Summary
Кортизол (CORT) накапливается в растущей волоса человека и приматов. Мы описываем методы для извлечения и анализа волос Корт с высокой точностью и чувствительностью. Измерение волос CORT особенно хорошо подходит для оценки хронический стресс за периоды недель до месяцев.
Abstract
Гормон стресса кортизол (CORT) медленно включены в растущей волоса людей, приматов и других млекопитающих. Мы разработаны и утверждены способ добычи CORT и анализа от резус волос обезьяны и впоследствии адаптирована этот метод для использования с человеческий волос на голове. В отличие от Cort «точечных проб" из плазмы или слюны, волос CORT обеспечивает интегрированный меру гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (HPA) деятельности, и, таким образом физиологический стресс, в период гормональной регистрации. Поскольку волосы головы человеческие растет со средней скоростью 1 см / месяц, уровни CORT, полученные из отрезков волос несколько см в длину может потенциально служить в качестве биомаркеров стресса испытали на протяжении ряда месяцев.
В нашем методе каждый образец волос сначала дважды промывают в изопропаноле, чтобы удалить любой Cort от наружной части волоса, которые были депонированы от пота или кожного сала. После сушкиОбразец измельчают в мелкий порошок, чтобы разбить белка матрицу волоса и увеличить площадь поверхности для добычи. CORT из внутренней части волоса экстрагируют метанолом, метанол выпаривают, и полученный экстракт восстанавливают в буфере для анализа. Извлеченные CORT, наряду с нормами и контроля качества, затем анализируют с помощью чувствительного и специфического коммерчески доступного иммуноферментного анализа (EIA) набора. Считывание из EIA преобразуется в пг CORT на мг порошкообразного массы волос. Этот метод был использован в нашей лаборатории для анализа волос Корт в людях, несколько видов макак, мартышек, собаки и белых медведей. Многие исследования как из нашей лаборатории и из других исследовательских групп продемонстрировали широкой применимости волос CORT для оценки хроническое воздействие стресса в естественных, так и лабораторные установки.
Introduction
Измерение CORT в крови, слюны или иногда в моче или кале был использован в качестве показателя физиологического стресса, так как открытие Селье роли оси НРА в стресса 1. Несмотря на многочисленные работы были опубликованы относящиеся HPA деятельность в остро стрессовые ситуации, поле было затруднено из-за отсутствия простого и надежного индекса хронического физиологического стресса. Эта проблема возникает потому, что плазма и слюны как выход «точечные» оценки HPA деятельности, которые подлежат циркадные изменения и может быть поражена нанесения ущерба окружающей среде. Мочи и кала образцы дают измерения CORT и / или метаболитов с мочой, которые охватывают ряд часов до целого дня в некоторых случаях. Коллекция из нескольких образцов с использованием любой из этих матриц может дать приблизительную сводный индекс уровнях Корт в течение долгого времени, однако, ни один из этих подходов не обеспечивает действительно долгосрочный индекс HPA деятельности и отзывчивость этого сишток в хронических стрессовых факторов.
Измерение Корт в волосах начался заполнить эту важную потребность в стресс литературы. Первоначальные исследования по нескольких лабораториях показали наличие CORT в человеческий волос, но не исследовали ли изменилось уровни волосы CORT в зависимости от стресса 2. Как наша лаборатория была заинтересована в течение многих лет в регуляции резус оси обезьяна HPA различными социальными и поведенческими факторами 3, мы приступаем к созданию и подтвердить методы извлечения и анализа резус волос обезьяны 4. Основываясь на том, что через кровь CORT медленно и непрерывно включены в растущих волос, цель этого нового метода в том, чтобы использовать уровни волос полученных CORT в качестве интегрированного индекса HPA деятельности за периоды недель до месяцев.
