Summary
Ondartede gliomer utgjør en heterogen gruppe svært infiltrative glial neoplasmer med distinkte kliniske og molekylære egenskaper. Primære ortotopiske fremmedegrafter rekapitulerer histopatologiske og molekylære egenskaper av ondartede gliomaundertyper i prekliniske dyremodeller.
Abstract
Ondartede gliomer utgjør en heterogen gruppe svært infiltrative glial neoplasmer med distinkte kliniske og molekylære egenskaper. Primære ortotopiske fremmedegrafter rekapitulerer histopatologiske og molekylære egenskaper av ondartede gliomaundertyper i prekliniske dyremodeller. For å modellere WHO grader III og IV ondartede gliomer i transplantasjonsanalyser, blir humane tumorceller xenograftert til et ortotopisk sted, hjernen, av immunkompromitterte mus. I motsetning til sekundære xenografter som bruker dyrkede tumorceller, blir menneskelige gliomaceller dissosiert fra resekterte prøver og transplantert uten forutgående passasje i vevskultur for å generere primære xenografter. Prosedyren i denne rapporten beskriver tumorprøvepreparering, intrakraniell transplantasjon til immunkompromitterte mus, overvåking for tumor engraftment og tumorhøsting for etterfølgende passasje til mottakerdyr eller analyse. Tumorcellepreparat krever 2 timer og kirurgisk prosedyre krever 20 min / dyr.
Introduction
Ondartede gliomer er primære glialtumorer i sentralnervesystemet som forekommer i hjernen og noen ganger ryggmargen. Gliomas er klassifisert av Verdens helseorganisasjon (WHO) i henhold til histologiske likheter med astrocytter, oligodendrocytter eller ependymale celler og deretter numerisk gradert (I til IV) for patologiske egenskaper av malignitet. De vanligste histologiske undertypene er astrocytomer, oligodendrogliomer og blandede oligoastrocytomer. Ondartede gliomer som omfatter WHO-karakterer II til IV er preget av invasiv vekst og tilbakevendende til dagens terapier. Hvert år i USA diagnostiseres ca. 15 750 personer med ondartet gliom og anslagsvis 12 740 pasienter bukker under for denne sykdommen. Denne statistikken fremhever den spesielt dødelige karakteren av ondartede gliomer og viktig behov for forbedret terapeutisk effekt.
Kreftmodeller er avgjørende for å undersøke tumorbiologi og terapier. Cellelinjer for human kreft representerer et viktig første skritt for in vitro manipulasjoner og in vivo xenografting studier (sekundære xenografts)1. Imidlertid gjennomgår standard kreftcellekulturer fenotypisk og genotypisk transformasjon2-4 som kanskje ikke gjenopprettes i sekundære xenografts5. Videre kan genetiske endringer som isocitrate dehydrogenase (IDH) mutasjoner6, distinkte stamcellepopulasjoner7 og avhengighet av viktige signalveier8 gå tapt i kreftcellekulturer. Genomiske profiler kan opprettholdes i bedre grad i kreftsfærekultur, men klarer fortsatt ikke å speile genotypen av primærsvulster2,3. Direkte ortotopisk transplantasjon negerer påvirkningen av in vitrokultur, gir et riktig mikromiljø og bevarer integriteten til tumorinitierende celler9,10. Derfor representerer primære xenografts en kraftig og relevant preklinisk modell for grundig testing av målrettede agenter for å hjelpe til med rasjonell utforming av fremtidige kliniske studier5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av tumorcellefjæring
Merk: Hensiktsmessige institusjonelle godkjenninger for bruk av pasientmateriale og dyr er nødvendig for å etablere og vedlikeholde primære ortotopiske glioma xenografter. Ved Vanderbilt University Medical Center samles resected tumormateriale som er i overkant av det som kreves for diagnostiske formål, med pasientsamtykke for et forskningsvevslager. Prøver er merket med et randomisert 5-sifret REDcap-databasenummer og alle pasientspesifikke identifikatorer fjernes. REDcap-databasen inneholder deidentifiserte kliniske data for hvert eksemplar i vevslageret som inkluderer kjønn, alder (i år), rase, overlevelsesstatus, patologi, kreftbehandlinger, reseksjonsår og tid til progresjon. For å opprettholde sterilitet og optimalisere suksessen til den primære xenograft-metoden, bør alle reagensene, damp-autoklavede kirurgiske instrumenter og operasjonsstedet monteres eller tilberedes på forhånd.
