Summary
코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.
Abstract
스트레스 호르몬 코르티솔 (CORT)은 서서히 인간, 비인간 영장류, 그리고 다른 포유 동물의 성장 머리 샤프트에 통합됩니다. 우리는 개발과 검증 된 붉은 털 원숭이의 머리에서 CORT 추출 및 분석하는 방법을 연속적으로 인간의 두피 모발에 사용하기 위해이 방법을 적용. 플라즈마 또는 침에서 얻은 CORT "포인트 샘플"대조적으로, 머리 CORT 호르몬 결합의 기간 동안, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부 신피질 (HPA) 시스템 활동의 통합 측정, 따라서 생리적 인 스트레스를 제공합니다. 사람의 두피에 머리가 1cm / 월의 평균 속도로 성장하고 있기 때문에, 머리 부분에서 얻은 CORT 수준의 길이는 몇 cm 잠재적 개월 수에 대한 경험이 스트레스의 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다.
우리의 방법에서, 각 모발 샘플은 제 땀과 피지에서 증착 된 머리 샤프트의 외부로부터 어떠한 CORT 제거 이소프로판올에 두 번 세척한다. 건조 후,샘플은 모발 단백질의 행렬을 분해 및 추출을위한 표면적을 증가시키는 미세 분말로 분쇄된다. 모간의 내부로부터 CORT 메탄올로 추출하고, 메탄올을 증류 제거하고, 추출액을 분석 완충액에서 재구성된다. 추출 CORT, 표준 및 품질 관리와 함께, 다음 민감하고 특정 시판 효소 면역 측정법 (EIA) 도구에 의해 분석된다. EIA의 판독은 MG 분말 머리 무게 당 PG의 CORT으로 변환됩니다. 이 방법은 인간의 머리 CORT을 분석하기 위해 실험실에서 사용 된, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이, 개, 그리고 북극곰의 몇몇 종. 우리가 실험실에서와 다른 연구 그룹 모두에서 많은 연구가 자연에 만성 스트레스에 노출을 평가뿐만 아니라 실험실 설정에 대한 머리 CORT의 광범위한 적용 가능성을 증명하고있다.
Introduction
혈장, 타액, 또는 때때로 소변이나 대변의 CORT 측정 스트레스 1 HPA 축의 역할 Selye 디스커버리시기 생리적 스트레스의 지표로서 사용되었다. 수많은 논문이 급성 스트레스 상황에 HPA 활동과 관련된 발행되었지만, 필드는 만성 생리적 스트레스 간단하고 신뢰성 지수의 부족에 의해 방해되었다. 이 문제가 발생주기 차이가있을 수있는 환경 교란에 의해 혼동 될 수 HPA 활동의 플라즈마 침 수율 모두 "포인트"예상하기 때문이다. 오줌과 배설물 샘플 어떤 경우에는 하루 종일까지 시간의 숫자에 걸쳐 CORT 및 / 또는 대사 산물의 배설의 측정 값을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 HPA 활성의 진정한 장기 인덱스 및이 싸이의 응답 성을 제공하지 않는다; 이러한 행렬들의 임의 시간 경과 CORT 레벨의 거친 지수를 제공 할 수있다하여 여러 샘플의 컬렉션만성 스트레스에 줄기.
머리에 CORT를 측정하는 것은 스트레스 문학이 중요한 필요를 채우기 위해 시작했다. 여러 실험실에 의한 초기 연구는 인간의 머리에 CORT의 존재를 증명하지만, 머리 CORT 수준이 스트레스 2의 함수로 변경 여부를 조사하지 않았다. 우리 연구실은 다양한 사회 및 행동 요인 (3)에 의해 붉은 털 원숭이 HPA 축 조절에 몇 년 동안 관심이있다, 우리는 붉은 털 원숭이 머리 4의 추출 및 분석을위한 방법을 설정하고 확인하기 위해 밖으로 설정합니다. 혈액 유래 CORT 천천히 연속적으로 성장하는 모발에 혼입되는 것을 전제로,이 새로운 방법의 목적은 개월 주내 걸쳐서 HPA 활성의 통합 지표로서 헤어 유래 CORT 수준을 사용하는 것이었다.