Несколько методологические проблемы встречались в разработке настоящий Протокол. Во-первых, предыдущие исследования показали, что небольшие количества Oе циркулирующих Корт из организма с потом и кожным салом и поэтому мог пальто с внешней поверхности волоса 2. В целях устранения этой потенциальной конфликтовать, мы разработали мягкий процедуру промывания, который появляется, чтобы удалить внешний Корт, имея минимальное влияние на CORT настоящий рамках растущего волоса. Таким образом, волосы обезьяна подвергнуты этой процедуре (т.е. две-три мин промывок изопропанола) потерял около 7-8% от общего содержания волосы CORT, а третий мыть удалены менее чем на 1% больше стероид от образца 4. Там, кажется, больше внешнего CORT в человеческий волос, так как та же самая процедура удаляется в среднем 27% общего содержания CORT из образцов (К. Розенберг и Дж. Мейера, не опубликовано). Как обезьяны волос, однако, дополнительный мытья содержится гораздо меньше Корт (около 7%), чем первых двух стирок. Таким образом, результаты как обезьяны и волос человека подтверждают утверждение, что большинство (если не все) внешний CORT может быть удалена при сохранении главную гидроразрывания CORT во внутренней матрице волос. Во-вторых, наши экспериментальные исследования также показали, что шлифовальные волосы перед экстракцией значительно увеличенный восстановление Корт от образца, предположительно разламывают сложный белковый матрицу волосяного стержня, а также увеличения площади поверхности, доступной для проникновения растворителя. Были разработаны два различных метода шлифовальные, каждый имеет свои преимущества и недостатки. Способ 1, который использует шаровую мельницу, имеет то преимущество, производя лучшие порошка. Тем не менее, шаровая мельница является относительно дорогой товар и оборудование, если они используются со стандартными размольных стаканов и шаров, он способен шлифования только два образца за один раз. Небольшие образцы также трудно обрабатывать с использованием шаровой мельницы со стандартными шлифовальных банки. Способ 2, которая использует beadbeater, является менее эффективным в своей шлифовальной способности. В результате, среднее восстановление CORT примерно на 10% ниже, с помощью этого метода по сравнению с шаровой мельнице (неопубликованные данные). С другой стороны, beadbeaterзначительно дешевле, чем шаровой мельнице, 16-24 Образцы могут быть отшлифованы сразу в зависимости от модели, и метод хорошо подходит для небольших образцов. Из-за упомянутой выше дифференциального восстановления, желательно использовать тот же метод измельчения для всех образцов в конкретном исследовании.
После того, как образцы волос были обработаны, они экстрагировали метанолом и CORT в экстрактах анализировали посредством чувствительного и специфического коммерческого набора EIA первоначально предназначенного для измерения слюнной Cort. Процедуры экстракции и аналитические были подтверждены в части, продемонстрировав, что серийные разведения экстрактов из образцов обезьяна волос дали показания ОВОС, что тесно параллельно показания, полученные из достоверных стандартов Корт. Затем мы показали, что волосы CORT (в дополнение к плазме и слюнной CORT) был чувствителен к крупной жизни стресс от административно мандатом переселения обезьян к новых жилых кварталов 4,5. Изложет документе приводится подробный отчет о методах, используемых обычно в нашей лаборатории для обработки образцов человека и обезьяны волос и извлекать и анализировать Корт из таких образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Образец Сбор и хранение
- Человеческих волос
- Закрепите всю длину волос, чтобы быть в выборку (до карандаша шириной в диаметре) с резинкой или клипа. Отрежьте волосы как можно ближе к коже головы, насколько это возможно (стараясь не ник кожи) с чистой ножницами. Примечание: стандартная площадь выборки задняя вершина черепа.
- Некоторые исследователи отметили снижение уровней волосы Корт человека с расстоянием от головы 6, которая может быть связано с вымывания от многократного воздействия воды и шампуня 7 (хотя см. Manenschijn др.. 8 и Томсон и др.. 9 для противоположных результатов в которые не наблюдалось снижение сегментарный) Чтобы свести к минимуму воздействие этого потенциала "вымывания эффекта», мы рекомендуем собирать сегментов волос проксимального к коже головы с длиной не более 3 см (при условии, средние темпы роста в 1 см / месяц 10, 3 см сегмент содержит CОРТ, что было сдано в течение примерно последних 3 месяцев). Для этого используйте линейку для измерения 3 см от первого разреза и сократить снова, получая 3 см образец. Примечание: После того, как волосы были укорочен, то больше нет необходимости держать нити в соответствие, если исследование не вовлекает сокращение образца в отдельных длинных 1 см сегментов установить ретроспективный календарь осаждения CORT за время периода до отбора проб 6.
- Поместите образец волос в мешочек из алюминиевой фольги, чистой бумаги конверта, или 15 мл завинчивающейся крышкой полипропиленовой центрифужной пробирке типа, используемого для промывки образцов. Как CORT является чрезвычайно стабильной в волосах 2, образцы можно хранить неопределенно долго при -20 ° С и, при необходимости, отправлены в течение ночи при комнатной температуре.