Merk: Glioma prøver inneholder ofte store mengder myelin og rusk. Avhengig av prøvestørrelse kan det være nødvendig å bruke mer enn 4 diskontinuerlige gradientrør for tilstrekkelig fjerning av myelin og rusk.
Merk: Prosessen fullføres når det ikke er noe, eller lite, tydelig synlig udissosiert vev igjen. Unngå innføring av bobler under triturasjonsprosessen.
Merk: Celle levedyktighet etter dissosiasjon er vanligvis >90%. Lavere viaevner kan gjenspeile mange variabler, inkludert suboptimal vevshåndtering eller transporttid fra operasjonsrommet, kryopreserveringsmetode eller papain dissosiasjonsteknikk. Lavere cellulære viaferdigheter kan fortsatt være tilstrekkelig, så lenge et tilstrekkelig antall levedyktige kan transplanteres i riktig volum. For hver mus implanteres 50 000-200 000 levedyktige celler i volum 2 μl. På grunn av den skrå spissen av sprøytenålen, bør ytterligere 5 μl celleoppheng inkluderes i det endelige volumet for å sikre at tilstrekkelig materiale kan trekkes inn i sprøyten for hver injeksjon. For eksempel, for å injisere 2 μl / mus for 5 mus, bør det endelige volumet være 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
- Plasser nyoppratt, deidentifisert pasientmateriale i en steril, avkortet beholder på is for transport til laboratoriet. Behandle prøven direkte for transplantasjon eller kryopreserver prøven i flytende nitrogen (se nedenfor) for lagring i flytende nitrogen og senere bruk.
- Forbered papain dissosiasjonsløsningene (papainoppløsning, vask/ proteasehemmerløsning og diskontinuerlig gradientløsning) i en steril hette med settkomponentene og instruksjonene som leveres av produsenten. Merk sterile 15 ml koniske polystyrenrør og fordel løsningene på følgende måte:
- Rør 1: 5 ml papainoppløsning
- Rør 2: 3 ml vask/proteasehemmeroppløsning
- Rør 3-6: 5 ml hver av diskontinuerlig gradientløsning
- Plasser gliomaprøven i rør 1 med 5 ml papainoppløsning og trianturer med en 5 ml pipette over en 10-20 min tidsperiode.
- Pipette materialet opp og ned 10 ganger og inkuber deretter materialet i 2-3 min ved romtemperatur før du starter neste syklus av triturasjon.
- Plasser spissen av 5 ml pipetten nærmere bunnen av det koniske røret med hver tritursyklus slik at spissen berører bunnen av røret de siste 2 syklusene.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten og pipetten pelletsen opp og ned 10x i 3 ml av vaske-/proteasehemmerløsningen.
- Lag forsiktig et likt volum av suspensjonen over hver av de 5 ml diskontinuerlige gradientløsningene (rør 3-6), med en pipettor satt til "tyngdekraften" dispenserhastighet.
- Plasser rørene i en sentrifuge utstyrt med en svingbøtterotor, med akselerasjonshastigheten redusert til laveste innstilling og bremsen slått av. Sentrifuge ved 76 x g i 12 min ved romtemperatur. Når bremsen er slått av, fullføres sentrifugering vanligvis etter 20 minutter.
- Fjern supernatanten, resuspend og kombiner hver pellets i 5 ml steril balansert saltoppløsning og legg cellene på is.
