Summary
Maligna gliomas utgör en heterogen grupp av mycket infiltrativa stödjegena tumörer med distinkta kliniska och molekylära funktioner. Primära ortopediska xenografts rekapitulera de histopatologiska och molekylära funktionerna i maligna gliom subtyper i prekliniska djur modeller.
Abstract
Maligna gliomas utgör en heterogen grupp av mycket infiltrativa stödjegena tumörer med distinkta kliniska och molekylära funktioner. Primära ortopediska xenografts rekapitulera de histopatologiska och molekylära funktionerna i maligna gliom subtyper i prekliniska djur modeller. För att modellera WHO-graderna III och IV maligna gliom i transplantationsanalyser xenograferas mänskliga tumörceller till en ortopisk plats, hjärnan, av immunkomprometterade möss. I motsats till sekundära xenografter som använder odlade tumörceller, är mänskliga gliom celler dissociated från resected exemplar och transplanteras utan föregående passage i vävnad kultur för att generera primära xenografts. Förfarandet i denna rapport beskriver tumör prov förberedelse, intrakraniell transplantation till immunkomprometterade möss, övervakning för tumör engraftment och tumör skörd för efterföljande passage i mottagaren djur eller analys. Tumör cell förberedelse kräver 2 timmar och kirurgiskt ingrepp kräver 20 min/djur.
Introduction
Maligna gliomas är primära gliatumörer i centrala nervsystemet som förekommer i hjärnan och ibland ryggmärgen. Gliomas klassificeras av Världshälsoorganisationen (WHO) enligt histologic likhet med astrocyter, oligodendrocyter eller ependymal celler och sedan numeriskt graderade (I till IV) för patologiskt funktioner av malignitet. De vanligaste histologic subtyperna är astrocytomas, oligodendrogliomas och blandade oligoastrocytomas. Maligna gliomas som omfattar WHO grader II till IV kännetecknas av invasiv tillväxt och motsträviga till nuvarande terapier. Varje år i USA diagnostiseras cirka 15 750 individer med en elakartad gliom och uppskattningsvis 12 740 patienter dukar under för denna sjukdom. Denna statistik belyser den särskilt dödliga karaktären av maligna gliomas och viktiga behov av förbättrad terapeutisk effekt.
Cancermodeller är viktiga för att undersöka tumörbiologi och terapier. Mänskliga cancer cellinjer representerar ett viktigt första steg för in vitro manipulationer och in vivo xenografting studier (sekundära xenografts)1. Standard cancer cell kulturer genomgår dock fenotypiska och genotypiska omvandling2-4 som inte får återställas i sekundära xenografts5. Dessutom kan genetiska förändringar som isocitrate dehydrogenas(IDH)mutationer 6, distinkta stamcellspopulationer7 och beroende av viktigasignalvägar 8 gå förlorade i cancercellskulturer. Genomiska profiler kan upprätthållas i bättre utsträckning i cancersfärkulturen, men misslyckas fortfarande med att helt spegla genotypen av primära tumörer2,3. Direkt ortopisk transplantation negerar påverkan av in vitro-kultur, ger en korrekt mikromiljö och bevarar integriteten hos tumörinitierande celler9,10. Därför representerar primära xenografter en kraftfull och relevant preklinisk modell för rigorös testning av riktade medel för att underlätta rationell design av framtida kliniska prövningar5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av tumörcellsupphängning
Anmärkning: Lämpliga institutionella godkännanden för användning av patientmaterial och djur krävs för att fastställa och upprätthålla primära ortopiska glioma xenografter. Vid Vanderbilt University Medical Center samlas resected tumörmaterial som överstiger det som krävs för diagnostiska ändamål in med patientens samtycke till ett forskningsvävnadsarkiv. Exemplaren är märkta med ett randomiserat 5-siffrigt REDcap-databasnummer och alla patientspecifika identifierare tas bort. REDcap-databasen innehåller avidentifierade kliniska data för varje prov i vävnadsförvaret som inkluderar kön, ålder (i år), ras, överlevnadsstatus, patologi, cancerbehandlingar, år av samband och tid till progression. För att bibehålla steriliteten och optimera framgången för den primära xenograftmetoden bör alla reagenser, ångkarda kirurgiska instrument och operationsstället monteras eller beredas i förväg.