- Процедура сбора волос следует практиковать на добровольцах, и образцы практики должны быть взвешены, прежде чем приступать на полном исследовании. Примечание: образцы волос, как SMALL как 5-10 мг могут быть проанализированы с помощью методов, описанных здесь, хотя желательно, чтобы собрать образцы> 10 мг свести к минимуму вероятность получения показаний EIA ниже самой низкой стандарта CORT.
- Обезьяна волосы
- Бритье волос (100-250 мг) от задней части шеи с помощью стандартного животных клипер. Бритье как можно ближе к коже, как это возможно, стараясь не ник кожа и вызвать кровотечение, потому что уровни CORT крови чрезвычайно высоки по сравнению с тем, которые содержатся в волосах. Примечание: область шеи был выбран для рутинного отбора проб, потому что это, как правило, является хорошим источником волос и может быть легко наблюдается для роста волос до ресэмплинга.
- Поместите образец волос в мешочек из алюминиевой фольги или 15 мл завинчивающейся крышкой полипропиленовой центрифужной пробирке. Образцы обезьяны волос следует хранить и транспортировать таким же образом, как описано выше для образцов человеческих волос.
- Потому что обезьяна волосы, в отличие от волос на голове человека, вырастает до определенной длины, а затем улОПС растущие 11, как правило, не представляется возможным в данном случае использовать расстояние от кожи, как календарь для осаждения CORT. Однако, если животное можно попробовать более одного раза (например, во время периодических рутинных экзамены здоровья), желательно, чтобы выполнить начальное бритье, чтобы установить базовую точку времени, а затем reshave ту же самую область По истечении желаемого промежутка времени прошло. CORT во втором образце был нанесен во время бритья-reshave интервала, что позволяет точную атрибуцию содержания CORT образца к HPA деятельности за этот интервал 5.
2. Образец стирки и сушки
- Мойка
- Поместите каждый образец волос в 15 мл завинчивающейся крышкой полипропиленовой трубки центрифуги.
- Добавить 5 мл высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) класса изопропанол в каждую пробирку с последующим повторным инверсии в течение 3 мин с помощью поворотного устройства.
- Слейте изопропанол в контейнер для отходов, принимая Cне потерять ни одного образца.
- Повторите шаги 2.1.2 и 2.1.3 еще раз.
- Сушка
- Высушите волосы, по крайней мере 2-3 дней, чтобы обеспечить полное испарение изопропанол.
3. Образец Шлифовальные и CORT Добыча - Способ 1 выборкам большого объема
- Образец шлифование
- Наведите до 250 мг подсушенные волосы в 10 мл из нержавеющей стали шлифовальных банку вместе с одной 12 мм из нержавеющей стали измельчения мяч.
- Измельчите образец в течение 6 мин при скорости 25 Гц с использованием шаровой мельницы.
- Взвешивание до 50 мг порошкообразного волос на аналитических весах, а затем передать его в чистое 2,0 мл полипропиленовой трубки микроцентрифужных для последующего извлечения CORT.
- Добыча CORT
- Добавить 1,0 мл ВЭЖХ-метанол марки в микроцентрифужных трубки, содержащей порошкообразный образец.
- Закрывают пробирку и инкубировать образец в течение 18-24 ч при комнатной температуре с соnstant инверсия с использованием ротатор.
- Центрифугируйте пробирки при 14000 оборотах в минуту в течение 1 мин при комнатной температуре для осаждения порошкообразного волосы.
- Трансфер 0,6 мл супернатанта в чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл, стараясь не потревожить осадок порошкообразного волос.
4. Образец Шлифовальные и CORT Добыча - Способ 2 для малых выборок
- Образец шлифование
- Наведите до 60 мг волос в предварительно взвешенную 2 мл трубки микроцентрифужных усиленной для бисера избиения.
- Флакон взвешивают, чтобы получить вес образца.
- Добавьте три 3,2 мм из хромистой стали шарики в каждый флакон, а затем измельчить образец в течение по крайней мере 2 мин в шаровой насадкой. Если визуальный осмотр показывает, что образец недостаточно измельчают, а затем выполнить дополнительную шлифовку в течение 0,5 или 1 мин. Примечание: Нет передачи первом волос не требуется в этом случае, поскольку извлечение CORT выполняется в том же флаконе, как измельчение.
- Добыча CORT
- Добавить 1,5 мл ВЭЖХ-метанол марки в микроцентрифужных трубки, содержащей порошкообразный образец.
- Закрывают пробирку и инкубировать образец в течение 18-24 ч при комнатной температуре при постоянном инверсии с использованием ротатора.