- Fjern en del (10-100 μl) av celleopphenget og bestem tettheten av levedyktige celler ved trypan blå ekskludering med et hemocytometer.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet med en tetthet på 25.000-125.000 levedyktige celler per μl.
- Overfør et tilstrekkelig volum av cellefjæringen til et 200 μl mikrosenterrør (PCR-rør) og legg på is.
2. Utarbeidelse av kirurgisk sted og instrumenter
Merk: Sterile kirurgiske hansker brukes under prosedyren. Avhengig av kravene til hver institusjon, kan det være nødvendig med kirurgiske kjoler, caps og ansiktsvakter.
- Forbered en desinfisert benkeplate for gnagerkirurgi med separerte tilstøtende områder for dyreforberedelse, operasjonsfelt og dyregjenoppretting.
- Steriliser kirurgiske instrumenter i en damp autoklav. Bruk deretter en varm perlesterilisator for å blinke sterilisere instrumenter når du går over fra ett dyr underlagt det neste.
3. Induksjon, anestesi og analgesi
Merk: Operasjoner over 15 minutter fra musene er bedøvet krever en kontaktvarmekilde. For å forhindre hypotermi er musene utstyrt med en varmekilde (sirkulerende varmtvannsteppe) i for- og postoperative perioder.
- Forbered ketamin/xylazincocktail for induksjonsbedøvelse slik at hver mus får ketamin 100 mg/kg og xylazin 10 mg/kg ved å injisere 10 μl av cocktailen per gram kroppsvekt.
-
Tabell 1. Anestesi cocktail.
Lagerkonsentrasjon Volum det skal forberedes på én mus fem mus ti mus Ketamin 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xylazine 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl Isotonisk saltvann 223 μl 1 113 μl 2 225 μl total 250 ul 1 250 μl 2500 μl - Forbered ketoprofenoppløsning for analgesi ved å fortynne lageroppløsningen (10 mg / ml) 1:20 i sterilt, pyogenfritt vann slik at hver mus får en dose på 5 mg / kg ved å injisere 10 μl av løsningen per gram kroppsvekt.
- Vei og registrer presurgisk vekt. Individuelle musevekter varierer, men varierer vanligvis fra 18-22 g.
- Injiser 10 μl av ketamin/xylazincocktail per gram muse kroppsvekt i det intraperitoneale rommet med en insulinsprøyte. Injiser for eksempel 200 μl for en 20 g mus.
- Bestem om musen er fullstendig bedøvet av tåklemmen på bakbenet. Det tar vanligvis 3-5 min for musen å ikke lenger trekke seg ut av klemmen.
- Injiser 10 μl ketoprofenoppløsning per gram mus kroppsvekt subkutant i den løse huden på flanken med en insulinsprøyte. Injiser for eksempel 200 μl for en 20 g mus.
- Barber håret over skallen med clippers, skrubb den eksponerte hodebunnen med povidon-jod ved hjelp av en bomullsspissapplikator og tørk deretter en alkoholpute. Gjenta disse trinnene, povidon-jodskrubb og alkoholserviett, to ganger til.
- Påfør oftalmisk salve på musens øyne.
- Lag et 1 cm midtlinje snitt som strekker seg fra bak ørene til rett foran øynene med et sterilt skalpellblad.
- Plasser musen under et dissekeringsomfang og eksponer skallen for å identifisere suturlinjene. Bruk sirkulære bevegelser med en borer, sentrer et burrhull 2,5 mm lateral til bregma og 1 mm bakre til koronal suturen.
4. Intrakraniell transplantasjon
Merk: Injeksjonsvolumer over 2,5 μl kan være dødelige for mus.
- Plasser musen på en stereotaktisk ramme ved å hekte de øvre snittene over snittstangen og påføre neseklemmen slik at skallen holdes fast i nøytral stilling.
