Summary
Злокачественные глиомы представляют собой неоднородную группу высокоинфильтративных глиальных неоплазм с различными клиническими и молекулярными особенностями. Первичные ортопедические ксенотрансплантологии подтипы гистопатологических и молекулярных новообразований в доклиниковых моделях животных.
Abstract
Злокачественные глиомы представляют собой неоднородную группу высокоинфильтративных глиальных неоплазм с различными клиническими и молекулярными особенностями. Первичные ортопедические ксенотрансплантологии подтипы гистопатологических и молекулярных новообразований в доклиниковых моделях животных. Для моделирования ВОЗ III и IV классов злокачественных глиом в трансплантации анализы, человеческие опухолевые клетки ксенотрансплантированы в ортопедическое место, мозг, иммунокомпромиссных мышей. В отличие от вторичных ксенотрансплантатов, которые используют культурные опухолевые клетки, клетки глиомы человека отмежеваются от ресектированных образцов и пересажены без предварительного прохождения в культуре тканей для генерации первичных ксенотрансплантатов. Процедура в этом отчете детали подготовки образца опухоли, внутричерепной трансплантации в иммунокомпромиссных мышей, мониторинг для опухолевого прихлатения и опухоли сбора для последующего прохождения в реципиент животных или анализа. Препарат опухолевых клеток требует 2 часа, а хирургическая процедура требует 20 мин/животное.
Introduction
Злокачественные глиомы являются первичными глиальными опухолями центральной нервной системы, которые возникают в головном мозге, а иногда и спинном мозге. Глиомы классифицируются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в соответствии с гистологическим сходством с астроцитами, олигодендроцитами или эпендимальными клетками, а затем численно градуированы (от I до IV) на патологические особенности злокачественности. Наиболее распространенными гистологическими подтипами являются астроцитомы, олигодендроглиомы и смешанные олигоастроцитомы. Злокачественные глиомы, охватывающие II-IV классы ВОЗ, характеризуются инвазивным ростом и непокорностью современных методов лечения. Каждый год в Соединенных Штатах, около 15750 человек с диагнозом злокачественной глиомы и, по оценкам, 12740 пациентов поддаются этому заболеванию. Эти статистические данные подчеркивают особенно смертоносный характер злокачественных глиом и важную потребность в повышении терапевтической эффективности.
Модели рака имеют важное значение для изучения биологии опухолей и терапии. Линии раковых клеток человека представляют собой важный первый шаг для манипуляций в пробирке и исследований ксенотрансплантации виво (вторичные ксенотрансплантаты)1. Тем не менее, стандартные культуры раковых клеток проходят фенотипические и генотипическиепреобразования 2-4, которые не могут быть восстановлены во вторичных ксенотрансплантатах5. Кроме того, генетические изменения, такие как изоцитратдегидрогеназы( IDH )мутации 6, различные популяциистволовых клеток 7 и зависимость от ключевыхсигнальных путей 8 могут быть потеряны в культурах раковых клеток. Геномные профили могут быть сохранены в большей степени в культуре сферы рака, хотя все еще не в состоянии полностью отразить генотиппервичных опухолей 2,3. Прямая ортотопическая трансплантация сводит на нет влияние культуры in vitro, обеспечивает надлежащую микроокноронику и сохраняет целостность опухолевых инициируяклеток 9,10. Таким образом, первичные ксенотрансплантанты представляют собой мощную и соответствующую доклиническую модель для тщательного тестирования целевых агентов, чтобы помочь в рациональномдизайне будущих клинических испытаний 5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка подвески опухолевых клеток
Примечание: Для установления и поддержания первичных ортотопических глиом ксенотрансплантатов необходимы соответствующие институциональные разрешения на использование материалов и животных пациентов. В медицинском центре Университета Вандербильта с согласия пациента собирается ресектирован опухолевый материал, превышающий тот, который необходим для диагностических целей. Specimens помечены рандомизированным 5-значным номером базы данных REDcap и все идентификаторы пациента удаляются. База данных REDcap содержит опоясывающие клинические данные по каждому экземпляру в репозитории тканей, которые включают пол, возраст (в годах), расу, статус выживания, патологию, лечение рака, год ресекции и время для прогрессирования. Для поддержания стерильности и оптимизации успеха первичного метода ксенотрансплантата все реагенты, паровые хирургические инструменты и хирургическое отделение должны быть собраны или подготовлены заранее.