몇 가지 방법 론적 문제는 본 프로토콜 개발에 발견되었습니다. 첫째, 이전의 연구는 적은 양의 O를 표시했다F 땀과 피지에 배설 CORT을 순환하기 때문에 코트 머리 축 (2)의 외부를 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 혼동을 제거하기 위해, 우리는 성장 모간 내에 존재 CORT에 최소한의 효과를 가지면서 외부 CORT 제거 나타나는 온화한 세척 과정을 개발 하였다. 따라서,이 절차 (이소프로판올, 즉 두 개의 3 분 세척) 실시 원숭이 머리 전체 머리 CORT 내용의 약 ~ 8 %를 손실 및 제 3 세척 샘플 4에서 1 % 미만의 더 많은 스테로이드를 제거했습니다. 같은 절차 (게시되지 않은 K. 로젠버그와 J. 마이어) 샘플에서 27 % 총 CORT 콘텐츠의 평균을 제거하기 때문에, 사람의 모발에 더 많은 외부 CORT이있을 나타납니다. 원숭이 머리를 좋아하지만, 추가 세척은 처음 두 세척보다 훨씬 적은 CORT (약 7 %)가 포함되어 있습니다. 따라서, 원숭이 및 사람의 모발 양의 결과가 주요 골절을 유지하면서, 대부분 (전부는 아니더라도) 외부 CORT가 제거 될 수 있다는 논쟁을 지원내부 헤어 매트릭스 내에서 CORT의 기. 둘째, 우리의 파일럿 연구는 또한 보여 주었다 아마도 모간의 복합 단백질 성 매트릭스를 오픈 침입뿐만 아니라 용매의 침투 가능한 표면 면적을 증가시킴으로써, 샘플에서 유의하게 증가 CORT 회수를 추출하여 모발 전에 연삭. 두 개의 서로 다른 연삭 방법은 장점과 단점을 각각 개발되었다. 볼 밀을 사용하여 방법 1, 각종 분말을 제조하는 장점을 갖는다. 그러나, 볼 밀은 비교적 고가의 장비 아이템이며 표준 연삭 항아리와 볼을 사용하는 경우, 한 번에 두 개의 시료를 분쇄 할 수있다. 작은 샘플도 표준 연삭 항아리와 볼 밀을 사용하여 처리하기가 어렵습니다. beadbeater을 사용하는 방법 2, 그것의 분쇄 능력에 덜 효과적이다. 결과적으로, 보통 CORT 복구는 볼밀 (미공개 데이터)와 비교하여이 방법을 사용하여 약 10 % 낮다. 한편, beadbeater상당히 저렴 볼밀보다, 16-24 번 샘플은 모델에 따라에서 접지 될 수 있고, 상기 방법은 작은 샘플에 매우 적합하다. 때문에 상기 차동 회복, 그것은 특정 연구 내 모든 샘플에 대해 동일한 연삭 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
모발 샘플을 처리 한 후, 그들은 원래 타액 CORT을 측정하기위한 민감하고 특정 상용 EIA 키트에 의해 분석된다 추출한 메탄올 CORT로 추출된다. 추출 및 분석 절차는 원숭이의 머리 샘플에서 추출의 시리얼 희석 밀접 본격적인 CORT 표준에서 얻은 측정 값을 병렬 EIA 수치를 산출 시연에 의해 부분적으로 확인되었다. 우리는 그 (플라즈마 및 타액 CORT) 외에도 헤어 CORT 새로운 주택 분기 4,5 원숭이의 관리 상 의무 재배치의 주요 생활 스트레스에 민감한 것으로 나타났다. 프리젠T 종이는 인간과 원숭이의 머리 샘플을 처리하고 이러한 샘플에서 CORT를 추출하고 분석하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 방법에 대한 자세한 계정을 제공합니다.
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Protocol
1. 시료 채취 및 보관
- 사람의 모발
- 고무 밴드 나 클립 (직경 연필 폭까지) 샘플링 할 수있는 머리의 전체 길이를 고정합니다. 최대한 두피에 가깝게 잘라 머리 깨끗한 가위 (닉은 피부를 돌보는). 주 : 표준 샘플링 에리어가 두개골의 후방 정점이다.