- Tegn 5-10 μl av cellene i et mikrosenterrør opp og ned flere ganger i en 10 μl Hamilton-sprøyte klemt fast i sondeholderen til stereotaktisk manipulator for å blande suspensjonen og eliminere bobler. Trykk stempelet slik at sprøyten er lastet med 2 μl (tilstrekkelig volum for å injisere ett dyr).
- Trekk den laterale kanten av hudinnsnittet for å eksponere burrhullet, og med mikromanipulatoren introduserer du nålen i burrhullet slik at den skrå delen er like under skalleoverflaten.
- Før nålen 3 mm og trekk deretter kanylen 0,5 mm tilbake for å skape et injeksjonsrom.
- Før stempelet sakte over 30 sek og la nålen forbli i hjernen i ytterligere 2 minutter. Trekk nålen gradvis ved å stige 0,5 mm og vent i ytterligere 30 sekunder før du fjerner nålen fra hjernen.
- Fjern musen fra den stereotaktiske rammen og lukk såret med en autoclip.
- Plasser musen på en oppvarmingspute for å opprettholde kroppstemperaturen og overvåke kontinuerlig åndedrettsmønsteret og fargen på slimhinner og eksponert vev (fotsåler).
- Plasser musen i et sterilt mikroisolatorbur når den gjenoppretter helt fra anestesi (sternal og ambulerende), og returner den til dyrehuset.
5. Etter implantasjon Dyrepleie og observasjon
Merk: Den mest pålitelige indikasjonen på tumor engraftment og infiltrativ vekst er gradvis, vedvarende vekttap ledsaget av utvikling av hunched holdning og grov hårjakke. I sjeldne tilfeller bemerkes nevrologiske underskudd som inkluderer ataksi, parese og anfall. Ortotopiske primære xenografts er svært invasive og utvikler seg over lang tid. Mus manifesterer vanligvis symptomer på tumorvekst 3-6 måneder etter transplantasjon.
- Observer mus med ortotopiske xenografter daglig for mat- og vanninntak, oppførsel, grooming og tegn på infeksjon på snittstedet.
- Administrer ketoprofen (5 mg/kg subkutant, 1-2x daglig) hvis smerte eller nød observeres postoperativt.
- Fjern autoclips 8-10 dager etter operasjonen.
- Vei mus ukentlig.
- Overvåk for tegn og symptomer på tumor engraftment.
6. Tumor høsting
Merk: Ved denne metoden inneholder den første koronalskiven (#1) det bakre aspektet av de olfaktoriske pærene og det fremre aspektet av frontal lobes. Engrafted tumor er mest rikelig i høyre halvkule av de etterfølgende 3 koronalskivene (skive #2, #3 og #4) og injeksjonssiktet er rutinemessig inneholdt i koronalskive #3. Avhengig av eksperimentelle behov, kan materialet brukes til tumorpassasje, frosne vevsseksjoner, formalin faste parafin innebygde vevsseksjoner, strømningscytometri av dissosiert vev, cellekultur eller lysater for DNA, RNA eller proteinanalyse. Deler av svulsten kan bli kryopreservert for fremtidige behov med celle levedyktighet fra 80-95%.
- Avlive mus ved langvarig eksponering for karbondioksid etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Decapitate euthanized mus ved foten av hjernen (foramen magnum nivå) med et større par kirurgisk saks, og trekke huden fra snitt fremover for å fullstendig eksponere skallen.
- Fjern hjernen.
- Sett inn en spiss av fin kirurgisk saks i det laterale aspektet av foramen magnum til nivået av venstre eksterne auditive meatus for å kutte oksipitale bein langs venstre side av skallen. Utfør det samme kuttet på høyre side.
- Klipp occipitalbenet langs et koronalplan fra den ene eksterne auditive meatus til den andre og fjern beinet for å eksponere cerebellum.
- Klipp nesebenplatene mellom øynene.
- Klipp sagittal suturen ved å skjære bakre langs sagittal sutur fra nesebenplatene til bregmaen. Fullfør midtlinjesnittet langs sagittal suturen ved å kutte fremre fra lambda til bregma.