Примечание: Образцы Глиомы часто содержат большое количество миелина и мусора. В зависимости от размера образца, может потребоваться использовать более 4 прерывистых градиентных труб для адекватного удаления миелина и мусора.
Примечание: Процесс завершается, когда нет, или мало, четко видны несоциированные ткани, оставшиеся. Избегайте введения пузырьков во время процесса тритурации.
Примечание: Жизнеспособность клеток после диссоциации, как правило, >90%. Более низкие viabilities могут отразить много переменных включая suboptimal обработку ткани или время перевозки от операционной комнаты, метода криоконсервации, или метода диссоциации папаина. Однако более низкая виабильности клеток может быть адекватной до тех пор, пока достаточное количество жизнеспособных может быть пересажено в соответствующем объеме. Для каждой мыши имплантируется 50 000-200 000 жизнеспособных клеток объемом 2 мл. Из-за скошенного кончика шприц-иглы, дополнительные 5 мкл клеточной суспензии должны быть включены в окончательный объем для обеспечения того, чтобы адекватный материал может быть втянут в шприц для каждой инъекции. Например, для введения 2 мкл/мышь для 5 мышей конечный объем должен быть 15 мкл (15 мкл) (5 х 2 мл) и 5 мкл).
- Поместите свежеотбранный, идентифицированный материал пациента в стерильный, ограниченный контейнер на льду для транспортировки в лабораторию. Обработать образец непосредственно для трансплантации или криопресерв образца в жидком азоте (см. ниже) для хранения в жидком азоте, а затем использовать.
- Подготовьте растворы диссоциации папаина (раствор папаина, раствор ингибитора мытья/протеазы и раствор прерывистого градиента) в стерильном капюшоне с компонентами комплекта и инструкциями, предоставленными производителем. Этикетка стерильные 15 мл полистирола конические трубки и распространять решения следующим образом:
- Трубка 1: 5 мл раствора папаина
- Трубка 2: 3 мл раствора ингибитора мытья/протеазы
- Трубы 3-6: 5 мл каждого из прерывистого градиентного раствора
- Поместите образец глиомы в трубку 1 с 5 мл раствора папаина и тритурата с 5 мл пипетки в течение 10-20 минут периода времени.
- Pipette материал вверх и вниз 10 раз, а затем инкубировать материал в течение 2-3 минут при комнатной температуре, прежде чем инициировать следующий цикл тритурации.
- Распоить кончик 5 мл пипетки ближе к нижней части конической трубки с каждым циклом тритурации таким образом, что кончик касается нижней части трубки в течение последних 2 циклов.
- Центрифуга при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и пипетку гранулы вверх и вниз 10x в 3 мл раствора ингибитора мытья / протеазы.
- Тщательно слой равный объем подвески над каждым из 5 мл прерывистый градиент решений (трубы 3-6), с пипетки, установленные на "гравитации" обойтись скорость.
- Поместите трубки в центрифугу, оснащенную качающихся ковшом ротора, с ускорением скорость снижена до самой низкой настройки и тормоз выключен. Центрифуга при температуре 76 х г в течение 12 мин при комнатной температуре. С выключенным тормозом центрифуга, как правило, завершается через 20 минут.
- Удалите супернатант, рсуспенденные и объединить каждую гранулу в 5 мл стерильного сбалансированного раствора соли и поместить клетки на лед.
- Удалите часть (10-100 мкл) клеточной подвески и определите плотность жизнеспособных клеток путем трипан-голубого исключения с помощью гемоцитометра.
- Центрифуга по 300 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы при плотности 25 000-125 000 жизнеспособных клеток на йл.
