Summary
Kortizol (CORT) insanlarda ve primatlarda artan saç gövdesine birikir. Biz yüksek hassasiyet ve duyarlılığı ile saç Cort çıkarma ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Saç CORT ölçülmesi özellikle aya haftalık dönemler boyunca kronik stres değerlendirmek için çok uygundur.
Abstract
Stres hormonu kortizol (CORT) yavaş yavaş insanlarda, insan olmayan primatlar ve diğer memeliler artan saç gövdesine dahil edilir. Biz, geliştirilmiş ve geçerli al yanaklı maymun saçtan CORT ekstraksiyonu ve analizi için bir yöntem ve daha sonra insan derisi saç ile kullanılmak için bu yöntemi uyarlanmıştır. Plazma veya tükürük elde CORT "nokta örneklerinin" aksine, saç CORT hormon esas döneminde, bir hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) sistem etkinliğinin entegre ölçü ve böylece fizyolojik stres sağlar. Insan saç derisi 1 cm / ay ortalama bir hızda büyür, çünkü, saç kesimleri elde CORT seviyeleri uzunluğu birkaç cm potansiyel ay bir dizi üzerinde yaşanan stres bir biyolojik belirteç olarak hizmet verebilir.
Bizim bir yöntemde, her bir saç örnek ilk ter veya terden de tevdi edilmiştir saç gövdesinin dışından herhangi bir Cort çıkarmak için izopropanol içinde iki kere yıkanmıştır. Kurutma işleminden sonra,örnek kıl protein matrisi parçalamak ve çıkarılması için yüzey alanını arttırmak için ince bir toz halinde öğütülür. Saç gövdesinin iç kısmından CORT metanol içine ekstrakte edildi, metanol buharlaştırıldı, ve ekstre deney tamponu içinde yeniden edilir. Çıkarılan CORT, standartlar ve kalite kontrol ile birlikte, o zaman duyarlı ve spesifik bir ticari olarak temin edilebilen bir enzim immunoassay (EIA) kiti vasıtasıyla analiz edilir. EIA okuma mg toz saç ağırlığı başına pg CORT dönüştürülür. Bu yöntem, insanlarda saç Cort analiz laboratuvarımızda kullanılmakta olan, makak maymunları, marmosets, köpekler, ve kutup ayıları birkaç tür. Laboratuvardan ve diğer araştırma grupları hem de birçok çalışma doğal kronik stres maruziyeti değerlendirmek yanı sıra laboratuar ayarları için saç CORT geniş uygulanabilirliğini göstermiştir.
Introduction
Plazma, tükürük, idrar ya da zaman zaman ya da dışkılar in CORT ölçümü stres 1 HPA ekseninin rolünün Selye keşfi tarihi, fizyolojik stres göstergesi olarak kullanılmıştır. Çok sayıda kağıtları akut stresli durumlarla HPA aktivitesini ilgili yayınlanmış olmasına rağmen, alan kronik fizyolojik stres basit ve güvenilir bir indeks eksikliği engel olmuştur. Bu sorun ortaya çıkar sirkadiyen varyasyon tabidir ve çevresel bozukluklar tarafından eleştirilmiştir olabilir HPA aktivitesinin plazma ve tükürük verim hem de "nokta" tahminleri çünkü. İdrar ve dışkı örnekleri bazı durumlarda tam bir gün kadar sonrası bir dizi yayılma CORT ve / veya metabolit boşaltım ölçümleri elde edildi. Ancak bu yaklaşımların hiçbiri HPA aktivite gerçekten, uzun vadeli bir dizin ve bu sy yanıt sağlar, bu matrisler her zaman CORT seviyeleri kaba bir bileşik dizini sağlayabilir kullanarak birden fazla örneklerinin toplanmasıKronik stres kaynaklanıyor.