- Sett forsiktig spissen av et fint par tang langs sagittalåpningen på hver side for å rive enhver dural vedheft av skallen til hjernen og skrell deretter de to skallehalvdelene sidelengs for å eksponere hjernen og olfaktoriske pærer dorsalt.
- Skyv tangene mellom det ventrale aspektet av de olfaktoriske pærene og skallen for å frigjøre eventuelle vedheft.
- Vipp skallen tilbake slik at hjernen kan trekkes tilbake slik at de optiske og andre kranialnervene blir utsatt. Kutt kranialnervene for å slippe hjernen inn i en tallerken som inneholder steril PBS.
- Overfør hjernen med en veiespatel til en matriseskive og generer 2 mm koronalskiver med barberblad.
- Ordne koronalskivene i en tallerken som inneholder steril PBS for videre visuell inspeksjon og videre vevsbehandling.
7. Tumor kryopreservering
- Forbered en lagerløsning av kryopreserveringsmedium.
- Tilsett 50 ml proliferasjonstilskudd, 5 ml 100x penicillin og streptomycinoppløsning og 450 μl 0,2% heparin til 450 ml basalt medium.
- Oppbevar lagerløsningen ved 4 °C beskyttet mot lys.
- Forbered en arbeidsløsning av kryopreserveringsmedium.
- Kombiner 47,5 ml kryopreserveringsmedium og 2,5 ml steril DMSO i et 50 ml konisk rør av polypropylen og bland godt.
- Aliquot 1,0 ml arbeidsløsning til hver kryovial og oppbevar ved 4 °C beskyttet mot lys.
- Plasser en 2 mm koronalskive xenografted hjerne i et kryo toårig som inneholder kryopreserveringsmedium på is.
- Hette hetteglasset tett og legg det i en frysebeholder ved -80 °C. Overfør kryonalen neste dag til en flytende nitrogentank for lengre lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissosierte gliomaceller transplanteres direkte inn i hjernen til immunkompromitterte mus for å oppnå primære ortotopiske xenograftlinjer. Hver tumorprøve tildeles et randomisert tall før transplantasjon, som en del av deidentifiseringsprosessen for å fjerne beskyttet helseinformasjon. Vi bruker et 5-sifret REDcap databasenummer til dette formålet. Figur 1 illustrerer prosessen og nomenklaturen for å etablere en xenograftlinje fra et glioblastom (GBM 17182) med isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) mutasjon arginin 132 til histidin (R132H). Etter transplantasjon legges en "X" til tumoridentifikasjonsnummeret for å betegne xenografted svulst, etterfulgt av en "P" for å spore passasjenummeret. P0 betegner den første transplantasjonsmottakeren og P1 betegner mottakermus av den første xenograftpassasjen. Vanligvis blir 3-5 mus i utgangspunktet transplantert for å etablere en linje, og xenografted svulst blir deretter passeret inn i 10 mottakermus (P1) for å utvide linjen for fremtidige studier.
Etter ortotopisk transplantasjon overvåkes mottakermus for tegn og symptomer på tumor engraftment og vekst. Den mest følsomme indikasjonen på tumor engraftment er betydelig og vedvarende vekttap. Ettersom mus transplanteres i ung alder, forventes postoperativ vektøkning. Musevekter kan variere på tilsynelatende dramatisk måte fra uke til uke, men vedvarende tap på mer enn 3 g er generelt en god indikasjon på tumor engraftment. Vanligvis utvikler de fleste musene i en xenograftkohort vekttap over en lignende tidsperiode som spenner fra så kort som 60 dager til så lenge som 350 dager, avhengig av svulsten. Median overlevelsestid for en gitt svulst er generelt lik fra passasje til passasje når samme antall tumorceller transplanteres hver gang. Illustrert i figur 2 er en kohort på 5 mus transplantert med en GBM (17182XP2) som tidligere hadde blitt engrafert og passeret en gang før. Fire av de fem 17182XP2 musene viste betydelig vekttap 17 uker etter transplantasjon. Den gjenværende musen (mus 3) viste ikke vekttap og ingen svulst ble oppdaget ved post-mortem undersøkelse, noe som indikerer tumor engraftment i bare 80% av mottakerne.
