Summary
Kortisol (CORT) ackumuleras i den växande hårstrået av människor och icke-mänskliga primater. Vi beskriver metoder för att extrahera och analysera hår CORT med hög precision och känslighet. Mätning av hår CORT är särskilt väl lämpad för att bedöma kronisk stress under perioder av veckor till månader.
Abstract
Stresshormonet kortisol (CORT) långsamt införlivas i den växande hårstrået av människor, icke-mänskliga primater och andra däggdjur. Vi utvecklas och valideras en metod för CORT extraktion och analys från rhesusapa hår och därefter anpassat metoden för användning med människans hårbotten hår. I motsats till CORT "punktprov" som erhållits från plasma eller saliv, hår CORT ger ett integrerat mått på hypotalamus-hypofys-binjurebark (HPA) systemaktivitet, och därmed fysiologisk stress, under tiden för hormon inkorporering. Eftersom människans hårbotten hår växer på en genomsnittlig hastighet av 1 cm / månad, CORT halter som erhållits från hår segment flera cm i längd kan eventuellt fungera som en biomarkör för stress som upplevs under ett antal månader.
I vår metod är varje hårprov tvättas först två gånger i isopropanol för att avlägsna eventuellt CORT från utsidan av hårstrået som har deponerats av svett eller talg. Efter torkningProvet maldes till ett fint pulver för att bryta upp hårets proteinmatris och öka ytarean för extraktion. CORT från det inre av hårskaftet extraheras i metanol, metanolen indunstades, och extraktet rekonstitueras i analysbuffert. Extraherad CORT, tillsammans med standarder och kvalitetskontroller, analyseras sedan med hjälp av en känslig och specifik kommersiellt tillgänglig enzymimmunanalys (EIA)-kit. Avläsning från MKB omvandlas till pg CORT per mg pulveriserad hår vikt. Denna metod har använts i vårt laboratorium för att analysera hår CORT hos människor, flera arter av makak-apor, silkesapor, hundar och isbjörnar. Många studier både från vårt labb och från andra forskargrupper har visat på bred tillämpning av hår CORT för bedömning av kronisk stress exponering i naturliga såväl som laboratoriemiljö.
Introduction
Mätning av CORT i plasma, saliv, eller ibland i urin eller avföring har använts som ett index på fysiologisk stress eftersom Selye upptäckt av rollen av HPA-axeln stress 1. Trots att ett stort antal artiklar har publicerats avseende HPA-aktivitet för att akut stressande situationer, har området hämmats av bristen på ett enkelt och tillförlitligt index för kronisk fysiologisk stress. Detta problem uppstår eftersom plasma och saliv både avkastning "point" uppskattningar av HPA-aktivitet som är föremål för dygnsrytm variation och kan förväxlas med miljöstörningar. Urin-och avföringsprov ger mätningar av CORT och / eller metabolit utsöndring som spänner över flera timmar upp till en hel dag i vissa fall. Insamling av flera prover som använder någon av dessa matriser kan ge en grov sammansatt index av CORT nivåer över tiden, men ingen av dessa metoder ger en verkligt långsiktig index på HPA-aktivitet och lyhördhet detta SYstem till kroniska stressfaktorer.
Mätning CORT i håret har börjat fylla denna viktiga behov i stresslitteraturen. Inledande studier av flera laboratorier påvisat CORT i människohår, men har man inte undersökt huruvida håret CORT nivåerna förändras som en funktion av spänning 2. Eftersom vårt laboratorium har varit intresserad i många år i regleringen av den rhesusapa HPA-axeln av olika sociala och beteendemässiga faktorer 3, vi ut för att etablera och validera metoder för extraktion och analys av rhesusapa hår 4. Baserat på antagandet att blodburen CORT långsamt och kontinuerligt införlivas växande hår, syftet med den nya metoden var att använda nivåerna av hår-derived CORT som ett integrerat index på HPA-aktivitet under perioder av veckor till månader.
Flera metodologiska utmaningar påträffades i att utveckla det nuvarande protokollet. Först hade tidigare studier visat att små mängder of cirkulerande CORT utsöndras i svett och talg och därför kunde belägga utsidan av hårstrået 2. För att eliminera denna potential förväxla, utvecklade vi en mild tvättförfarande som verkar för att ta bort yttre CORT samtidigt ha minimal inverkan på CORT närvarande inom det växande hårstrået. Sålunda apa hår utsattes för detta förfarande (dvs. två 3-min tvättningar med isopropanol) förlorade ca 7-8% av den totala hår CORT innehåll, och en tredje tvätt avlägsnas mindre än 1% mer steroid från provet 4. Det verkar finnas fler externa CORT i människohår, eftersom samma förfarande bort i genomsnitt 27% totala CORT innehåll från proverna (K. Rosenberg och J. Meyer, opublicerade). Liksom apa hår emellertid ett ytterligare tvätt innehöll mycket mindre CORT (ca 7%) än de första två tvättarna. Därför resultat från både apa och människohår stöder påståendet att de flesta (om inte alla) extern CORT kan tas bort samtidigt som en stor fracning av CORT på den inre hår matrisen. För det andra, våra pilotstudier visade även att slip håret före extraktion signifikant ökad CORT återhämtning från provet, troligen genom att bryta upp den komplexa proteinartad matris av hårstrået samt öka den tillgängliga ytan för lösningsmedelspenetration. Två olika malningsmetoder har utvecklats, var och en med fördelar och nackdelar. Metod 1, som använder en kulkvarn, har fördelen av att producera den finaste pulver. Emellertid är en kulkvarn en relativt dyr utrustning produkten och, om den används med standardmalningsburkar och kulor, är det i stånd att mala endast två prover samtidigt. Små prover är också svåra att bearbeta med hjälp av en kulkvarn med standardslip burkar. Metod 2, som använder en beadbeater, är mindre effektiv i sin slipförmåga. Som ett resultat är genomsnittliga CORT återhämtning cirka 10% lägre med denna metod jämfört med kulkvarn (opublicerade data). Å andra sidan, en beadbeaterär betydligt billigare än en boll kvarn, kan 16-24 prover slipas på en gång, beroende på modell, och den metod som lämpar sig väl för små prover. På grund av det ovan nämnda differential återhämtning, är det lämpligt att använda samma slipmetod för alla prover inom en viss studie.
