida de peso continua de mayor de 3 g. Aunque los ratones injertados típicamente desarrollan una pérdida de peso gradual que se puede medir durante un período de varias semanas, ocasionalmente la salud de un animal puede disminuir rápidamente debido al crecimiento del tumor, después del desarrollo de hidrocefalia, por ejemplo, o de causas no relacionadas como la infección.
Después de la eutanasia, el engraftment del tumor puede no ser fácilmente evidente por la inspección gruesa del cerebro y la confirmación histológica es esencial. Para los recipientes iniciales del tumor, procesamos cada cerebro de la misma manera de modo que una porción se evalúe histológico y otras porciones sean cryopreserved para el paso subsecuente del tumor si se verifica el engraftment. Como se discutió anteriormente, el cerebro se coloca en una rebanadora de matriz para generar rebanadas coronales de 2 mm con cada rebanada que representa una región definida del cerebro a lo largo del eje anterior a posterior. La rebanada coronal #3, que contiene rutinariamente el sitio de inyección, se fija en formalina y cada una de las rebanadas restantes se coloca en un cryovial separado y etiquetado que contiene 1 ml de medio de criopreservación. Los portaobjetos de parafina fija de formalina incrustada (FFPE) se tiñen con hematoxilina y eosina para evaluar la histología y con anticuerpos contra Ki67 y vimentina humana para visualizar células injertada.
Una vez que se verifica el engraftment, el tumor puede ser aprobado y las tarifas del engraftment en recipientes secundarios son típicamente más altas en 80-100%. Recomendamos pasar un tumor la primera vez en un número más grande de ratones receptores de modo que el material cryopreserved adecuado pueda ser generado para mantener una línea dada del tumor en el bajo-paso (2-5) para los estudios futuros. Los tiempos de supervivencia medianos para un tumor dado son generalmente similares de un paso a otro cuando se trasplanta el mismo número de células tumorales cada vez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Estamos particularmente en deuda con los pacientes del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt que proporcionaron material de investigación invaluable para el Banco de Tejido Neuroquirúrgico Molecular. Agradecemos a aquellos que establecieron y mantienen el Banco de Tejidos, Reid C. Thompson MD (investigador principal), Cherryl Kinnard RN (enfermera de investigación) y Larry A. Pierce MS (gerente). Los servicios histológicos fueron realizados, en parte, por el Recurso Compartido de Patología Traslacional del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (VUMC) (apoyado por el premio 5P30 CA068485 al Centro Oncológico Vanderbilt-Ingram). Este trabajo fue apoyado por subvenciones a MKC del NINDS (1R21NS070139), el Fondo Burroughs Wellcome y los fondos de desarrollo VMC. MKC cuenta con el apoyo del Departamento de Asuntos de Veteranos, Administración de Salud de Veteranos, Oficina de Investigación y Desarrollo, Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos a través de la subvención 1 I01 BX000744-01. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos o del Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