Når hjernen til en symptomatisk mus høstes, er en hjerne slicermatrise et ekstremt verdifullt verktøy for vevsbehandling. Genereringen av flere, anatomisk definerte seksjoner fra hver hjerne tillater flere analysemåter med noen porsjoner og kryopreservering av andre deler av vevet. Mutasjonsstatusen til IDH1 kan for eksempel vurderes ved Sanger-sekvensering med materiale fra en del eller immunhiistokjemi med en annen (figur 3). Tumor engraftment kan være lett synlig ved visuell inspeksjon av koronal seksjoner, men histologi med immunhiistokjemi kan være nødvendig for noen xenografts (Figur 4 og 5). Når du dissosierer en xenograft for seriell passasje eller andre studier, er det viktig å starte med en liten og definert del av materialet slik at myelin og rusk kan fjernes tilstrekkelig (Figur 6). Den diskontinuerlige gradienten til Papain Dissociation System er best egnet for behandling av små deler av en voksen musehjerne. Vi anbefaler å kutte hver koronaldel langs midtlinjen og bruke to diskontinuerlige gradienter for hver halvdel.
Figur 1. Primære ortotopiske xenografte linjer etableres ved å transplantere dissosierte gliomaceller direkte inn i hjernen til immunkompromitterte mus og deretter utvides ved seriell transplantasjon. Heterozygote somatiske mutasjoner ved arginin 132 av IDH1-genet forekommer hos mer enn 70% av diffuse astrocytomer, oligodendrogliomer, oligoastrocytomer og sekundære glioblastomer, og mindre enn 7% av primære glioblastomer. GBM 17182 inneholder den vanligste IDH1-mutasjonen, arginin 132 til histidin (R132H). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Vekstkurver for serielle transplantasjonsmottakere av GBM 17182XP1 viser betydelig vekttap 130-150 dager etter operasjonen hos 4 av 5 GBM 17182XP2 mus. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Heterozygot, somatisk IDH1 R132H-mutasjon i pasientsvulsten (GBM 17182) og primær xenograft (17182XP0) kan påvises ved Sanger-sekvensering eller antistofffarging. Immunohistokjemi med et IDH1 R132H-spesifikt antistoff demonstrerer mutante gliomceller tett gruppert rundt blodkar eller i mer diffust infiltrerte områder av pasientprøven og musehjernen. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 4. Primære ortotopiske xenografter viser svært infiltrerende vekst som kan være vanskelig å fullt ut sette pris på av hematoksylin og eosin (H &E) farging alene. Immunhiistokjemi med et menneskespesifikk antistoff er en spesielt nyttig metode for å identifisere engraferte menneskelige celler. Anti-human vimentin farging av en analplastisk oligoastrocytoma xenograft (14175XP2) avslører typiske trekk ved et infiltrerende glioma med en diffus tumormasse i den injiserte høyre halvkule og invasiv vekst langs myelinerte trakter i corpus callosum (stjerner) og striatopallidale fibre (svarte pilspisser) og leptomeningeal formidling (svart pil). Ikke verdsatt ved denne forstørrelsen (1,25X) er klynge av menneskelige tumorceller rundt musenevroner (perineuronal satellitose) i den invaderte cortex. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 5. Analyse av analplastiske oligoastrocytoma 14175XP2 koronar seksjoner ved høyere effekt (40X) i innrammede regioner A-C avslører IDH mutant menneskelige celler rundt blodårene (region A), i striatopallidale trakter ("blyantfibre;" region B) og corpus callosum (region C). Som med GBM 17182XP2 viser IDH1 R132H farging av anaplastisk oligoastrocytoma 14175XP2 at IDH-mutasjon opprettholdes i en primær ortotopisk xenograft etter serielle passasjer i mottakermus. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 6. Humane tumorceller kan skille seg fra museceller i dissosierte xenografter basert på størrelse. For å kvantifisere menneskelige tumorceller i en dissosiert xenograft for seriell passasje, identifiseres menneskelige celler i et hemocytometer under lysmikroskopi av deres store størrelse og mørkegrønne luminescens (pilspisser). Ved strømningscytometri har menneskelige celler distinkte scatter-egenskaper fra musemateriale og kan inngjerdes for videre analyse. Klikk her for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultiverte cellelinjer, xenografter og genmodifiserte mus er de vanligste metodene for modellering av gliomer, og det er klare fordeler og begrensninger for hvert modellsystem3,13,14. Relevante fordeler med primære ortotopiske glioma xenografts inkluderer infiltrativ vekst som typifies diffuse gliomer og oppbevaring av genetiske endringer og viktige signalmekanismer som kan være svært vanskelig å opprettholde i dyrkede gliomaceller. For eksempel kan jegsocitrate dehydrogenase mutasjoner og Sonic pinnsvin ligand produksjon kan opprettholdes i primære ortotopiske xenografter15,16, men bare sjelden i dyrkede glioma celler14,17-19. Det er imidlertid viktig å vurdere betydelige ulemper ved primære ortotopiske fremmedegrafter, avhengig av eksperimentelle behov. Til tross for tilgang til tilstrekkelig pasientmateriale, er det vanskeligere å måle gliomavekst over tid i hjernen enn på et heterotopt sted. I tillegg vokser primære ortotopiske xenografter med en betydelig langsommere hastighet enn heterotopiske xenografter. Dermed kan etterforskere foretrekke å transplantere celler i flanken av en immunkompromittert mus, hvor viktige histologiske og molekylære egenskaper også kan beholdes4.
To viktige hensyn for å etablere primære ortotopiske xenografter er typen immunkompromittert musemottaker og karakteren av glioma malignitet. Vi har hatt sterkt begrenset suksess med å etablere primære xenografts i athymiske (nu-nu) mus og like god suksess med NOD / SCID og NSG (NOD /SCID / Interleukin-2 reseptor gamma kjede mangelfull) mus. NSG-mus er foretrukne mottakere på grunn av økt engraftmenthastighet av tumorogene celler og lengre levetid sammenlignet med NOD / SCID-mus20,21. Når det gjelder WHO tumor karakter, har vi observert glioma engraftment av grad III og IV svulster, men ikke karakterer I og II.
For primære ortotopiske glioma xenografts kan dissosierte tumorceller transplanteres direkte inn i hjernen til immunkompromitterte mus9 eller tumorinitierende celler kan være prospektivt isolert (for eksempel ved å velge CD133-uttrykkende celler) for transplantasjon22. Begge kildene til celler er egnet for vellykket tumor engraftment i vår erfaring15,16, selv om bruk av CD133-berikede celler krever mer startmateriale. Enten du forbereder sorterte eller usorterte celler for transplantasjon, er det viktig å tilstrekkelig fjerne myelin og rusk fra dissosierte gliomaprøver. Unnlatelse av å tilstrekkelig fjerne myelin og rusk hemmer markant evnen til å trekke suspensjonen inn i en Hamilton-sprøyte og transplantere et jevnt antall celler inn i hver mottaker. Etter papain dissosiasjon er det nyttig å evaluere en liten aliquot ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme antall disponeringsrør som kreves for å eliminere myelin og rusk tilstrekkelig. Fullstendig fjerning er ikke mulig, men man kan få en forståelse for vanskeligheten med å kvantifisere celler i en dissosiert prøve før myelinfjerning og den relative lettheten etter fjerning med disponerbare gradienter.