- Центрифугируйте пробирки при 10000 оборотах в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре для осаждения порошкообразного волосы. Примечание: хром стальные шарики остаются в трубке с волосами во время добычи и центрифугирования шагов, на долю которого приходится более низкой скорости центрифугирования по сравнению с методом 1.
- Трансфер 1,0 мл супернатанта в чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл, стараясь не потревожить осадок порошкообразного волос.
5. Испарения растворителя и образец Восстановление
- Сушат вниз метанола с использованием либо вакуумный испаритель или поток газообразного азота при вакуумном испарителе не доступен. Если используется вакуумный испаритель, пар метанол могут быть захвачены с помощьюиз холодную ловушку или химического ловушку, снабженный активированным углем картриджа.
- После удаления метанола, воссоздать экстракт Cort в соответствующем объеме EIA буфере для анализа (анализ разбавитель). Если относительно высокие значения CORT ожидается, а затем использовать буферный объем 0,4 мл или более. Если относительно низкие значения ожидаются, то объем может быть уменьшен до 0,2 мл или менее, чтобы повысить чувствительность. Примечание: 0,2 мл достаточно для запуска объем дубликаты аликвот образца по крайней мере два раза в случае повтор образца не требуется.
- Либо сразу анализа восстановленного образца или заморозить при -20 ° С для последующего анализа. Примечание: Если восстановленный образец заморожены, важно, чтобы избежать сублимации во время ледостава так как изменения в объеме образца приведет к ложному значению CORT когда окончательные расчеты.
6. CORT Анализ и преобразования данных
- Анализа волос экстракты дляCORT используя высокочувствительный иммуноферментный анализ (ИФА) комплект. Примечание: При использовании коммерческую слюнных комплект CORT ОВОС, следуйте рекомендациям производителя, как указано в комплекте вставки исключением того, что тестовые образцы будут дубликаты аликвоты каждого восстановленного экстракта волос вместо образцы слюны.
- Подготовьте контроля качества (КК) экстракт волос для использования в каждом тесте.
- Соберите ряд дополнительных образцов волос и либо обрабатывать их по отдельности, как на этапах 4.1 и 4.2 или бассейн их для обработки больших образца как в шагах 3.1 и 3.2.
- Растворитель выпаривают и восстановить экстракты, как на этапах 5.1 и 5.2, а затем объединить восстановленные выдержки из нескольких отдельных или объединенных пробах.
- Аликвотировать соответствующий объем объединенного восстановленного экстракта (например, 0,10 мл) в отдельные микроцентрифужных пробирках и заморозить для последующего использования.
- Оттепель и запускать один QC аликвоты в двух экземплярах на каждом иммунологического микропланшет обеспечить REFERenče значение Корт для проверки качества каждого запуска.
- Коэффициент внутри-анализ вариации (КВ; определяется как стандартное отклонение, деленное на среднее набора значений выборок) может быть рассчитана путем анализа 10-12 QC скважин в той же перспективе, в то время как между тестовая точность может быть вычислена с использованием значений КК через группой трасс. Если свое микропланшет программное обеспечение для чтения вычисляет резюме для дублирующих скважин, представляющих каждую выписку волос, то альтернативный метод для определения внутри-анализа резюме, чтобы вычислить среднее из этих отдельных значений коэффициента вариации по всей пластине.
- Если любой экстракт дает образец чтения больше, чем на самом высоком уровне CORT в EIA, то другой Аликвоту экстракта разбавляют соответствующим количеством буфере для анализа и последующее считывание EIA корректируется на коэффициент разбавления. Образцы также регулярно переосмыслены если CV для дублирующих скважин> 10%.