- 일부 연구자들은 비록 볼 Manenschijn 등. 8 (물과 샴푸 7 반복 노출에서 유실로 인해 수 있습니다 두피 6에서 거리를 가진 사람의 모발의 CORT 수준의 감소를보고 반하는 결과를 톰슨 등. 9있다 더 분절 하락이 잠재적 인 "유실 효과"의 영향을 최소화하기 위해) 관찰 된, 우리는 1cm / 월 (10)의 평균 성장률을 가정 3cm (,보다 더 큰 길이 두피에 인접 머리 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다 3cm 세그먼트는 C를 포함약 지난 3 개월 동안 퇴적 된 ORT). 이 작업을 수행하려면 첫 번째 컷에서 3cm를 측정하고 3cm 샘플을 얻을 다시 잘라 통치자를 사용합니다. 참고 : 머리 길이로 절단되면,이 연구는 이전의 샘플링 기간 동안 CORT 증착의 회고 일정을 설정하는 별도의 1cm 긴 세그먼트로 샘플을 절단 포함하지 않는 정렬 가닥을 유지하기 위해 더 이상 필요 6.
- 알루미늄 호일, 깨끗한 종이 봉투, 또는 샘플 세척에 사용되는 유형의 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. CORT 모발이 매우 안정되어 필요한 경우, 시료는 주위 온도에서 밤새 발송, -20 ° C에서 무기한으로 저장 될 수있다.
- 머리 수집 절차는 자원 봉사자에 연습을해야하고 연습 샘플은 전체 연구에 착수하기 전에 고려되어야한다. 참고 : SMA로 머리 샘플을그것은 낮은 CORT 표준 이하 EIA 판독을 얻는 가능성을 최소화하기 위해 샘플을> 10 ㎎을 수집하는 것이 바람직하지만 LL 5-10 MG로서, 여기에 기술 된 방법을 사용하여 분석 할 수있다.
- 원숭이 머리
- 표준 동물 클리퍼를 사용하여 목의 목덜미에서 머리 (100 ~ 250 mg)을 면도. 가능한 한 피부에 가까운 면도 피부가 닉에주의하면서 혈액 CORT 수준이 머리에있는 사람에 비해 매우 높기 때문에 출혈의 원인이됩니다. 참고 : 일반적으로 머리의 좋은 소스와 쉽게 이전 리샘플링에 머리 재성장을 관찰 할 수 있기 때문에 목 부분이 일상적인 샘플링을 위해 선택되었다.
- 알루미늄 호일 또는 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. 원숭이 머리 샘플을 저장하고 사람의 모발 샘플에 대해 전술 한 바와 같이 동일한 방식으로 발송한다.
- 원숭이 머리, 사람의 두피 모발과는 달리, 세인트 다음 특정 길이로 성장하고 있기 때문에(11)을 성장 본부, 그것은 CORT 증착 달력으로 피부로부터의 거리를 사용하는 것,이 경우 일반적으로 가능하지 않다. 동물 추가 (주기적 루틴 건강 시험 동안, 예를 들어) 번 이상을 샘플링 할 수있는 경우에는 그 기준 시점을 설정하고, 원하는 시간 기간이 경과 한 후에 동일한 면적 reshave하는 초기 면도를 수행하는 것이 바람직하다. 두 번째 샘플에 CORT는 그 간격을 5 이상 HPA 활동에 샘플의 CORT 내용의 정확한 원인 규명을 허용하는 면도-reshave 간격 동안에 퇴적되었다.
2. 샘플 세탁 및 건조
- 세탁
- 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브에 각 머리 샘플을 놓습니다.
- 회 전자를 사용하여 3 분 동안 반복 반전이어서 각 튜브에 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)상의 이소프로판올 5 ㎖를 추가.
- C를 복용, 폐기물 용기에 이소프로판올을 가만히 따르다샘플 중 하나를 잃을 수 없습니다.
- 반복 2.1.2과 2.1.3 번 더 반복합니다.
- 건조
- 전체 이소프로판올 증발을 보장하기 위해 최소 2 ~ 3 일 머리를 건조.
3. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 큰 샘플을위한 방법 1
- 샘플 연삭
- 스테인레스 스틸은 하나의 12mm 스테인레스 스틸 연마 공 함께 항아리 연삭 10 ㎖에 말린 머리카락의 250 밀리그램까지 넣습니다.