Saç Cort Ölçme stres literatürde bu önemli ihtiyacı doldurmak başladı. Birkaç laboratuvarlar tarafından yapılan ilk çalışmalar, insan saç CORT varlığını gösterdi ama saç CORT seviyeleri stres 2 bir fonksiyonu olarak değiştirilmiş olup olmadığını araştırmak değildi. Bizim laboratuvar çeşitli sosyal ve davranışsal faktörler 3 ile al yanaklı maymun HPA ekseninin düzenlenmesinde yıllardır ilgi olmuştur, biz al yanaklı maymun saç 4 çıkarılması ve analizi için yöntemler kurmak ve doğrulamak için yola çıktı. Kan kaynaklı CORT yavaş yavaş ve sürekli olarak artan saç içine dahil edilen öncül göre, bu yeni yöntemin amacı aya haftalık dönemler boyunca HPA aktivitesinin bir göstergesi olarak entegre bir saç türetilmiş CORT seviyelerini kullanmaktı.
Çeşitli metodolojik zorluklar mevcut protokolünü gelişmekte rastlanmıştır. İlk olarak, önceki çalışmalarda bu küçük miktarlar o göstermiştif ter ve sebum atılır Cort dolaşan ve bu nedenle kat saç milinin 2 dışında olabilir. Bu potansiyel şaşırtmak ortadan kaldırmak için, biz büyüyen saç şaft içinde mevcut CORT üzerinde minimal bir etkiye sahip ise dış Cort kaldırmak için görünen hafif bir yıkama prosedürü geliştirmiştir. Bu durumda, bu prosedürün (izopropanol yani iki adet 3-dakikalık yıkama) tâbi maymun saç toplam saç CORT içeriğinin yaklaşık olarak% 7-8 kayıp, ve üçüncü bir yıkama örnek 4 en az% 1 daha fazla steroid kaldırıldı. Aynı prosedür (yayınlanmamış K. Rosenberg ve J. Meyer) örneklerinde% 27, toplam CORT içeriğinin ortalama kaldırıldı yana, insan saçı daha fazla dış CORT var gibi görünüyor. Maymun saç gibi, ancak ek bir yıkama ilk iki yıkamadan çok daha az Cort (yaklaşık% 7) ihtiva etmiştir. Bu nedenle, Maymun ve insan saç hem de sonuçları büyük bir frac muhafaza ederken en (hepsi değilse), dış CORT kaldırılabilir iddiasını destekleyenDahili saç matris içinde CORT of tion. İkinci olarak, pilot çalışmalar da göstermiştir ki, muhtemelen saç gövdesinin kompleks matris proteinli açık kırma hem de çözücü olarak nüfuz etmesi için mevcut olan yüzey alanını arttırarak, numuneden önemli ölçüde artmıştır CORT kurtarma ekstraksiyon için saç önceden öğütme. İki farklı öğütme yöntemleri, avantajları ve dezavantajları ile her geliştirilmiştir. Bir top değirmen kullanarak Yöntem 1, en iyi toz üretme avantajına sahiptir. Ancak, bilyalı değirmen nispeten pahalı bir ekipman öğedir ve standart taşlama kavanoz ve topları ile kullanıldığında, bir defada sadece iki numune öğütme kapasitesine sahiptir. Küçük numuneler aynı zamanda standart öğütme kavanoz bir bilyalı değirmen kullanılarak işlenmesi zordur. Bir beadbeater kullanır Yöntem 2, kendi öğütme yeteneği daha az etkilidir. Sonuç olarak, ortalama iyileşme CORT bilyalı değirmen (yayınlanmamış veriler) ile karşılaştırıldığında, bu metodun kullanımı ile yaklaşık% 10 daha düşüktür. Öte yandan, bir beadbeaterönemli ölçüde daha az pahalı bir bilyalı değirmen daha 16-24 örnekleri bir kez modele bağlı olarak öğütülebilir ve yöntem, küçük örnekler için uygundur. Çünkü yukarıda bahsedilen ayırıcı toparlanma, belirli bir çalışma içinde, bütün numuneler için aynı öğütme yöntemi kullanmak tavsiye edilir.