- Перенесите достаточный объем клеточной подвески в микроцентрифугную трубку (ПЦР-трубку) и поместите на лед.
2. Подготовка хирургического сайта и инструментов
Примечание: Во время процедуры носят стерильные хирургические перчатки. В зависимости от требований каждого учреждения, хирургические платья, шапки и лица охранников может потребоваться.
- Подготовьтесь к дезинфицированной скамейке для операции на грызунах с разделенными прилегающими участками для приготовления животных, эксплуатации поля и восстановления животных.
- Стерилизовать хирургические инструменты в паровом автоклаве. Впоследствии используйте стерилизатор горячего бисера для флэш-стерилизации инструментов при переходе от одного животного к следующему.
3. Индукция, анестезия и анальгезия
Примечание: Операции, превышающие 15 минут с времени анестезии мышей требуют контактного источника тепла. Чтобы предотвратить переохлаждение, мышам предоставляется источник тепла (циркулирующее одеяло горячей воды) в до- и послеоперационный периоды.
- Приготовьте кетамин/ксилазин для индукционной анестезии, чтобы каждая мышь получила кетамин 100 мг/кг и ксилазин 10 мг/кг путем введения 10 мл коктейля на грамм массы тела.
-
Таблица 1. Коктейль анестезии.
Концентрация запасов Объем для подготовки к одна мышь пять мышей десять мышей Кетамин 100 мг/мл 25 хл 125 хл 250 мкл Ксилазин 100 мг/мл 2,5 мл 12,5 мл 25 хл Изотонический солевой раствор 223 хл 1113 кл 2225 мкл итог 250 ул. 1250 мкл 2500 мкл - Приготовьте кетопрофеновый раствор для анальгезии, разбавляя раствор бульона (10 мг/мл) 1:20 стерильной, без pyogen водой, чтобы каждая мышь получила дозу 5 мг/кг путем введения 10 мкл раствора на грамм массы тела.
- Взвешивание и запись предургического веса. Индивидуальные веса мыши различаются, но обычно варьируются от 18-22 г.
- Ввпрыснуть 10 мкл кетамина/ ксилазина коктейль на грамм массы тела мыши в внутриперитонеамном пространстве с инсулиновым шприцем. Например, ввись 200 мкл для мыши 20 г.
- Определите, является ли мышь полностью анестезирован ногой щепоткой задней ноги. Как правило, это занимает 3-5 минут для мыши больше не выйти из щепотки.
- Ввините 10 мкл кетопрофенового раствора на грамм массы тела мыши подкожно в рыхлую кожу фланга с помощью инсулинового шприца. Например, ввись 200 мкл для мыши 20 г.
- Бритье волос над черепом с клиперами, скраб подвергаются скальп с povidone-йод с помощью хлопка наконечник аппликатора, а затем протрите спиртовой площадке. Повторите эти шаги, povidone йод скраб и спиртовой салфетки, еще два раза.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
- Сделайте разрез средней линии 1 см, простирающийся из-за ушей прямо перед глазами стерильным скальпельовым лезвием.
- Поместите мышь под область вскрытия и разоблачить череп, чтобы определить линии шва. Используя круговые движения с дрелью, центр заусенцев отверстие 2,5 мм боковой к брегме и 1 мм задней корональной шва.
4. Внутричерепная трансплантация
Примечание: Объемы инъекций, превышающие 2,5 мкл, могут быть смертельными для мышей.
- Распоистите мышь на стереотаксической раме, зацепив верхние резцы над резцом и применив зажим для носа так, чтобы череп прочно удерживался в нейтральном положении.
- Нарисуйте 5-10 мкл клеток в микроцентрифуг трубки вверх и вниз несколько раз в 10 мкл Гамильтон шприц зажат в зонде держатель стереотаксического манипулятора, чтобы смешать подвеску и устранить пузырьки. Угнетать поршень так, чтобы шприц загружался 2 мл (адекватный объем для инъекций одного животного).