- 볼 밀을 사용하여 25 ㎐의 속도로 6 분 동안 샘플을 분쇄.
- 분석 저울 가루 머리의 50 밀리그램까지 달아 후속 CORT 추출을 위해 깨끗하고 2.0 ㎖의 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 관에 전송합니다.
- CORT 추출
- 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.0 ML를 추가합니다.
- 관 모자와 공동 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어회 전자를 사용하여 nstant 반전.
- 가루 모발 펠렛을 실온에서 1 분 동안 14,000 rpm에서 원심 분리 튜브.
- 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 0.6 ML을 전송합니다.
4. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 작은 샘플에 대한 방법 2
- 샘플 연삭
- 구슬 구타를위한 강화 된 preweighed 2 ㎖ microcentrifuge 관에 머리의 60 밀리그램까지 넣습니다.
- 샘플 중량을 구하는 바이알을 닫고 다시 무게를 측정한다.
- 각각의 병에 세 3.2 mm 크롬 강철 구슬을 추가 한 다음 비드 비터 적어도 2 분 동안 샘플을 갈기. 육안 검사는 시료가 충분히 분쇄 것을 알 경우, 0.5 또는 1 분 동안 추가로 연삭을 수행합니다. 참고 : CORT 추출은 연삭과 같은 바이알에서 수행되기 때문에 접지 머리 관련 전달이 경우에는 필요하지 않다.
- CORT 추출
- 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.5 ML를 추가합니다.
- 튜브를 모자와 회 전자를 사용하여 일정한 반전과 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어.
- 가루 모발 펠렛을 실온에서 5 분 동안 10,000 rpm에서 원심 분리 튜브. 참고 : 크롬 강철 구슬 방법 1에 비해 낮은 원심 분리 속도를 차지하고있는, 추출 및 원심 분리 단계에서 머리와 튜브에 남아 있습니다.
- 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 1.0 ML을 전송합니다.
5. 용매 증발 및 샘플의 재구성
- 진공 증착을 사용할 수없는 경우에는 진공 증착이나 질소 가스 스트림을 사용하여 메탄올을 말린다. 진공 증착 장치를 사용하는 경우, 메탄올은 수증기에 의해 포획 될 수있다콜드 트랩이나 활성탄 카트리지 탑재 화학 트랩.
- 메탄올의 제거 후, EIA 분석 버퍼 (분석 희석제)의 적절한 볼륨 CORT 추출물을 재구성. 비교적 높은 CORT 값이 예상되는 경우, 0.4 밀리리터 이상의 버퍼 볼륨을 사용한다. 비교적 낮은 값이 예상되는 경우, 볼륨 감도를 높이기 위해 0.2 밀리리터 이하로 감소 될 수있다. 참고 : 0.2 ㎖에 시료의 재방송이 필요한 경우에 최소한 두 번 샘플의 중복 분주을 실행하기에 충분한 양이다.
- 즉시 재구성 샘플을 분석 실험 이후 분석을 위해 -20 ° C에서 그것을 동결 하나. 주 : 재구성 된 샘플을 냉동 경우, 샘플 볼륨 변경 이후 동결 기간 동안 승화을 방지하기 위해 중요한 것은 최종 계산이 수행되는 거짓 CORT 값으로 이어질 것입니다.
6. CORT 분석 및 데이터 변환
- 를 머리 추출물을 분석CORT은 고감도 효소 면역 측정법 (EIA) 키트를 사용. 참고 : 시료 중복 각 재구성 헤어 추출물의 분주 대신 타액됩니다 것을 제외 키트 삽입에 지정된 CORT EIA 키트 상업 타액을 사용하는 경우, 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
- 모든 분석에서 사용하기위한 품질 관리 (QC)의 머리에 키스를 준비합니다.
- 여분의 모발 샘플 개수를 수집하고 어느 단계 4.1 및 4.2 단계 3.1 및 3.2에있는 큰 샘플 처리를 풀 같이 개별적으로 처리합니다.
- 용매를 증발시키고, 단계 5.1 및 5.2에서와 같이 추출물을 재구성하고 여러 개의 개별 또는 합동 샘플에서 재구성 된 추출물을 풀.