Saç örneklerinde işlendikten sonra, bu başlangıçta tükürük Cort ölçmek için tasarlanmış bir hassas ve özel ticari EIA kiti vasıtasıyla analiz edilir ekstrelerinde metanol ve CORT ile ekstre edilmiştir. Ekstraksiyon ve tahlil prosedürleri maymun saç örneklerinden özleri seri seyreltileri yakın özgün CORT standartları elde edilen okuma paralel EIA okumaları elde gösteren kısmen doğrulanmıştır. Daha sonra (plazma ve tükürük CORT ek olarak) saç CORT yeni konut çeyrek 4,5 üzere maymunların bir idari zorunlu yer değiştirme büyük yaşam stres duyarlı olduğunu gösterdi. Present kağıt, insan ve maymun saç örnekleri işleyen ve bu numunelerden Cort ayıklamak ve analiz etmek bizim laboratuvarda rutin kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir hesap sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Örnek Toplama ve Saklama
- İnsan saçı
- Bir lastik bant ya da klips ile (çapı bir kalem-genişliği kadar) örneklenecek olan saçın tüm uzunluğu elde edin. Mümkün olduğunca kafa derisine yakın kesilmiş saç temiz bir makasla (değil nick cilt özen). Not: Standart örnekleme alanı kafatası arka tepe noktasıdır.
- Bazı araştırmacılar da bakınız Manenschijn et al. 8 (su ve şampuan 7 tekrar tekrar maruz boşaltılmasında nedeniyle olabilir kafa derisi 6, uzaklaştıkça insan saç CORT seviyelerinde bir düşüş olduğunu bildirdi ve aksine sonuçlar için Thomson et al. 9'daki adres bölümlere göre düşüş bu potansiyel "arınma etkisi" etkisini en aza indirmek için) gözlenmiştir ki, biz 1 cm / ay 10 ortalama artış hızı varsayımıyla 3 cm (daha büyük bir uzunluk ile kafa derisine yakın saç kesimleri toplama öneririz bir 3 cm segmenti C içerirYaklaşık son 3 ay içinde tevdi edilmiştir ORT). Bunu başarmak için, ilk kesim 3 cm boyutlarında ve 3 cm numune elde etmek için tekrar kesmek için bir cetvel kullanın. Not: saç uzunlukta kesilmiş sonra, bu çalışma öncesi numune için bir zaman periyodu boyunca CORT birikmesinin retrospektif takvim kurmak için ayrı bir 1 cm uzunluğunda bölümler halinde örnek kesmek içerir sürece hizada şeritleri tutmak için artık gerekli değildir 6.
- Alüminyum folyo, temiz bir kağıt zarf, ya da örnek yıkama için kullanılan tipte bir 15 mL vida kapaklı santrifüj tüpü polipropilen yapılmış bir kese içinde saç numunesi yerleştirin. CORT saç 2 son derece stabil olduğu, gerekirse, numuneler, oda sıcaklığında bir gece boyunca sevk, -20 ° C'de saklanır ve süresiz edilebilir.
- Saç toplama prosedürü gönüllüler üzerinde uygulanmalıdır ve uygulama örnekleri tam çalışmaya başlamadan önce tartılır olmalıdır. Not: SMA gibi saç örnekleriBu düşük CORT altında standart EIA okumaları elde etme olasılığını en aza indirmek için numune> 10 mg toplamak için tercih edilir, ancak ll 5-10 mg gibi, burada tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilebilir.
- Maymun saç
- Standart bir hayvan kesme makinesi kullanılarak ense saç (100-250 mg) tıraş. , Mümkün olduğunca cilde yakın tıraş cilt değil nick için dikkatli olmak ve kan CORT düzeyleri saç bulunanlara kıyasla son derece yüksek, çünkü kanama neden olur. Not: genellikle saç için iyi bir kaynaktır ve kolayca öncesinde yeniden örnekleme için saç çıkma görülebilir, çünkü boyun bölgesi rutin numune için seçildi.