Anmärkning: Gliomaprover innehåller ofta stora mängder myelin och skräp. Beroende på provexemplar storlek kan det vara nödvändigt att använda mer än 4 diskontinuerliga gradientrör för adekvat avlägsnande av myelin och skräp.
Anmärkning: Processen slutförs när det inte finns någon, eller liten, tydligt synlig ostörd vävnad kvar. Undvik införandet av bubblor under triturationsprocessen.
Anmärkning: Cellens livskraft efter dissociation är vanligtvis >90%. Lägre viabiliteter kan återspegla många variabler inklusive suboptimal vävnadshantering eller transporttid från operationssalen, kryopreservationsmetoder eller papaindisociationsteknik. Lägre cellulära viabiliteter kan dock fortfarande vara tillräckliga, så länge ett tillräckligt antal livskraftiga kan transplanteras i lämplig volym. För varje mus implanteras 50 000-200 000 livskraftiga celler i volym av 2 μl. På grund av sprutans fasade spets bör ytterligare 5 μl cellfjädring ingå i den slutliga volymen för att säkerställa att lämpligt material kan dras in i sprutan för varje injektion. För att till exempel injicera 2 μl/mus för 5 möss bör den slutliga volymen vara 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
- Placera nyresektionerat, avidentifierat patientmaterial i en steril, täckt behållare på is för transport till laboratoriet. Bearbeta provexemplaret direkt för transplantation eller kryopreservering av provexemplaret i flytande kväve (se nedan) för lagring i flytande kväve och senare användning.
- Förbered papaindisociationslösningarna (papainlösning, tvätt/proteashämmarlösning och diskontinuerlig gradientlösning) i en steril huva med de kitkomponenter och instruktioner som tillverkaren tillhandahåller. Etikett sterila 15 ml polystyrenkoniska rör och fördela lösningarna enligt följande:
- Rör 1: 5 ml papainlösning
- Rör 2: 3 ml lösning för tvätt/proteashämmare
- Rör 3-6: 5 ml vardera av diskontinuerlig gradientlösning
- Placera gliomprovet i tub 1 med 5 ml papainlösning och triturat med en 5 ml pipett under en 10-20 min tidsperiod.
- Pipett materialet upp och ner 10 gånger och inkubera sedan materialet i 2-3 min vid rumstemperatur innan nästa trekantscykel påbörjas.
- Placera spetsen på 5 ml-pipetten närmare botten av det koniska röret med varje triturationscykel så att spetsen vidrör botten av röret under de senaste 2 cyklerna.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och pipetten pelleten upp och ner 10x i 3 ml av tvätt/proteashämmarlösningen.
- Lägg försiktigt en lika stor volym av suspensionen över var och en av de 5 ml uttjänta gradientlösningarna (rör 3-6), med en pipettor inställd på "gravitations" dispenseringshastigheten.
- Placera rören i en centrifuge utrustad med en svängskoparotor, med accelerationshastigheten reducerad till den lägsta inställningen och bromsen avstängd. Centrifugera vid 76 x g i 12 min vid rumstemperatur. Med bromsen avstängd är centrifugeringen i allmänhet klar efter 20 min.
- Ta bort supernaten, återanvänd och kombinera varje pellet i 5 ml steril balanserad saltlösning och placera cellerna på is.
- Ta bort en del (10-100 μl) av cellupphängningen och bestäm densiteten hos livskraftiga celler genom trypanblå uteslutning med en hemocytometer.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Ta bort supernaten och återanvänd cellpelleten med en densitet av 25 000-125 000 livskraftiga celler per μl.