- Потяните боковой край разреза кожи, чтобы разоблачить отверстие заусенцев и, с микроманипулятором, ввести иглу в отверстие заусенца так, чтобы скошенная часть была чуть ниже поверхности черепа.
- Заранее иглы 3 мм, а затем снять иглу 0,5 мм, чтобы создать пространство для инъекций.
- Заранее поршень медленно более 30 сек, а затем позволить иглы оставаться в мозге в течение дополнительных 2 минут. Свяжте иглу постепенно, поднимаясь на 0,5 мм и ожидая дополнительных 30 сек, прежде чем удалить иглу из мозга.
- Удалите мышь из стереотаксической рамы и закройте рану автоклипом.
- Поместите мышь на согревающий коврик для поддержания температуры тела и непрерывно контролировать дыхание и цвет слизистых оболочек и открытых тканей (подошвы ног).
- Поместите мышь в стерильную клетку микроизолатора, как только она полностью оправиться от анестезии (стернальной и амбулаторной), и вернуть его в животное жилье объекта.
5. Постимплантация ухода за животными и наблюдения за животными
Примечание: Наиболее надежным признаком опухолевого притяжения и инфильтративного роста является постепенная, устойчивая потеря веса, сопровождаемая развитием сгорблевший осанки и грубой шерсти волос. В редких случаях, неврологические дефициты отмечаются, которые включают атаксия, парез, и судороги. Ортопедические первичные ксенотранспланты являются высокоинвазивными и развиваются в течение длительного периода времени. Мыши обычно проявляют симптомы роста опухоли через 3-6 месяцев после трансплантации.
- Наблюдайте за мышами с ортопедическими ксенотрансплантами ежедневно для приема пищи и воды, поведения, ухода и признаков инфекции в месте разреза.
- Администрирование кетопрофена (5 мг/кг подкожно, 1-2x в день), если боль или дистресс наблюдаются послеоперационно.
- Удалить автоклипс через 8-10 дней после операции.
- Взвешивание мышей еженедельно.
- Мониторинг признаков и симптомов опухолевого прихвасы.
6. Сбор опухолей
Примечание: По этому методу первый корональный #1 (см. врез) содержит задний аспект обонятельных луковиц и передний аспект лобных долей. Присытытая опухоль наиболее распространенным в правом полушарии последующих 3 корональных ломтиков (ломтик #2, #3 и #4) и инъекции зрение обычно содержится в корональной ломтик #3. В зависимости от экспериментальных потребностей, материал может быть использован для прохождения опухоли, замороженных секций тканей, формалин фиксированных парафин встроенных секций тканей, поток цитометрии диссоциированной ткани, клеточной культуры или лизолатов для анализа ДНК, РНК или белка. Части опухоли могут быть криоконсервированы для будущих потребностей с жизнеспособностью клеток, начиная от 80-95%.
- Усыпляйте мышей длительным воздействием двуокиси углерода с последующим вывихом шейки матки.
- Обезглавить усыпанных мышей в основании мозга (уровень foramen magnum) с большими ножницами хирургии, и вытащить кожу из разреза вперед, чтобы полностью разоблачить череп.
- Удалите мозг.
- Вставьте один кончик пары тонких хирургических ножниц в боковой аспект foramen magnum до уровня левого внешнего слухового мяса, чтобы сократить затылчной кости вдоль левой стороны черепа. Выполните тот же разрез на правой стороне.
- Вырезать затылочной кости вдоль корональной плоскости от одного внешнего слухового мяса к другому и удалить кости подвергать мозжечок.
- Вырезать носовые костные пластины между глазами.
- Вырезать sagittal шва путем резки задней вдоль sagittal шва от носовых костных пластин к брегме. Завершите разрез средней линии вдоль сагиттального шва, разрезая переднюю от лямбды до брегмы.
- Тщательно вставьте кончик тонкой пары типсов вдоль сагиттального отверстия с каждой стороны, чтобы разорвать любые дурные адгезии черепа в мозг, а затем очистить две половины черепа боковой подвергать мозга и обонятельные луковицы спинно.