- Alüminyum folyo ya da bir 15 mL vida kapaklı santrifüj tüpü polipropilen yapılmış bir kese içinde saç numunesi yerleştirin. Maymun saç örneklerinde depolanır ve insan saç örnekleri için yukarıda tarif edildiği gibi aynı şekilde sevk edilmelidir.
- Maymun saç, insan saçlarınızdan aksine, st sonra belli bir uzunluğa kadar büyür ve çünkü11 büyüyen ops, bu CORT tevdi edilmesi için bir takvim olarak deriden mesafeyi kullanmak için bu durumda genel olarak mümkün değildir. Bir hayvan daha (periyodik rutin sağlık muayeneleri sırasında, örneğin) bir kez daha örnek olabilir, ancak bu bir başlangıç zaman noktası ayarlayın ve daha sonra istenilen süre geçtikten sonra aynı alanı reshave bir ilk tıraş yapmak için arzu edilir. Ikinci numunede CORT bu aralıkta 5 üzerinden HPA etkinliğe numune CORT içeriğinin kesin bir atıfta izin tıraş-reshave aralık sırasında biriktirilmiştir.
2. Numune Yıkama ve Kurutma
- Yıkama
- Bir 15 ml vida kapaklı polipropilen santrifüj tüpü içine her bir saç numunesi yerleştirin.
- Bir rotator ile 3 dakika boyunca tekrar ters ardından her tüpe, yüksek performanslı sıvı kromatografisiyle (HPLC) dereceli izopropanol içinde 5 ml.
- C alarak, bir atık kabı içine izopropanolü Durusunumunenin herhangi kaybetmek değildir.
- Tekrar 2.1.2 ve 2.1.3 bir kez daha adım.
- Kurutma
- Tam izopropanol buharlaşmayı sağlamak için en az 2-3 gün boyunca saçınızı kurutun.
3. Numune Taşlama ve CORT Ekstraksiyon - Geniş Örnek için Yöntem 1
- Örnek taşlama
- Paslanmaz çelik tek bir 12 mm paslanmaz çelik öğütme top ile birlikte bir öğütme kabı 10 ml kuru saç 250 mg'a kadar yerleştirin.
- Bir bilyalı değirmen kullanılarak 25 Hz 'lık bir hızda 6 dakika için örnek öğütün.
- Bir analitik terazi üzerinde toz halinde saç 50 mg kadar tartılır ve daha sonra, sonraki CORT ekstre için temiz bir 2.0 ml polipropilen mikrosantrifüj tüpüne transfer.
- CORT çıkarma
- Toz örneği içeren mikrosantrifüj tüpüne HPLC-grade metanol 1.0 ml ilave edilir.
- Tüp kap ve işbirliği ile, oda sıcaklığında 18-24 saat boyunca inkübe örnekBir Picture kullanarak nstant inversiyon.
- Toz halindeki saç pellet haline getirmek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 14,000 rpm'de santrifüje tüpler.
- Toz saç pelet bozmamaya özen, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatan 0.6 ml aktarın.
4. Numune Taşlama ve CORT Ekstraksiyon - Küçük Örneklerden için Yöntem 2
- Örnek taşlama
- Boncuk dayak için güçlendirilmiş bir önceden tartılmış 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine saç 60 mg kadar yerleştirin.
- Numune ağırlığı elde etmek için şişeyi yeniden tartın.
- Her bir şişeye, 3.2 mm üç krom çelik boncuk ekleyin ve daha sonra bir boncuk mikser içinde en az 2 dakika için örnek öğütülür. Görsel muayene numune yetersiz pulverize olduğunu ortaya koyarsa, o zaman 0.5 veya 1 dakika ilave taşlama gerçekleştirin. Not: CORT ekstre öğütme ile aynı şişe içinde gerçekleştirilir çünkü zemin saç Resim aktarımı bu durumda gereklidir.
- CORT çıkarma
- Toz örneği içeren mikrosantrifüj tüpüne HPLC-grade metanol 1,5 ml ilave edilir.