- 개별 마이크로 원심 튜브에 모아 재구성 추출물 (예를 들어, 0.10 ㎖)의 적절한 볼륨을 나누어지는하고 나중에 사용하기 위해 냉동.
- 해동 및 REFE를 제공하기 위해 각 면역 마이크로에 중복 한 QC 나누어지는 실행각 런의 품질 검사를 위해 CORT 값 rence.
- 변동 (CV; 샘플 값의 집합의 평균으로 나눈 표준 편차로 정의)의 인트라 분석 계수는 분석 간 CV가 계산 될 수있는 반면, 동일한 런 10-12 QC 웰을 분석하여 산출 할 수있다 런 그룹 걸쳐 QC 값을 사용. 하나의 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어가 각 머리 추출물을 나타내는 중복 웰 대해 CV를 계산하면, 다음 인트라 분석 CV를 결정하기위한 다른 방법은, 전체 판에 걸쳐 그 각각의 CV 값의 평균값을 계산하는 것이다.
- 모든 시료 추출물 EIA에서 가장 높은 CORT 표준보다 읽고 더를 산출하면, 추출물의 또 다른 분취 액을 분석 완충액의 적당량으로 희석하고 후속 EIA 판독은 희석 계수에 대해 보정된다. 중복 우물 CV가> 10 % 인 경우 샘플은 또한 정기적으로 다시 분석된다.
- CORT EIA 키트는 CORT VA를 측정하도록 설계되어 있기 때문에매독 타액이나 플라즈마 등의 액체 샘플에서, 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어의 출력은 분말 머리의 단위 중량 당 CORT의 양으로 변환해야합니다. 다음 수식은 MG 머리 당 PG의 CORT에 ㎍ / DL에서 분석 출력을 변환합니다 :
(A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
여기서 분석 출력에서 A = ㎍ / DL, 추출하고, 머리의 B = 체중 (밀리그램), C = 권. 메탄올 (ml의)는 분말 머리에 추가, D = 권. 추출물에서 발견 한 이후에 아래로 건조 메탄올 (ml 중), E = 권. 건조 된 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼 (ML에) 및 PG / MG 헤어 CORT 농도의 F는 = 최종 값.
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Representative Results
그림 1은 방법 2 분쇄 및 추출을 사용하여 처리 사람의 모발 샘플 (성인 남성과 여성의 인체)의 대표 세트의 출력을 보여줍니다. 컴퓨터 소프트웨어는 데이터 출력을 생성하고 CORT 표준에 4 - 파라미터 S 자형 곡선 (도 2)을 맞추기 위해 사용되었다. 이 판의 사이에 잘 CVS는 0.01-5.73 %에서 1.34 %의 평균 내부 분석 CV와 함께였다. 분석 간 CV는 4.41 % 아홉 최근 인간의 머리카락 분석에서 QC 값을 사용하여 결정되었다. (; SD 평균 ± = 36.0 ± 110 PG / MG를 평균 = 10.2 PG / MG)이 접시에 분석 된 37 샘플 3.1-650 PG / MG에서 헤어 CORT 값의 범위를 얻었다.
방법 1은 인간이 아닌 영장류 등 대형 동물의 모발 샘플을 처리하기 위해 우리 실험실에서 사용된다. (주로 여성에서) 성인 붉은 털 원숭이 머리의 대표적인 분석은 50.1-102 PG / MG에서 CORT 값의 범위 (평균 = 75.0이 나왔고, SD 평균 ±= 75.8 ± 14.0 PG / MG). 이 분석의 평균 내부 분석 CV는 2.08 % 였고, 분석 간 CV는 4.63 % 아홉 최근 원숭이 머리 분석에서 QC 값을 사용하여 결정되었다.