- Поскольку наборы CORT ОВОС предназначены для измерения Корт васифилис в жидких образцах, таких как слюна или плазмы, выход программного обеспечения микропланшет-ридере должны быть преобразованы в количестве CORT на единицу массы порошкообразного волос. Следующая формула преобразует выходной анализа в мкг / дл до пг CORT на мг волос:
(A / B) * (C / D) * Е * 10000 = F
где A = мкг / дл анализа с выхода; B = вес (в мг) волос подвергают экстракции; С = об. (В мл) метанола добавляют к порошкообразной волос; D = об. (В мл) метанола, извлеченного из экстракта и затем сушат вниз; E = об. (В мл) в буфере для анализа, используемого для восстановления высушенного экстракта и F = конечное значение концентрации CORT волос в пг / мг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана распечатки из репрезентативного набора образцов человеческих волос (взрослых мужчин и женщин человека предметы) обрабатываются с помощью метода 2 шлифовки и добычу. Компьютерное программное обеспечение используется для генерации и вывода данных, чтобы соответствовать 4-параметрическую сигмоидальную кривую стандартов Cort (рис. 2). В между-скважины резюме от этой пластинки составляла от 0.01-5.73% со средним внутри анализа CV 1,34%. Между тестовая точность определяется с использованием значений КК из девяти последних человеческих волос анализов был 4.41%. В 37 проанализированных проб на этой пластине дали ряд волос Корт значениями из 3.1-650 пг / мг (медиана = 10,2 пг / мг; среднее ± стандартное отклонение = 36,0 ± 110 пг / мг).
Способ 1 используется в нашей лаборатории для обработки образцы волос из приматов и других крупных животных. Представитель анализ взрослого резус волос обезьяны (в основном из женщин) получали диапазон значений Корт от 50.1-102 пг / мг (средний = 75,0; среднее ± стандартное отклонение= 75,8 ± 14,0 пг / мг). Средний внутри-анализ CV для этого анализа было 2,08%, а между тестовая точность определяется с использованием значений КК из девяти последних анализов обезьяна волосы были 4,63%.
Рисунок 1. Выход Программное обеспечение для репрезентативной человеком CORT волосы анализа. Повторяющиеся скважины следующим образом: S1-S6 - стандарты CORT в пределах от 0,012 мкг / дл (S6) до 3,0 мкг / дл (S1); S7 - 0 CORT скважины; B1 - неспецифического связывания (NSB) скважин, которые не имеют анти-Cort антитело (программа автоматически вычитает среднее NSB оптической плотности значение [OD] от всех других ОП показаний); C1 и C2 - высокие и низкие калибраторы CORT предоставленные изготовителем; T1 - КК;
T2-T38 - образцы для испытаний. С С1 T38, верхнее значение в каждой ячейке массива измеряемая OD ценным э из соответствующих хорошо, и меньшее значение в левой ячейке пары является значение CORT в мкг / дл рассчитывается по значению средней OD. Обратите внимание, что образцы T9 и T31 дали показания выше на самом высоком уровне CORT. В результате, оба образца были позже разбавляют в 4 раза в аналитическом разбавителя и переосмыслены. В переосмыслены значения использовались после коррекции для фактор разведения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Стандартный кривая значений ОП в зависимости от концентрации журнала CORT за тот же человеческий анализа волос. Величина R-квадрат показано на панели А рассчитывается критерий согласия кривой стандартам./ 50882/50882fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура волосы CORT описано выше прост в исполнении, является относительно недорогим, делает использование легкодоступных химических веществ, реагентов и материалов, а также оборудование, которое требуется, за одним исключением, вероятно, будет присутствовать в типичной аналитическую лабораторию. Исключением является шлифовальное устройство, например, шаровой мельнице или мини-beadbeater. Отметим, что некоторые исследовательские группы фарш образцы волос на мелкие фрагменты примерно 1 мм в длину 12, а на основе наших наблюдений мы рекомендуем выполнять шлифование вместо мясорубки, если вообще возможно. Еще одна область, методологической изменения в литературе, включает ли или не мыть волосы до экстракции CORT 13, и если да, то мыть условия для использования. Если стиральная не выполняется, то рискует возможность того, что экстракт метанол будет содержать не только Корт включены медленно, в течение нескольких недель или месяцев роста волос, но и пот-и / или кожного сала, полученных Корт, осажденный в последнее время наповерхность волос. Исследования полярных образцов медведя поддерживает существование двух фракций Корт в волосах: слабо связанной фракции съемный кратким изопропанол мытья нетронутыми волос, которые предположительно представляет в основном поверхностное загрязнение, и более жестко связанного фракции, доступном обширной экстракции метанолом из порошкообразные образцы волос 14. То же самое можно сделать вывод из сумм уменьшения CORT, извлеченных из обезьяны и человеческого волоса путем многократного изопропанол мытья (см. Введение). С другой стороны, если выполняется стирка, то выбор растворителя и мыть условия могут иметь существенное влияние на результирующих значений Cort. Общество по испытанию волос опубликовала рекомендации для выбора подходящего растворителя, чтобы минимизировать волосы отек и потенциал растворенного вещества элюирование с внутренней стороны матрицы волос во время процесса стирки 15. Хотя эти рекомендации были разработаны для применения в наркологической в волосах, они вновьЛевант для стероидов анализа, а также.