- Tüp kapak ve bir rotator kullanılarak sabit ters çevirme ile oda sıcaklığında 18-24 saat için örnek inkübe edin.
- Toz halindeki saç pellet haline getirmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 rpm'de santrifüje tüpler. Not: krom çelik boncuklar yöntem 1 ile karşılaştırıldığında, daha düşük hızda santrifüj hesapları olan, ekstraksiyon ve santrifüj aşamaları esnasında saç ile tüp içinde kalır.
- Toz saç pelet bozmamaya özen, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatan 1.0 ml aktarın.
5. Çözücü Buharlaştırma ve Örnek Sulandırma
- Bir vakumlu buharlaştırıcı mevcut değilse, bir vakumlu bir buhar ya da azot gazı akışı kullanılarak metanol aşağı kurutun. Bir vakum evaporatör kullanılırsa, metanol buharı ile yakalanan edilebilirSoğuk tuzak veya bir aktifleştirilmiş odun kömürü kartuşu ile donatılmış bir kimyasal tuzağı.
- Metanolun çıkarılmasından sonra, EIA deney tamponu (analiz seyreltici) uygun bir hacimde CORT özü sulandırın. Nispeten yüksek CORT değerleri beklenen ise, 0.4 ml veya daha büyük bir tampon hacmi kullanın. Nispeten düşük değerleri beklenen ise, o zaman birim duyarlılığı artırmak için 0.2 ml veya daha az azaltılabilir. Not: 0.2 ml örnek bir tekrar işleme gerekli olduğu durumda, en az iki kez, numune suret çözeltilerinin çalıştırmak için yeterli bir birimdir.
- Hemen yeniden numune tahlil veya sonraki analiz için -20 ° C'de dondur ya. Not: yeniden örnek dondurulmuşsa, bu numune hacminde bir değişiklik yana donma süresi boyunca süblimasyon önlemek için önemli olan son hesaplamalar yapılır yanlış CORT değere yol açacaktır.
6. CORT Deneyi ve Veri Dönüştürme
- Için saç özleri tahlilCORT yüksek hassasiyetli bir enzim immunoassay (EIA) kiti kullanılarak. Not: Test numuneleri yinelenen her yeniden saç ekstresinin alikoları yerine tükürük örnekleri olacak dışında kit prospektüsünde belirtilen CORT ÇED kit ticari tükürük kullanıyorsanız, üreticinin tavsiyelerini uygulayın.
- Her deneyde kullanılmak üzere bir kalite kontrol (QC) saç özü hazırlayın.
- Ekstra saç örnekleri bir dizi toplamak ve ya adımlar 4.1 ve 4.2 veya 3.1 ve 3.2 adımları olarak büyük numune işleme için onları havuzu olarak tek tek onları süreci.
- Çözücüyü buharlaştınn ve adımları 5.1 ve 5.2 'de olduğu gibi özleri tekrar oluşturmak, sonra da birkaç ayrı veya toplanmış numuneleri arasındaki yeniden özler havuz.
- Bireysel mikrosantrifüj tüpleri içine toplanmış yeniden özü (örneğin 0.10 ml), uygun bir eş-payı ve hacmi daha sonra kullanmak için dondurma.
- Çözülme ve refe sağlamak için her immünotahlil mikrolevhadaki nüsha bir QC alikosunu çalıştırınher çalışma kalitesini kontrol etmek için CORT değer RENCE.
- Varyasyon (CV, örnek değerler bir dizi ortalaması ile bölünen standart sapma olarak tanımlanır) bir intra-tahlil katsayısı arası bir deney CV hesaplanabilir oysa, aynı vadede 10-12 QC kuyu analiz hesaplanabilir çalışan bir grup genelinde QC değerleri kullanarak. Kişinin mikroplate okuyucu yazılım her saç özü temsil yinelenen kuyuları için bir CV hesaplar, sonra intra-tahlil CV belirlenmesi için alternatif bir yöntem bütün plaka üzerinde bu bireysel CV değerlerin ortalamasını hesaplamak için.