- Сдвиньте типсы между желудочковым аспектом обонятельных луковиц и черепа, чтобы освободить любые спайки.
- Наклоните череп назад, чтобы мозг был убран так, чтобы зрительные и другие черепные нервы подвергались воздействию. Разорвать черепные нервы, чтобы освободить мозг в блюдо, содержащее стерильные PBS.
- Перенесите мозг с помощью шпателя для взвешивания на матричный срез и генерируем 2-мм корональных ломтиков с лезвиями бритвы.
- Упорядочить корональных ломтиков в блюдо, содержащее стерильные PBS для дальнейшего визуального осмотра и дальнейшей обработки тканей.
7. Криоконсервация опухолей
- Подготовье запасного раствора криоконсервации среды.
- Добавьте 50 мл добавки пролиферации, 5 мл 100x пенициллина и раствора стрептомицина, и 450 мкл 0,2% гепарина до 450 мл базальной среды.
- Храните решение для запасов при 4 градусах Цельсия, защищенном от света.
- Подготовь рабочее решение криоконсервации среды.
- Смешайте 47,5 мл криоконсервации среднего и 2,5 мл стерильной ДМСО в 50 мл полипропиленовой конической трубки и хорошо перемешайте.
- Aliquot 1,0 мл рабочего раствора для каждого криовиального и хранить при 4 градусов по Цельсию защищены от света.
- Поместите один 2 мм коронный кусочек ксенотрансплантированных мозга в криовиальный, содержащий криоконсервации среды на льду.
- Плотно крышка флакона и поместите его в замораживающий контейнер при -80 градусов по Цельсию. Перенесите криовиальный на следующий день в резервуар с жидким азотом для более длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диссоциированные клетки глиомы пересаживаются непосредственно в мозг ослабленных иммунитетом мышей для получения первичных ортопедических линий ксенотрансплантата. Каждому образцу опухоли присваивается рандомизированное число до трансплантации, как часть процесса деидентификации для удаления защищенной медицинской информации. Для этого мы используем 5-значный номер базы данных REDcap. Рисунок 1 иллюстрирует процесс и номенклатуру для создания линии ксенотрансплантата от глиобластомы (GBM 17182) с изоцитратом дегидрогеназы 1 (IDH1) мутации аргинина 132 до гистидина (R132H). После трансплантации к идентификационному номеру опухоли добавляется "X", обозначая ксенотрансплантированную опухоль, а затем "P" для отслеживания номера прохода. P0 обозначает первоначальный реципиент трансплантации и P1 обозначает мышей-реципиентов первого прохода ксенотрансплантата. Как правило, 3-5 мышей первоначально пересаживаются, чтобы установить линию и ксенотрансплантированные опухоли затем передается в 10 мышей-реципиентов (P1), чтобы расширить линию для будущих исследований.
После ортопедической трансплантации, реципиент мышей контролируются на наличие признаков и симптомов опухолевого притязания и роста. Наиболее чувствительным признаком опухолевого присвещания является значительная и устойчивая потеря веса. Как мышей пересаживают в молодом возрасте, послеоперационное увеличение веса, как ожидается. Мышь веса могут колебаться в, казалось бы, драматические моды от недели к неделе, однако понесли потерю более 3 г, как правило, хорошим признаком опухоли engraftment. Как правило, большинство мышей в когорте ксенотрансплантата развивать потерю веса в течение аналогичного периода времени, начиная от всего 60 дней до тех пор, как 350 дней в зависимости от опухоли. Среднее время выживания данной опухоли, как правило, похожи от прохода к проходу, когда одинаковое количество опухолевых клеток пересаживается каждый раз. Иллюстрированный на рисунке 2 когорта из 5 мышей пересажены с GBM (17182XP2), которые ранее были приусадили и прохода один раз. Четыре из пяти мышей 17182XP2 продемонстрировали значительную потерю веса через 17 недель после трансплантации. Оставшаяся мышь (мышь 3) не проявляла потери веса, и при посмертном обследовании не было обнаружено опухоли, что указывает на присвекание опухоли только у 80% реципиентов.