그림 1. 대표적인 사람의 모발 CORT 분석 용 소프트웨어 출력. 다음과 같이 중복 된 우물은 : S1-S6 - 0.012 ㎍ / DL (S6)에서 3.0 ㎍ / DL (S1)에 이르기까지 CORT 표준, 안티 CORT 부족 비특이적 결합 (NSB) 우물 -, - B1 S7 0 CORT 우물 항체 (소프트웨어는 자동으로 모든 다른 OD 측정 값의 평균 NSB 광학 밀도 [OD] 값을 빼고), C1 및 C2 - 제조업체에서 제공하는 높고 낮은 CORT 교정기, T1 - QC;
T2-T38 - 샘플. C1 가입일 T38에, 어레이의 각각의 셀에있는 상부 값은 측정 된 OD VALU이며 잘 대응하고, 쌍의 왼쪽 셀의 낮은 값이 평균 OD 값으로부터 산출 ㎍ / DL에서 CORT 값인에서 E. 샘플 T9과 T31은 높은 CORT 표준 위의 측정 값을 산출합니다. 결과적으로, 두 샘플은 나중에 분석 희석제 4 배 희석하고, 재분석 하였다. 재분석 값은 희석 요인에 대한 보정 후 사용 하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 같은 사람의 모발 분석을위한 로그 CORT 농도 대 OD 값의 표준 곡선. 패널에 표시되는 R-제곱 값은 표준 곡선의 적합의 계산 된 장점이다./ 50882/50882fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전술 한 헤어 CORT 절차 수행하도록 심플 상대적으로 저렴하고, 쉽게 이용할 화학 시약 및 소모품의 사용을하게하고, 한 가지 예외 전형적인 분석 실험실에 존재할 가능성이 있다고, 장비를 필요로한다. 예외는 볼밀 미니 beadbeater 같은 연마 장치이다. 우리는 몇 가지 연구 그룹은 작은 조각 길이 12 대략 1mm에 머리 샘플을 말하다 있습니다,하지만 우리는 연삭 수행하는 대신 가능하면 닦지 추천 우리의 관측에 근거. 문헌의 방법 론적 변화의 또 다른 영역은 종래 CORT 추출 (13)에 모발을 세정하고, 만약 그렇다면, 무엇 세척 조건의 사용 여부를 포함한다. 세정이 수행되지 않으면, 하나의 메탄올 추출물은 주 또는 육모 개월간 서서히 혼입 CORT뿐만 아니라 최근에 증착 땀 및 / 또는 피지 유래 CORT뿐만 포함될 가능성 위험머리카락의 표면. 아마도 주로 표면 오염을 나타내는 본래 머리의 짧은 이소프로판올 세척, 그리고 광범위한 메탄올 추출 액세스 할 수있는 더 밀접하게 결합 부분으로 분리 느슨하게 결합 부분 : 북극곰 샘플에 대한 연구는 머리에 두 CORT 분수의 존재를 지원 분말 머리 샘플 14. 같은 결론을 반복 이소프로판올 세척 (소개 참조) 원숭이와 인간의 머리카락에서 추출한 CORT의 감소하는 양에서 얻을 수 있습니다. 세척이 수행되는 경우에, 다른 한편으로는, 다음의 용매의 선택 및 조건을 흘려이 결과 CORT 값에 상당한 영향을 미칠 수있다. 헤어 테스트의 사회는 머리를 세척 공정 (15) 동안 헤어 매트릭스의 내부에서 팽창하고 잠재적 인 용질의 용출을 최소화하기 위해 적절한 용매를 선택하는 가이드 라인을 발표했다. 이러한 권장 사항이 머리에 약물 검사에 응용 프로그램을 위해 개발되었지만, 그들은 다시는스테로이드 분석 번트뿐만 아니라.