- Överför en tillräcklig volym av cellfjädringen till ett 200 μl mikrocentrifugrör (PCR-rör) och lägg på is.
2. Förberedelse av kirurgiskt ställe och instrument
Anmärkning: Sterila kirurgiska handskar bärs under proceduren. Beroende på kraven från varje institution kan kirurgiska klänningar, kepsar och ansiktsskydd krävas.
- Förbered en desinficerad bänkskiva för gnagarekirurgi med separerade angränsande områden för djurberedning, operationsfält och djuråtervinning.
- Sterilisera kirurgiska instrument i en ånga autoklav. Använd därefter en varm pärlsteriliseringsmedel för att flashsterilisera instrument när du övergår från ett djur som är föremål för nästa.
3. Induktion, anestesi och analgesi
Anmärkning: Operationer som överstiger 15 min från det att mössen bedövas kräver en kontaktvärmekälla. För att förhindra hypotermi förses mössen med en värmekälla (cirkulerande varmvattenfilt) under för- och postoperativa perioder.
- Förbered ketamin/xylazincocktail för induktionsanestesi så att varje mus får ketamin 100 mg/kg och xylazin 10 mg/kg genom att injicera 10 μl av cocktailen per gram kroppsvikt.
-
Tabell 1. Anestesicocktail.
Lagerkoncentration Volym att förbereda för en mus fem möss tio möss Ketamin 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xylazin 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl Isoton saltlösning 223 μl 1 113 μl 2 225 μl total 250 ul 1 250 μl 2 500 μl - Förbered ketoprofenlösningen för smärtstillande genom att späda ut stamlösningen (10 mg/ml) 1:20 i sterilt, pyogenfritt vatten så att varje mus får en dos på 5 mg/kg genom att injicera 10 μl av lösningen per gram kroppsvikt.
- Väg och registrera presurgisk vikt. Individuella musvikter varierar, men varierar i allmänhet från 18-22 g.
- Injicera 10 μl av ketamin/xylazincocktailen per gram muskroppsvikt i det intraperitoneala utrymmet med en insulinspruta. Injicera till exempel 200 μl för en mus på 20 g.
- Bestäm om musen är helt sövd av tånypa av bakbenet. Det tar i allmänhet 3-5 min för musen att inte längre dra sig ur nypan.
- Injicera 10 μl ketoprofenlösning per gram muskroppsvikt subkutant i flankens lösa hud med en insulinspruta. Injicera till exempel 200 μl för en mus på 20 g.
- Raka håret över skallen med klippare, skrubba den exponerade hårbotten med povidone-jod med en bomullsspetsapplikator och torka sedan en alkoholplatta. Upprepa dessa steg, povidone-jodskrubb och alkoholservett, två gånger till.
- Applicera oftalmisk salva på musens ögon.
- Gör ett 1 cm mittlinjesnitt som sträcker sig från bakom öronen till precis framför ögonen med ett sterilt skalpellblad.
- Placera musen under ett dissekeringsomfång och exponera skallen för att identifiera suturlinjerna. Använd cirkulära rörelser med en borr, centrera ett borrhål 2,5 mm lateralt till knägman och 1 mm bakre till koronala suturen.
4. Intrakraniell transplantation
Anmärkning: Injektionsvolymer som överstiger 2,5 μl kan vara dödliga för möss.
- Placera musen på en stereotaktisk ram genom att haka fast de övre snedställningarna över framtändsstången och applicera näsklämman så att skallen hålls stadigt i neutralt läge.
- Dra 5-10 μl av cellerna i ett mikrocentrifugrör upp och ner flera gånger i en 10 μl Hamilton-spruta fastklämd i sondhållaren på den stereotaktiska manipulatorn för att blanda suspensionen och eliminera bubblor. Tryck ner kolven så att sprutan är laddad med 2 μl (tillräcklig volym för att injicera ett djur).