Когда мозг симптоматической мыши собирают, матрица мозга срез является чрезвычайно ценным инструментом для обработки тканей. Поколение нескольких, анатомически определенных секций из каждого мозга позволяет несколько режимов анализа с некоторыми частями и криоконсервации других частей ткани. Например, мутационный статус IDH1 может быть оценен секвенированием Сэнгера с материалом из одной части или иммуногистохимией с другой(рисунок 3). Опухолевый привсчитие может быть легко очевидным путем визуального осмотра корональных секций, однако, гистология с иммуногистохимией может потребоваться для некоторых ксенотрансплантов(рисунки 4 и 5). При диссоциации ксенотрансплантата для последовательного прохождения или других исследований, важно начать с небольшой и определенной части материала, так что миелин и мусор могут быть надлежащим образом удалены (Рисунок 6). Прерывистый градиент системы диссоциации папайна лучше всего подходит для обработки небольших частей мозга взрослой мыши. Мы рекомендуем разрезать каждый коронный участок вдоль средней линии и использовать два прерывистых градиента для каждой половины.
Рисунок 1. Первичные линии ортотопического ксенотрансплантата устанавливаются путем трансплантации диссоциированных клеток глиомы непосредственно в мозг мышей с ослабленным иммунитетом, а затем расширяется путем серийной трансплантации. Гетерозиготные соматические мутации в аргинине 132 гена IDH1 происходят в более чем 70% диффузных астроцитом, олигодендроглиом, олигоастроцитом и вторичных глиобластом, и менее 7% первичных глиобластом. GBM 17182 содержит наиболее распространенную мутацию IDH1, аргинин 132 к гистидину (R132H). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. Кривые роста серийных реципиентов трансплантации GBM 17182XP1 демонстрируют значительную потерю веса через 130-150 дней после операции у 4 из 5 ГБМ 17182XP2 мышей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Гетерозиготная, соматическая мутация IDH1 R132H в опухоли пациента (GBM 17182) и первичный ксенотрансплант (17182XP0) могут быть обнаружены с помощью секвенирования Сэнгера или окрашивания антител. Иммуногистохимия с антителом IDH1 R132H демонстрирует мутантные клетки глиомы, плотно сгруппированные вокруг кровеносных сосудов или в более диффузно проникшие области образца пациента и мозга мыши. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 4. Первичные ортопедические ксенотранспланты отображают высоко инфильтративный рост, который может быть трудно в полной мере оценить только гематоксилином и эозином (H и E). Иммуногистохимия с человеческим антителом является особенно полезным методом для выявления притязающих клеток человека. Анти-человеческое виментиновое окрашивание анальпластической олигоастроцитомы ксенотрансплантата (14175XP2) выявляет типичные особенности инфильтративной глиомы с диффузной опухолевой массой в инъекционной правом полушарии и инвазивным ростом вдоль миелинированных участков корпуса каллосума (звездочки) и стриатопалоидных волокон (черных наконечников) и стриатопалоидных волокон (черных наконечников) и стриатопалидальных волокон. Не ценится при этом увеличении (1,25X) является кластеризация опухолевых клеток человека вокруг нейронов мыши (перинеурональный сателлитоз) в вторглись коры. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 5. Анализ анальпластической олигоастроцитомы 14175XP2 корональных секций на более высокой мощности (40X) в коробочных регионах A-C показывает IDH мутантных человеческих клеток вокруг кровеносных сосудов (регион А), в стриатопаллидальных трактах ("карандашные волокна;" область B) и корпус мозоли (регион C). Как и в случае с GBM 17182XP2, IDH1 R132H окрашивание анапластической олигоастроцитомы 14175XP2 демонстрирует, что мутация IDH поддерживается в первичном ортопедическом ксенотрансплантате после серийных проходов у мышей-реципиентов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 6. Опухолевые клетки человека можно отличить от клеток мыши в диссоциированных ксенотрансплантатах в зависимости от размера. Для количественной оценки опухолевых клеток человека в диссоциированном ксенотрансплантате для последовательного прохождения, человеческие клетки идентифицируются в гемоцитометре под световой микроскопией по их большому размеру и темно-зеленой люминесценции (наконечники стрел). По цитометрии потока, человеческие клетки имеют различные свойства рассеяния из материала мыши и могут быть закрыты для дальнейшего анализа. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Культурные клеточные линии, ксенотранспланты и генетически модифицированные мыши являются наиболее распространенными методами моделирования глиом, и существуют различные преимущества и ограничения для каждоймодели системы 3,13,14. Соответствующие преимущества первичной глиомы ксенотрансплантата включают инфильтративный рост, который символизирует диффузные глиомы и сохранение генетических изменений и важных сигнальных механизмов, которые могут быть чрезвычайно трудно поддерживать в культурных клетках глиомы. Например, isocitrate дегидрогеназы мутаций и Sonic еж лиганд производства может быть сохранена в первичных ортопедических ксенотрансплантатов15,16, но только редко в культурных клетокглиомы 14,17-19. Важно учитывать значительные недостатки первичных ортопедических ксенотрансплантатов, однако, в зависимости от экспериментальных потребностей. Несмотря на доступ к адекватному материалу пациента, гораздо труднее измерить рост глиомы с течением времени в головном мозге, чем в гетеротопном участке. Кроме того, первичные ортопедические ксенотрансплантаты растут значительно медленнее, чем гетеротопные ксенотранспланты. Таким образом, исследователи могут предпочесть пересадить клетки на фланге иммунокомпромиссной мыши, где важные гистологические и молекулярные особенности также могут бытьсохранены 4.
Два важных соображения для создания первичных ортопедических ксенотрансплантатов являются тип иммунокомпромиссной мыши получателя и класс злокачественности глиомы. Мы имели серьезно ограниченный успех создания первичных ксенотрансплантатов в атимических (ню-ну) мышей и в равной степени хороший успех с NOD / SCID иNSG( N OD /S CID/ Interleukin-2 рецептора gамма цепи недостаточно) мышей. NSG мышей являются предпочтительными получателями из-за увеличения скорости причения опухолевых клеток и большей продолжительности жизни по сравнению с NOD / SCIDмышей 20,21. Что касается опухолевого класса ВОЗ, то мы наблюдали глиому, притязаемую опухолями III и IV классов, но не I и II степени.
Для первичной ортопедической глиомы ксенотрансплантатов, диссоциированные опухолевые клетки могут быть пересажены непосредственно вмозг иммунокомпромиссных мышей 9 или опухолевых инициируя клетки могут быть потенциально изолированы (например, выбрав CD133-экспрессивных клеток) длятрансплантации 22. Любой источник клеток подходит для успешного engraftment опухоли внашем опыте 15,16, хотя использование CD133 обогащенных клеток требует больше исходного материала. При подготовке отсортированных или несортированных клеток для трансплантации, важно адекватно удалить миелин и мусор из диссоциированных образцов глиомы. Неспособность адекватно удалить миелин и мусор заметно затрудняет возможность втянуть подвеску в шприц Гамильтона и пересадить равномерное количество клеток в каждого реципиента. После диссоциации папаина, полезно оценить небольшой aliquot с помощью гемоцитометра для того, чтобы определить количество прерывистых градиентных труб, которые будут необходимы для достаточной ликвидации миелина и мусора. Полное удаление не представляется возможным, но можно получить признательность за трудности количественной оценки клеток в диссоциированном образца до удаления миелина и относительной легкости после удаления с разрывными градиентами.