- Herhangi bir örnek özü EIA en yüksek CORT standarda göre daha büyük bir okuma elde edilir, daha sonra özütü bir alikotu analiz tamponu içinde uygun bir miktarı ile seyreltilir ve daha sonra EIA okuma seyreltme faktörü için düzeltilir. Yinelenen kuyuları için CV>% 10 ise numuneler de rutin olarak tekrar analiz edilir.
- CORT ÇED kitleri CORT va ölçmek için tasarlanmıştır çünkülues tükürük veya plazma gibi sıvı örnekleri, mikroplaka okuyucu yazılım çıkış toz saç, birim ağırlık başına CORT miktarına dönüştürülmelidir. Aşağıdaki formül mg saç başına pg CORT ug / dl tahlil çıktı dönüştürür:
(A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
burada tahlil çıkışından A = ug / dl, ekstraksiyon işlemine tabi saç B = ağırlık (mg olarak) C = vol. Metanol (ml) toz halindeki saç eklenmiştir; D = vol. Ekstreden geri kazanılmış ve daha sonra aşağı kurutuldu metanol (ml) E = vol. Kurutulmuş özü tekrar oluşturmak için kullanılan deney tamponu (ml) ve pg / mg saç CORT konsantrasyonunun F = son değer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 yöntemi 2 öğütme ve çıkarma kullanarak işlenen insan saç örnekleri (yetişkin erkek ve dişi insan denekler) bir temsilci kümesinden çıkışını gösterir. Bilgisayar yazılımı, veri çıkışı üretmek için ve CORT standartlara 4 parametreli sigmoidal bir eğri (Şekil 2) uygun olarak kullanıldı. Bu plakadan arası kuyunun özgeçmişleri 0.01-5.73 'den% 1.34 ortalama% intra-tahlil CV ile değişiyordu. Deney-içi CV% 4.41 son dokuz insan saçı tahlillerinden QC değerleri ile tespit edilmiştir. (; Ortalama ± SD = 36.0 ± 110 pg / mg ortanca = 10.2 pg / mg), bu plaka üzerinde analiz 37 numuneler 3.1-650 pg / mg saç CORT değerleri bir dizi vermiştir.
Yöntem 1 maymunları ve diğer büyük hayvanların saç örnekleri işlemek için laboratuvarda kullanılmaktadır. (Çoğunlukla kadın itibaren) erişkin al yanaklı maymun saç temsilcisi tahlil 50.1-102 pg / mg CORT bir dizi değerleri (medyan = 75.0 vermiştir; ortalama ± SD= 75.8 ± 14.0 pg / mg). Bu deney için ortalama intra-tahlil CV% 2.08 idi ve tahlil-arası CV% 4.63 son dokuz maymun saç tahlillerinden QC değerleri ile tespit edilmiştir.