- Dra i den laterala kanten av hudsnittet för att exponera borrhålet och, med mikromanipulatorn, för in nålen i borrhålet så att den fasade delen är precis under skallytan.
- För fram nålen 3 mm och dra sedan ut nålen 0,5 mm för att skapa ett utrymme för injektion.
- För kolven långsamt över 30 sek och låt sedan nålen stanna kvar i hjärnan i ytterligare 2 minuter. Dra gradvis ut nålen genom att stiga upp 0,5 mm och vänta ytterligare 30 sekunder innan nålen tas bort från hjärnan.
- Ta bort musen från stereotaktiska ramen och stäng såret med ett autoclip.
- Placera musen på en värmande kudde för att bibehålla kroppstemperaturen och kontinuerligt övervaka andningsmönstret och färgen på slemhinnor och exponerade vävnader (fotsulor).
- Placera musen i en steril mikroisolatorbur när den återhämtar sig helt från anestesi (sternal och ambulatorisk) och returnera den till djurinhysningsanläggningen.
5. Djurvård och observation efter implantation
Anmärkning: Den mest tillförlitliga indikationen på tumör engraftment och infiltrativ tillväxt är gradvis, ihållande viktminskning åtföljd av utveckling av hunched hållning och grov hårrock. I sällsynta fall noteras neurologiska underskott som inkluderar ataxi, pares och anfall. Ortopediska primära xenografter är mycket invasiva och utvecklas under en lång tid. Möss manifesterar vanligtvis symtom på tumör tillväxt 3-6 månader efter transplantation.
- Observera möss med ortopediska xenografter dagligen för mat- och vattenintag, beteende, grooming och tecken på infektion vid snittplatsen.
- Administrera ketoprofen (5 mg/kg subkutant, 1-2x per dag) om smärta eller ångest observeras postoperativt.
- Ta bort autoclips 8-10 dagar efter operationen.
- Väg möss varje vecka.
- Övervaka för tecken och symtom på tumör engraftment.
6. Tumörskörd
Anmärkning: Med denna metod innehåller den första koronalskivan (#1) den bakre aspekten av luktlökarna och den främre aspekten av frontalloberna. Engrafted tumör är mest riklig i rätt halvklot av de efterföljande 3 koronar skivor (skiva #2, #3 och #4) och injektion synen är rutinmässigt innesluten i koronar skiva #3. Beroende på experimentella behov kan materialet användas för tumörpassage, frysta vävnadssektioner, formalin fasta paraffin inbäddade vävnadssektioner, flödescytometri av dissocierad vävnad, cellkultur eller lysater för DNA, RNA eller proteinanalys. Delar av tumören kan kryopreserveras för framtida behov med cell livskraft som sträcker sig från 80-95%.
- Avliva möss genom långvarig exponering för koldioxid följt av livmoderhalscancer förskjutning.
- Halshugg avliva avlivade möss vid basen av hjärnan (foramen magnum nivå) med en större par kirurgiska sax, och dra huden från snitt framåt för att helt exponera skallen.
- Ta bort hjärnan.
- Sätt in en spets av ett par fina kirurgiska saxar i den laterala aspekten av foramen magnum till nivån av vänster yttre auditiva meatus för att skära occipital ben längs vänster sida av skallen. Utför samma snitt på höger sida.
- Skär occipitalbenet längs ett koronalplan från en extern auditiv meatus till den andra och ta bort benet för att exponera lillhjärnan.
- Skär näsbenplattorna mellan ögonen.
- Skär sagital sutur genom att skära bakre längs sagittal suturen från näsbenplattorna till knät. Slutför mittlinjen snitt längs sagittal sutur genom att skära främre från lambda till bregma.