Выход жизнеспособных клеток из разрозненных образцов пациента может быть весьма переменной. Оптимально, 105 клеток пересажены в каждой из пяти мышей-реципиентов, хотя мы получили привантить всего лишь 3000 клеток / животных. Приблизительно половина первичных образцов злокачественной глиомы (КЛАСС ВОЗ III и IV), которые мы пересадили, присасывались у 40-100% мышей-первоначальных реципиентов. После ортопедической трансплантации мышей-реципиентов необходимо еженедельно взвешивать и регулярно контролировать на наличие признаков и симптомов опухолевого прияза и роста. Первичные ортопедические ксенотранспланты демонстрируют диффузный, инфильтративный рост и очаговые неврологические симптомы, такие как гемипарес или судороги наблюдаются только в редких случаях. Наиболее чувствительным признаком опухолевого присвечения является значительная и устойчивая потеря веса, которая может сопровождаться развитием сгорбленной осанки, грубой шерсти волос или куполообразного черепа. Скорость, с которой у мышей развивается устойчивая потеря веса, очень изменчива в зависимости от образца пациента и может варьироваться от 60-350 дней. NSG мышей обычно весят 18-25 г при трансплантации и послеоперационно достичь взрослых весов 28-33 г. Материал постельных принадлежностей следует регулярно менять, так как условия в клетках могут в значительной степени изменять вес животных. Вес животного может колебаться на столько, сколько грамм от одной недели к другой, и определение того, является ли это опухолевые присвещания может быть трудно. Хорошим признаком опухолевого присвещания у мышей NSG, которые достигли веса взрослых, является устойчивая потеря веса более 3 г. Хотя присвеченных мышей, как правило, развиваются постепенная потеря веса, которые могут быть измерены в течение нескольких недель, иногда здоровье животного может быстро снижаться из-за роста опухоли, после развития гидроцефалии, например, или от несвязанных причин, таких как инфекция.
После эвтаназии, опухолевые притязания не может быть легко очевидным путем валового осмотра мозга и гистологическое подтверждение имеет важное значение. Для первоначальных получателей опухоли, мы обработать каждый мозг таким же образом, так что одна часть оценивается гистологически и другие части криоконсервированы для последующего прохождения опухоли, если привитие проверяется. Как уже говорилось выше, мозг помещается в матрицу срез для создания 2 мм корональных ломтиков с каждым ломтиком, представляющих определенную область мозга вдоль передней к задней оси. Коронал ломтик #3, который обычно содержит место инъекции, фиксируется в формалине, и каждый из оставшихся ломтиков помещается в отдельный, помеченный криовиальный, содержащий 1 мл криоконсервации среды. Формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) слайды окрашены гематоксилина и эозина для оценки гистологии и с антителами против Ki67 и человека vimentin для визуализации ферментированных клеток.
После того, как присвечение проверено, опухоль может быть протечена и показатели причения у вторичных реципиентов, как правило, выше на 80-100%. Мы рекомендуем пройти опухоли в первый раз в большем количестве мышей-реципиентов, так что адекватный криоконсервированный материал может быть создан для поддержания данной линии опухоли на низком проходе (2-5) для будущих исследований. Среднее время выживания данной опухоли, как правило, похожи от прохода к проходу, когда одинаковое количество опухолевых клеток пересаживается каждый раз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы особенно обязаны пациентам Медицинского центра Университета Вандербильта, которые предоставили бесценный исследовательский материал для Банка молекулярной нейрохирургической ткани. Мы благодарим тех, кто создал и поддерживает Tissue Bank, Reid C. Thompson MD (главный исследователь), Cherryl Kinnard RN (медсестра-исследователь) и Ларри А. Пирс MS (менеджер). Гистологические услуги были выполнены, в частности, Вандербильтского университета медицинский центр (VUMC) Переводная патология Общий ресурс (при поддержке награды 5P30 CA068485 в Вандербильт-Ингрэм онкологический центр). Эта работа была поддержана грантами MKC от NINDS (1R21NS070139), Фонда Burroughs Wellcome и фондов развития VMC. MKC поддерживается Департаментом по делам ветеранов, Управлением здравоохранения ветеранов, Управлением исследований и разработок, биомедицинскими лабораторными исследованиями и разработками через грант 1 I01 BX000744-01. Содержание не отражают мнения Департамента по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