Şekil 1. Temsili bir insan saçı CORT deneyi için yazılım çıkışı. Aşağıdaki gibi yinelenen kuyu şunlardır: S1-S6 - 0.012 ug / dl (S6) 3,0 ug / dl (S1) arasında değişen CORT standartlar, anti-Cort eksikliği spesifik olmayan bağlanma (NSB) kuyu -, - B1 S7 0 CORT kuyu antikor (yazılım otomatik olarak diğer tüm OD okumalarından ortalama NSB optik yoğunluğunu [OD] değeri çıkarır), C1 ve C2 - üretici tarafından sağlanan yüksek ve düşük CORT kalibratörlerimiz; T1 - QC;
T2-T38 - test örnekleri. C1 T38 için, dizinin her hücrenin üst değeri ölçülen OD değerd de karşılık gelen, ve çiftin sol hücreye alt değer ortalama OD değeri hesaplandı ug / dl 'de CORT değerdir e. Örnekleri T9 ve T31 yüksek CORT standardın üzerinde okumalar vermiştir unutmayın. Bunun bir sonucu olarak, her iki numune, daha sonra deney, bir seyreltici içinde 4 kat seyreltildi ve tekrar analiz edilmiştir. Reanalyzed değerler seyreltme faktörü düzeltme sonrasında kullanılmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Aynı tahlilde insan saçı için günlük CORT konsantrasyonuna karşı OD değerlerinin standart eğrisi. Panel A'da gösterilen R-kare değeri standartlara eğrinin uyum hesaplanan iyilik./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif edilmiş olan saç CORT prosedürü gerçekleştirmek için basit, nispeten ucuz olan, kolaylıkla temin kimyasallar, reaktifler ve malzemeleri kullanır ve bir istisna ile, tipik bir analitik laboratuar içinde mevcut olması muhtemel olduğundan, ekipman gerektirir. Özel bir bilyeli değirmen ya da mini beadbeater olarak bir öğütme aletidir. Bazı araştırma grupları küçük parçalara uzunluğunda 12 kabaca 1 mm içine saç örneklerini sakınmadan unutmayın, ama biz taşlama performans yerine mümkünse kıyma tavsiye bizim gözlemlere dayanır. Literatürde metodolojik bir varyasyon önce alanların CORT ekstraksiyon 13 saç yıkamak için, ve eğer öyleyse, ne yıkama koşulları kullanmak isteyip istemediğinizi içerir. Yıkama gerçekleştirilmezse, daha sonra bir metanol özü hafta veya saç büyüme ay boyunca yavaş yavaş ilave Cort değil, aynı zamanda son biriken ter ve / veya sebum türetilmiş Cort sadece içeren olasılığını risklerisaçın yüzeyi. Muhtemelen, esas yüzey kirliliğini temsil bozulmamış saçlar kısa izopropanol yıkama ve geniş metanol ekstraksiyonu ile erişilebilen bir daha sıkıca bağlı fraksiyonu tarafından çıkarılabilir bir gevşek-bağlı fraksiyon: kutup ayısı örnekleri üzerinde çalışmalar saç iki CORT fraksiyonların varlığını desteklemek toz saç örnekleri 14. Aynı sonuç tekrarlanan izopropanol yıkama (bkz) tarafından maymun ve insan saç çıkarılan CORT azalan miktarlarda çizilebilir. Yıkama gerçekleştirilir, Öte yandan, daha sonra çözücü seçimi ve yıkama koşulları elde edilen CORT değerleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Saç Test Derneği saç yıkama işlemi sırasında 15 saç matrisinin iç şişmeyi ve potansiyel çözünen elüsyon en aza indirmek için uygun bir çözücünün seçilmesi için kuralları yayınladı. Bu öneriler, saç uyuşturucu testi uygulanması için geliştirilmiştir rağmen, onlar yeniden vardırSteroid analizi için Levant de.
Saç Cort Ölçme ziyade plazma veya tükürük avantajları 2 sunmaktadır. En önemlisi, bu yaklaşım örnekleri toplanır günün zaman önce veya toplama strese maruz etkilenmemis aylara hafta süreleri, üzerinde entegre CORT seviyelerinin bir biyogöstergesini sağlar. Bu tür al yanaklı maymun ya da ayılar gibi bazı hayvan türlerinin örnekleme güvenlik nedenleriyle konu anesthetization isteyebilir ancak saç toplama, nonivazivdir. Diğer bir avantajı CORT, zaman uzun bir süre boyunca ortam sıcaklığında muhafaza edilmiştir bile tarihi veya arşiv örneklerin analiz edilmesini sağlar, diğer numune matrisleri ile karşılaştırıldığında saç son derece kararlı olmasıdır. Son olarak, kafa derisi ardına büyük uzaklıklarda kesilmiş insan saç kesimleri CORT seviyeleri bazen zamanla HPA etkinliğinin retrospektif bir takvim oluşturmak için kullanılır olmuştur. Bu gibi durumlarda özel birtekrarlanan saç yıkama tarafından üretilen daha önce bahsedilen "arınma" etkisi farkında olmak ly önemlidir. Bazı çalışmalar bu etkiyi 8,9 çoğaltmak için başarısız olmasına rağmen, bu çalışmalarda Numuneler metanol ekstraksiyonu değil yıkanmış fazlalaştı. Bu önemli metodolojik fark, saç CORT seviyeleri derisi mesafe ile düşüş niye açıklamaya yardımcı olabilir.