- Sätt försiktigt in spetsen på ett fint par tång längs sagittalöppningen på varje sida för att riva någon dural vidhäftning av skallen till hjärnan och skala sedan de två skallhalvorna i sidled för att exponera hjärnan och luktlökarna dorsalt.
- Skjut tången mellan den ventrala aspekten av luktlökarna och skallen för att frigöra eventuella vidhäftningar.
- Luta skallen bakåt så att hjärnan kan dras tillbaka så att optiken och andra hjärnnerv exponeras. Skär av kranialnerverna för att frigöra hjärnan i en maträtt som innehåller steril PBS.
- Överför hjärnan med en vågspatel till en matrishyvel och generera 2 mm koronarskivor med rakblad.
- Ordna koronarskivorna i en maträtt som innehåller steril PBS för vidare visuell inspektion och ytterligare vävnadsbehandling.
7. Tumör Cryopreservation
- Förbered en lagerlösning av kryopreservationsmedium.
- Tillsätt 50 ml spridningstillskott, 5 ml 100x penicillin och streptomycinlösning och 450 μl 0, 2% heparin till 450 ml basalt medium.
- Förvara lagerlösningen vid 4 °C skyddad mot ljus.
- Förbered en fungerande lösning av kryopreservationsmedium.
- Kombinera 47,5 ml kryopreservationsmedium och 2,5 ml steril DMSO i ett koniskt rör på 50 ml polypropylen och blanda väl.
- Alikvot 1,0 ml arbetslösning på varje kryovial och förvaras vid 4 °C skyddad mot ljus.
- Placera en 2 mm koronal skiva xenografted hjärna i en kryovial som innehåller kryopreservation medium på is.
- Lock injektionsflaskan ordentligt och placera den i en frysbehållare vid -80 °C. Överför kryovialen följande dag till en flytande kvävetank för längre lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissocierade gliomceller transplanteras direkt i hjärnan hos immunkomprometterade möss för att erhålla primära ortopiska xenograftlinjer. Varje tumörprov tilldelas ett randomiserat nummer före transplantation, som en del av avidentifieringsprocessen för att ta bort skyddad hälsoinformation. Vi använder ett 5-siffrigt REDcap-databasnummer för detta ändamål. Figur 1 illustrerar processen och nomenklaturen för att upprätta en xenograft linje från en glioblastom (GBM 17182) med isocitrate dehydrogenas 1 (IDH1) mutation arginin 132 till histidin (R132H). Efter transplantation läggs ett "X" till tumöridentifieringsnumret för att beteckna xenografted tumör, följt av ett "P" för att spåra passagenumret. P0 betecknar den första transplantationsmottagaren och P1 betecknar mottagarmöss av den första xenograftpassagen. Vanligtvis transplanteras 3-5 möss initialt för att upprätta en linje och xenografted tumör passages sedan in i 10 mottagare möss (P1) för att utöka linjen för framtida studier.
Efter ortopisk transplantation övervakas mottagarmöss för tecken och symtom på tumörengraftment och tillväxt. Den känsligaste indikationen på tumör engraftment är betydande och ihållande viktminskning. Eftersom möss transplanteras i ung ålder förväntas postoperativ viktökning. Mus vikter kan fluktuera på till synes dramatiskt sätt från vecka till vecka, men ihållande förlust av mer än 3 g är i allmänhet en bra indikation på tumör engraftment. Vanligtvis utvecklar de flesta möss i en xenograft kohort viktminskning under en liknande tidsperiod som sträcker sig från så kort som 60 dagar till så länge som 350 dagar beroende på tumör. Median överlevnadstider för en given tumör är i allmänhet likartade från passage till passage när samma antal tumörceller transplanteras varje gång. Illustrerad i figur 2 är en kohort på 5 möss transplanterade med en GBM (17182XP2) som tidigare hade blivit instärpt och passaged en gång tidigare. Fyra av de fem 17182XP2 mössen visade betydande viktminskning 17 veckor efter transplantation. Den återstående musen (mus 3) uppvisade inte viktminskning och ingen tumör upptäcktes vid obduktionen, vilket indikerar tumören i endast 80% av mottagarna.