Utbyttet av levedyktige celler fra dissosierte pasientprøver kan være svært variabelt. Optimalt transplanteres 105 celler i hver av fem mottakermus, selv om vi har fått engraftment med så få som 3000 celler/dyr. Omtrent halvparten av de primære ondartede gliomaprøvene (WHO grad III og IV) som vi har transplantert, har engrafert i 40-100% av de første mottakermusene. Etter ortotopisk transplantasjon må mottakermus veies ukentlig og overvåkes regelmessig for tegn og symptomer på tumor engraftment og vekst. Primære ortotopiske fremmedfugler viser diffus, infiltrerende vekst og fokale nevrologiske symptomer som hemiparese eller anfall observeres bare ved sjeldne tilfeller. Den mest følsomme indikasjonen på tumor engraftment er betydelig og vedvarende vekttap som kan ledsages av utvikling av hunched holdning, grov hårjakke eller kuppelformet skalle. Hastigheten som mus utvikler vedvarende vekttap er svært variabel avhengig av pasientprøven og kan variere fra 60-350 dager. NSG-mus veier vanligvis 18-25 g ved transplantasjon og postoperativt oppnår voksne vekter på 28-33 g. Sengetøy bør endres regelmessig, da burforholdene i betydelig grad kan endre dyrevekter. Et dyrs vekter kan variere med så mye som et gram fra en uke til den neste, og det kan være vanskelig å avgjøre om dette representerer tumor engraftment. En god indikasjon på tumor engraftment i NSG mus som har oppnådd voksne vekter er vedvarende vekttap på mer enn 3 g. Selv om engraferte mus vanligvis utvikler gradvis vekttap som kan måles over en flere ukers periode, kan et dyrs helse av og til avta raskt på grunn av tumorvekst, for eksempel etter utviklingen av hydrocephalus, eller fra ikke-relaterte årsaker som infeksjon.
Etter eutanasi kan tumor engraftment ikke være lett synlig ved grov inspeksjon av hjernen og histologisk bekreftelse er viktig. For innledende tumormottakere behandler vi hver hjerne på samme måte slik at en del evalueres histologisk og andre porsjoner blir kryopreservert for etterfølgende tumorpassasje hvis engraftment er verifisert. Som diskutert ovenfor, er hjernen plassert i en matrise slicer for å generere 2 mm koronal skiver med hver skive som representerer en definert region av hjernen langs fremre til bakre akse. Coronal skiver #3, som rutinemessig inneholder injeksjonsstedet, er festet i formalin og hver av de resterende skivene er plassert i et separat, merket kryotype som inneholder 1 ml kryopreserveringsmedium. Formalinfaste parafin innebygde (FFPE) lysbilder er farget med hematoksylin og eosin for å evaluere histologien og med antistoffer mot Ki67 og menneskelig vimentin for å visualisere engraferte celler.
Når engraftment er verifisert, kan svulsten passeres og engraftment rater i sekundære mottakere er vanligvis høyere på 80-100%. Vi anbefaler å passere en svulst første gang i et større antall mottakermus, slik at tilstrekkelig kryopreservert materiale kan genereres for å opprettholde en gitt tumorlinje ved lavpassasje (2-5) for fremtidige studier. Median overlevelsestid for en gitt svulst er generelt lik fra passasje til passasje når samme antall tumorceller transplanteres hver gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi står spesielt i gjeld til pasienter ved Vanderbilt University Medical Center som ga uvurderlig forskningsmateriale til Molecular Neurosurgical Tissue Bank. Vi takker de som etablerte og vedlikeholder Tissue Bank, Reid C. Thompson MD (prosjektleder), Cherryl Kinnard RN (forskningssykepleier) og Larry A. Pierce MS (leder). Histologiske tjenester ble delvis utført av Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (støttet av pris 5P30 CA068485 til Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til MKC fra NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fund og VMC utviklingsfond. MKC støttes av Institutt for veteransaker, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development gjennom tilskudd 1 I01 BX000744-01. Innholdet representerer ikke synspunktene til departementet for veteransaker eller USAs regjering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