Saç CORT yöntemin bazı sınırlamaları da belirtilmesi gerekir. İlk olarak, bu yaklaşım HPA faaliyetin sirkadiyen ritim değişiklikleri (bazı depresif hastalarda görüldüğü gibi) veya uyanış CORT yanıtını tespit edemez. Saç CORT düzeyleri de hormon esas döneminde meydana gelen, nispeten kısa bir stres etkisini tespit olmayabilir. Dolayısıyla, bu yaklaşım, böyle ölçümler için bir yedek olarak, tükürük ve / veya plazma CORT ölçümleri için tamamlayıcı düşünülebilir gerekir. İkincisi, oysa saç CORT kullanımı olacakolası psikososyal ve çevresel stres ilgilenen araştırmacılara özel bir değer, bu HPA aktivite, fiziksel egzersiz, metabolik anormallikler ve bulaşıcı hastalık gibi koşullar, çeşitli altında oluşabilir yükselmiş akılda tutmak önemlidir. Veriler, insanlarda ve saç CORT kan 2 çoğunlukla türetilmiş olduğu hipotezini destekleyen maymunlar hem mevcut ise Üçüncü olarak, bu hipotez henüz kanıtlanmamıştır. Nitekim, Ito ve arkadaşları 16 organ kültüründe muhafaza microdissected insan saç foliküllerinin bir fonksiyonel HPA-benzeri sistemin varlığını göstermiştir. Saç köklerinin saç gövdesine ölçülen CORT katkıda derecesi şu anda bilinmemektedir.
HPA eksen aktivitesi yeni bir biyolojik belirteç olarak kurulduğu günden bu yana sadece bir kaç yıl içinde, saç CORT çok sayıda türün genelinde uygulamaların geniş bir yelpazede kullanılmaktadır. Bu uygulamaların çoğu birkaç büyük t girenUzun süreli HPA aktivite kronik stres, Cushing hastalığı gibi endokrin bozukluklar, ya da post-travmatik stres bozukluğu 2,17-19 gibi nöropsikiyatrik bozukluklar ile ilgili nasıl yapılacağına yönelik Hemes. Diğer çalışmalar davranışsal mizaç, normal gelişme, bu tür insanlarda erken çocukluk deneyimleri ya da maymunlarda farklı yetiştirme koşulları, yabani yaşayan hayvanların çevre korunması gibi gelişimsel faktörlerin etkisi, ve geriye dönük soruşturmaya ilişkin HPA eksen işlevini incelemek için saç Cort kullanmış tarihsel veya arşiv örnekleri. Saç CORT ile ilgili bugüne kadar okudu türler insanları, insan olmayan primatlarda (olmasmm vervet maymunları ve babunların) çeşitli türleri, köpek, kedi, sığır, atlar, ayılar ve çeşitli türler bulunmaktadır. Bu, kronik stres için fizyolojik yanıtı araştırmak için veya diğer deneysel soruları için olsun, uzun süreli HPA aktivitesini değerlendirmek için saç CORT kullanılmasıdır eski devam olasıdırgenişletecektir ve türlerin daha büyük bir aralığına uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar beyan Çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz bu çalışmada analiz insan saç örneklerini sağlamak için Kymberlee O'Brien, Celia Moore ve Edward Tronick (Psikoloji Bölümü, Massachusetts, Boston Üniversitesi) teşekkür ederim, ve Stephen Suomi ve Amanda Dettmer (Karşılaştırmalı litoloji, NICHD Laboratuvarı) için al yanaklı maymun saç örnekleri sağlar. Ilk gelişim ve bu yöntemin devam etmeniz MAN NIH RR11122 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