När hjärnan hos en symptomatisk mus skördas är en hjärnskurermatris ett extremt värdefullt verktyg för vävnadsbehandling. Genereringen av flera, anatomiskt definierade sektioner från varje hjärna möjliggör flera analyssätt med vissa delar och kryopreservation av andra delar av vävnaden. Till exempel kan mutationsstatus för IDH1 bedömas genom Sanger-sekvensering med material från en del eller immunohistokemi med en annan (figur 3). Tumör engraftment kan vara lätt framgår av visuell inspektion av de koronal avsnitten, men histologi med immunohistokemi kan krävas för vissa xenografts (figurerna 4 och 5). När man tar avstånd från en xenograft för seriell passage eller andra studier är det viktigt att börja med en liten och definierad del av materialet så att myelin och skräp kan avlägsnas på lämpligt sätt (figur 6). Den diskontinuerliga lutningen i Papain Dissociation System är bäst lämpad för bearbetning av små delar av en vuxen mushjärna. Vi rekommenderar att du skär varje koronarsektion längs mittlinjen och använder två diskontinuerliga gradienter för varje halvlek.
Figur 1. Primära ortopediska xenograft linjer upprättas genom transplantation dissociated glioma celler direkt i hjärnan hos immunkomprometterade möss och sedan expanderas genom seriell transplantation. Heterozygous somatiska mutationer vid arginin 132 av IDH1 genen förekommer i mer än 70% av diffusa astrocytomer, oligodendrogliomas, oligoastrocytomas och sekundära glioblastomas och mindre än 7% av primära glioblastomas. GBM 17182 innehåller den vanligaste IDH1 mutationen, arginin 132 till histidin (R132H). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Tillväxtkurvor av seriella transplantation mottagare av GBM 17182XP1 visar betydande viktminskning 130-150 dagar efter kirurgi i 4 av 5 GBM 17182XP2 möss. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Heterozygous, somatiska IDH1 R132H mutation i patienten tumör (GBM 17182) och primära xenograft (17182XP0) kan detekteras av Sanger sekvensering eller antikroppar färgning. Immunohistokemi med en IDH1 R132H-specifik antikropp visar mutanta gliom celler tätt grupperade runt blodkärl eller i mer diffust infiltrerade regioner i patienten exemplar och mus hjärnan. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Primära ortopediska xenografter uppvisar mycket infiltrativ tillväxt som kan vara svår att fullt ut uppskatta enbart genom hematoxylin och eosin (H & E). Immunohistokemi med en humanspecifik antikropp är en särskilt användbar metod för att identifiera insupna mänskliga celler. Anti-human vimentin färgning av en analplastisk oligoastrocytoma xenograft (14175XP2) avslöjar typiska funktioner i en infiltrativ gliom med en diffus tumör massa i injiceras höger halvklotet och invasiv tillväxt längs myelinated skrifter i corpus callosum (asterisker) och striatopallidal fibrer (svarta pilspetsar) och leptomeningeal spridning (svart pil). Inte uppskattat vid denna förstoring (1.25X) är kluster av mänskliga tumörceller runt mus nervceller (perineuronal satellitosis) i den invaderade cortex. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. Analys av analplastic oligoastrocytoma 14175XP2 koronal sektioner vid högre effekt (40X) i boxade regioner A-C avslöjar IDH mutant mänskliga celler runt blodkärl (region A), i striatopallidal skrifter ("blyertsfibrer;" region B) och corpus callosum (region C). Som med GBM 17182XP2 visar IDH1 R132H färgning av anaplastic oligoastrocytoma 14175XP2 att IDH mutation upprätthålls i en primär ortopisk xenograft efter seriella passager i mottagarmöss. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 6. Mänskliga tumörceller kan särskiljas från musceller i dissocierade xenografter baserat på storlek. För att kvantifiera mänskliga tumörceller i en dissocierad xenograft för seriell passage identifieras mänskliga celler i en hemocytometer under ljusmikroskopi med sin stora storlek och mörkgröna luminiscens (pilspetsar). Genom flödescytometri har mänskliga celler distinkta spridningsegenskaper från musmaterial och kan portas för vidare analys. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Odlade cellinjer, xenografter och genetiskt konstruerade möss är de vanligaste metoderna för modellering av gliom, och det finns tydliga fördelar och begränsningar för varje modellsystem3,13,14. Relevanta fördelar med primära ortopic glioma xenografts inkluderar infiltrativ tillväxt som kännetecknar diffusa gliomas och bevarandet av genetiska förändringar och viktiga signaleringsmekanismer som kan vara mycket svåra att upprätthålla i odlade gliom celler. Till exempel kan i socitrat dehydrogenasmutationer och Sonic igelkott ligand produktion upprätthållas i primära ortopediska xenografts15,16 men endast sällan iodlade gliom celler14,17-19. Det är dock viktigt att överväga betydande nackdelar med primära ortopediska xenografter, beroende på experimentella behov. Trots tillgång till adekvat patientmaterial är det svårare att mäta gliomtillväxt över tid i hjärnan än på en heterotopisk plats. Dessutom växer primära ortopotop xenografts i en betydligt långsammare takt än heterotopic xenografts. Således kan utredare föredra att transplantera celler i flanken av en immunkomprometterad mus, där viktiga histologiska och molekylära funktioner också kan behållas4.
Två viktiga överväganden för att fastställa primära ortopic xenografts är typen av immunkomprometterade mus mottagare och betyget av glioma malignitet. Vi har haft kraftigt begränsad framgång med att etablera primära xenografter hos athymiska (nu-nu) möss och lika bra framgång med NOD / SCID och NSG (NOD /SCID / Interleukin-2 receptor gamma kedja bristfälliga) möss. NSG-möss är föredragna mottagare på grund av ökad engraftmenthastighet av tumörogena celler och längre livslängd jämfört med NOD / SCID-möss20,21. När det gäller WHO tumör betyg, vi har observerat glioma engraftment av klass III och IV tumörer men inte kvaliteter I och II.
För primära ortopediska gliom xenografter kan dissocierade tumörceller transplanteras direkt i hjärnan hos immunkomprometterade möss9 eller tumörinitierande celler kan vara prospektivt isolerade (till exempel genom att välja CD133-uttrycksceller) för transplantation22. Endera källan till celler är lämplig för framgångsrik tumör engraftment i vår erfarenhet15,16, även om användningen av CD133-berikade celler kräver mer startmaterial. Oavsett om man förbereder sorterade eller osorterade celler för transplantation är det viktigt att på ett adekvat sätt ta bort myelin och skräp från dissocierade gliomprover. Underlåtenhet att på ett adekvat sätt ta bort myelin och skräp hindrar markant förmågan att dra suspensionen till en Hamilton-spruta och transplantera ett enhetligt antal celler till varje mottagare. Efter papain dissociation, Det är användbart att utvärdera en liten aliquot med hjälp av en hemocytometer för att bestämma antalet diskontinuerliga gradientrör som kommer att krävas för att tillräckligt eliminera myelin och skräp. Fullständig borttagning är inte genomförbart, men man kan få en uppskattning för svårigheten att kvantifiera celler i ett dissocierat prov före myelin avlägsnande och den relativa lättheten efter avlägsnande med diskontinuerliga gradienter.