머리에 CORT 측정보다는 플라즈마 또는 침 장점 2의 번호를 제공합니다. 가장 중요한 것은,이 방법은 샘플을 수집하는 하루의 시간 또는 이전 컬렉션에 대한 간단한 스트레스 노출에 의해 uninfluenced된다 개월 주 동안의 기간 동안 통합 CORT 수준의 바이오 마커를 제공합니다. 같은 붉은 털 원숭이 나 곰과 같은 일부 동물 종의 표본은 안전을 위해 피사체의 마취가 필요할 수 있지만, 머리 컬렉션은 비 침습적이다. 또 다른 장점은 CORT들이 오랜 기간 동안 주위 온도에서 저장되어있는 경우에도 과거 또는 보관 샘플 분석을 허용하는 다른 샘플 매트릭스와 비교하여 모발에 매우 안정적이라는 것이다. 마지막으로, 두피에서 연속적으로 더 먼 거리에서 절단 인간의 머리 부분에있는 CORT 수준은 때때로 시간에 HPA 활동의 회고 달력을 만드는 데 사용되었다. 이러한 경우는 특별한이다반복 머리 세척에 의해 생성 된 이전에 언급 한 "유실"효과의 인식에 LY 중요합니다. 일부 연구는이 효과 8,9를 복제하는 데 실패했지만, 그것은 그 연구의 샘플이 이전에 메탄올 추출에 세척되지 않았 음을 주목할 필요가있다. 이 중요한 방법 론적 차이는 머리 CORT 수준이 두피에서 거리에 따라 감소하지 않은 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
머리 CORT 방식의 몇 가지 제한 사항도 언급해야한다. 첫째,이 방법은 HPA 활동의 시간주기 리듬 성 변화 (일부 우울증 환자에서와 같이) 또는 각성 CORT 응답을 검출 할 수 없다. 머리 CORT 수준은 호르몬 결합의 기간 동안 발생한 비교적 간단한 스트레스의 영향을 감지하지 못할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 없습니다 이러한 측정에 대한 대체로서, 타액 및 / 또는 플라즈마 CORT의 측정을 보완 생각해야한다. 둘째, 반면 모발 CORT의 사용 의지가능성이 심리적, 환경 적 스트레스에 관심이 연구자들에게 특정 값의 수, 그것은 HPA 활동은 신체 운동, 대사 이상, 감염성 질환 등을 비롯한 다양한 조건에서 발생할 수 있습니다 상승을 명심하는 것이 중요합니다. 데이터가 인간과 헤어 CORT가 혈류를 2 주로 파생되는 가설을 지원하는 원숭이 모두에서 존재하는 반면, 셋째,이 가설은 아직 입증되지 않았습니다. 실제로, 이토 및 동료 (16)는 장기 문화를 유지 microdissected 사람의 모낭에있는 기능 HPA와 같은 시스템의 존재를 증명하고있다. 모낭이 머리 축에서 측정 된 CORT에 기여하는 정도는이 시점에서 알 수없는 남아있다.
HPA 축 활동의 새로운 바이오 마커로서 개시 이후 몇 년 동안, 머리 CORT은 수많은 종에 걸쳐 다양한 애플리케이션에 사용되어왔다. 이러한 응용 프로그램의 대부분은 몇 가지 주요 t 내에장기 HPA 활성이 만성 스트레스 등 쿠싱 질환과 같은 내분비 질환이나 외상 후 스트레스 장애와 같은 신경 정신 장애 2,17-19 어떻게 연관되는지를 결정하는 목표 hemes. 다른 연구는 행동 기질, 정상적인 발달, 이러한 인간의 어린 시절의 경험이나 원숭이의 서로 다른 양육 조건, 야생 살아있는 동물의 환경 보전 등의 개발 요인의 영향, 및 후 향적 조사와 관련하여 HPA 축 기능을 검사하는 헤어 CORT를 사용했습니다 역사적 또는 보관 샘플. 머리 CORT에 대한 최신 연구 종은 인간, 인간 이외의 영장류 (원숭이, 베르 베트 원숭이와 비비)의 몇몇 종, 개, 고양이, 소, 말, 곰의 몇몇 종 (가) 있습니다. 그것은, 만성 스트레스에 대한 생리적 반응을 조사하기 위해 다른 실험 문제를 해결하기 위해 여부, 장기 HPA 활동을 평가하기 위해 머리 CORT의 사용 예를 계속 할 것 같다PAND 종의 더 큰 범위에 적용될.
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Disclosures
저자는 선언하는 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 연구에서 분석 사람의 모발 샘플을 제공 Kymberlee 오브라이언, 셀리아 무어, 에드워드 Tronick 씨 (심리학과, 매사 추세 츠, 보스턴 대학교) 감사, 스티븐 개가 아만다 Dettmer (비교 행동학, NICHD의 실험)에 대한 붉은 털 원숭이의 머리 샘플을 제공한다. 초기 개발 및이 방법을 계속 사용 MAN에 NIH RR11122에 의해 지원 된
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
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