Измерение Корт в волосах, а не плазму или слюна предлагает ряд преимуществ 2. Самое главное, этот подход обеспечивает биомаркеров интегрированных уровнях Корт более периодов недель до нескольких месяцев, что без влияния времени суток, когда образцы собранной или кратковременном воздействии стресса до сбора. Коллекция волос является неинвазивным, хотя примеры некоторых видов животных, таких как макаки-резус или медведей может потребовать обезболивания субъекта по соображениям безопасности. Еще одним преимуществом является то, что CORT является чрезвычайно стабильной в волосах по сравнению с другими матрицами образца, что позволяет анализ исторических или архивных образцов, даже если они были сохранены при температуре окружающей среды в течение длительного периода времени. Наконец, уровни CORT в человека отрезков волос, вырезанных на существенно больших расстояниях от головы иногда использовались для создания ретроспективный календарь HPA деятельности с течением времени. В таких случаях особеннолы важно быть в курсе упомянутой выше «вымывания» эффекта, производимого путем многократного мытья волос. Хотя некоторые исследования не смогли повторить этот эффект 8,9, стоит отметить, что в этих исследованиях образцы не были вымыты до экстракции метанолом. Это важное методологическое различие может помочь объяснить, почему уровень волосы CORT не отказался с расстоянием от головы.
Некоторые ограничения CORT подхода волос также должны быть указаны. Во-первых, такой подход не может обнаружить изменения в циркадных ритмичности HPA деятельности (как видно в некоторых пациентов с депрессией) или ответ пробуждение Корт. Уровни волос CORT также может не обнаружить влияние относительно коротким стресса, которые произошли в период гормональной регистрации. Таким образом, этот подход следует рассматривать как дополнение к измерениям слюнных и / или плазмы CORT, не в качестве замены для таких измерений. Во-вторых, в то время как использование волос CORT будетскорее всего, иметь особую ценность для исследователей, заинтересованных в психосоциальных и экологических стрессоров, важно иметь в виду, что повышенный HPA деятельность может иметь место при различных условиях, в том числе физических упражнений, метаболических нарушений и инфекционных заболеваний. В-третьих, в то время как существуют данные от людей и обезьян, поддерживающих гипотезу, что волосы CORT производный главным образом от кровотока 2, эта гипотеза не была доказана. Действительно, Ито и его коллеги 16 продемонстрировали существование функциональной ГПК-подобной системе в микродиссекции человека волосяных фолликулов, поддерживаемой в органной культуре. Степень, в которой волосяные фолликулы вклад в CORT измеряется в стержне волоса остается неизвестным на данный момент.
В течение всего нескольких лет после своего создания в качестве нового биомаркера оси деятельности HPA, волосы CORT был использован в самых разнообразных приложений в многочисленных видов. Многие из этих приложений входят в нескольких крупных тгемы, направленные на определение того, как долгосрочная HPA деятельность связана с хроническим стрессом, эндокринных расстройств, таких как болезнь Кушинга, или нервно-психических расстройств, таких как посттравматическое стрессовое расстройство 2,17-19. Другие исследования использовали волос Корт изучить функцию оси HPA по отношению к поведенческой темпераментом, нормального развития, влияние факторов развития, таких как ранних детских переживаний человека или разных условиях выращивания в обезьян, сохранения окружающей среды дикорастущих живых животных, и ретроспективного расследования исторических или архивных образцов. Изученных видов на сегодняшний день в отношении волос CORT включают людей, несколько видов приматов (макак, верветок и бабуинов), собак, кошек, крупного рогатого скота, лошадей, и несколько видов медведей. Вполне вероятно, что использование волос CORT для оценки долгосрочного HPA деятельность, будь исследовать физиологическую реакцию на хронический стресс или для решения других экспериментальных вопросы, будут по-прежнему эксширить и должны применяться в еще более широкий диапазон видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов для объявления.
Acknowledgments
Мы благодарим Kymberlee О'Брайен, Celia Мур, и Эдвард Tronick (факультет психологии, Университет Массачусетса, Бостон) за предоставление человека образцы волос, проанализированные в этом исследовании, и Стивен Суоми и Аманда Деттмер (Лаборатория сравнительной этологии, NICHD) для предоставление резус образцы обезьяна волос. Начальное развитие и дальнейшее использование этого метода была поддержана NIH RR11122 для MAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