Utbytet av livskraftiga celler från dissocierade patientprover kan vara mycket varierande. Optimalt transplanteras 105 celler till var och en av fem mottagarmöss, men vi har fått engraftment med så få som 3 000 celler/djur. Ungefär hälften av de primära maligna gliom exemplar (WHO grader III och IV) som vi har transplanterat har ingraferat i 40-100% av de ursprungliga mottagande mössen. Efter ortopisk transplantation måste mottagarmöss vägas varje vecka och övervakas regelbundet för tecken och symtom på tumörtransplantation och tillväxt. Primära ortopediska xenografter visar diffusa, infiltrativa tillväxt och focal neurologiska symtom såsom hemiparesis eller beslag observeras endast i sällsynta fall. Den känsligaste indikationen på tumör engraftment är betydande och ihållande viktminskning som kan åtföljas av utveckling av hunched hållning, grov hårrock eller kupolskalle. Den hastighet med vilken möss utvecklar ihållande viktminskning är mycket varierande beroende på patientprovet och kan variera från 60-350 dagar. NSG möss väger vanligtvis 18-25 g vid transplantation och uppnår postoperativt vuxna vikter på 28-33 g. Strömaterial bör ändras regelbundet eftersom burförhållandena i stor utsträckning kan förändra djurens vikter. Ett djurs vikter kan fluktuera med så mycket som ett gram från en vecka till nästa, och att avgöra om detta representerar tumören kan vara svårt. En bra indikation på tumörengraftment hos NSG möss som har uppnått vuxna vikter är ihållande viktminskning på mer än 3 g. Även om ingraferade möss vanligtvis utvecklar gradvis viktminskning som kan mätas under en flera veckors period, ibland kan ett djurs hälsa minska snabbt på grund av tumörtillväxt, efter utvecklingen av vattenskalle till exempel, eller från icke-relaterade orsaker som infektion.
Efter dödshjälp, tumör engraftment kanske inte lätt framgår av brutto inspektion av hjärnan och histologiska bekräftelse är viktigt. För initiala tumör mottagare, bearbetar vi varje hjärna på samma sätt så att en del utvärderas histologiskt och andra portioner är cryopreserved för efterföljande tumör passage om engraftment verifieras. Som diskuterats ovan placeras hjärnan i en matris utsnitt för att generera 2 mm koronar skivor med varje skiva som representerar en definierad region i hjärnan längs den främre till bakre axeln. Koronal skiva #3, som rutinmässigt innehåller injektionsstället, fixeras i formalin och var och en av de återstående skivorna placeras i en separat, märkt kryovial som innehåller 1 ml kryopreservationsmedium. Formalin fasta paraffin inbäddade (FFPE) bilder är färgade med hematoxylin och eosin för att utvärdera histologin och med antikroppar mot Ki67 och humant vimentin för att visualisera instärkta celler.
När engraftment har verifierats, tumör kan passeras och engraftment priser i sekundära mottagare är vanligtvis högre på 80-100%. Vi rekommenderar att du för första gången i ett större antal mottagande möss passaging en tumör så att adekvat cryopreserved material kan genereras för att upprätthålla en given tumör linje vid låg passage (2-5) för framtida studier. Median överlevnadstider för en given tumör är i allmänhet likartade från passage till passage när samma antal tumörceller transplanteras varje gång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi står särskilt i skuld till patienter vid Vanderbilt University Medical Center som tillhandahöll ovärderligt forskningsmaterial för Molecular Neurosurgical Tissue Bank. Vi tackar dem som grundade och underhåller Tissue Bank, Reid C. Thompson MD (huvudutredare), Cherryl Kinnard RN (forskningssjuksköterska) och Larry A. Pierce MS (chef). Histologiska tjänster utfördes delvis av Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (med stöd av award 5P30 CA068485 till Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Detta arbete stöddes av bidrag till MKC från NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fund och VMC-utvecklingsfonder. MKC stöds av Institutionen för veteranfrågor, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development genom anslag 1 I01 BX000744-01. Innehållet representerar inte åsikterna från departementet för veteranfrågor eller USA:s regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