När hårprover har behandlats, de extraheras med metanol och CORT i extrakten analyseras med hjälp av en känslig och specifik kommersiell EIA kit ursprungligen för att mäta saliv CORT. Utvinning och analysförfaranden validerades delvis genom att visa att seriespädningar av extrakt från apa hår prover gav MKB avläsningar som nära jämförde avläsningar erhållna från autentiska CORT standarder. Vi visade då att håret CORT (förutom plasma och saliv CORT) var känslig för de stora livsstressfaktor för ett administrativt uppdrag omlokalisering av aporna till nya bostäder kvartal 4,5. Den pret papper ger en detaljerad redogörelse för de metoder som används rutinmässigt i vårt laboratorium för att bearbeta hårprover mänskliga och apa och att utvinna och analysera CORT från sådana prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning och förvaring
- Människohår
- Säkra hela längden av hår som ska provtas (upp till en penna-bredd i diameter) med ett gummiband eller klippet. Klipp håret så nära hårbotten som möjligt (se till att inte nick huden) med en ren sax. Obs: Standardprovtagningsområde är den bakre vertex av skallen.
- Vissa forskare har rapporterat en nedgång i mänskliga hår CORT nivåer med avstånd från hårbotten 6, vilket kan bero på washout från upprepad exponering för vatten och schampo 7 (men se Manenschijn et al. 8 och Thomson et al. 9 för motsatta resultat i som någon segment minskning observerades) För att minimera effekterna av denna potential "wash-out-effekten", rekommenderar vi att samla hår segment proximalt till hårbotten med en längd som inte är större än 3 cm (förutsatt en genomsnittlig tillväxttakt på 1 cm / månad 10, en 3 cm segment innehåller CORT som har deponerats under ungefär de senaste 3 månaderna). För att åstadkomma detta, använd en linjal för att mäta 3 cm från det första snittet och skära igen för att ge 3 cm provet. Obs: När håret har klippts till rätt längd, är det inte längre nödvändigt att hålla trådarna i linje om studien innebär att skära provet i separata 1 cm långa segment för att upprätta en retrospektiv kalender CORT nedfall över tidsperioden före provtagningen 6.
- Placera provet hår i en påse gjord av aluminiumfolie, en ren papperskuvert, eller ett 15 ml med skruvlock av polypropen centrifugrör av den typ som användes för prov tvättning. Såsom CORT är extremt stabilt i hårfärg 2 kan proverna förvaras under obegränsad tid vid -20 ° C, och, om nödvändigt, levereras över natten vid omgivningstemperatur.
- Förfarandet hår samlingen bör praktiseras på volontärer och övnings Provet skall vägas in innan man börjar på en fullständig undersökning. OBS: Hår prover som small såsom 5-10 mg kan analyseras med användning av de metoder som beskrivs här, även om det är önskvärt att samla prover> 10 mg för att minimera sannolikheten för att erhålla EIA-avläsningar under den lägsta CORT standarden.
- Monkey hår
- Raka håret (100-250 mg) från nacken med en vanlig djurklippare. Raka så nära huden som möjligt och att vara noga med att inte nick huden och orsaka blödning eftersom blod CORT nivåer är extremt höga i jämförelse med de som finns i håret. Obs! Nacken valdes för rutinmässig provtagning eftersom det i allmänhet är en bra källa av hår och kan lätt observeras för hår återväxt före omsampling.
- Placera provet hår i en påse tillverkad av aluminiumfolie eller ett 15 ml med skruvlock av polypropen centrifugrör. Monkey hår Prover ska förvaras och transporteras på samma sätt som beskrivits ovan för människohår prover.
- Eftersom apa hår, i motsats till människans hårbotten hår, växer till en viss längd och sedan stops växer 11, är det i allmänhet inte möjligt i det här fallet för att använda avstånd från huden som en kalender för CORT nedfall. Men om ett djur kan ta prov flera gånger (till exempel under regelbundna rutinmässiga hälsoundersökningar), är det önskvärt att utföra en inledande rakning för att ställa in en baslinje tidspunkt och sedan reshave samma område efter önskad tid har förflutit. CORT i det andra provet deponerades under rakning-reshave intervall, vilket möjliggör en exakt fördelning av provets CORT innehåll till HPA-aktivitet under detta intervall 5.
2. Prov Tvätt och Tork
- Tvättning
- Placera varje hår provet i en 15 ml med skruvlock av polypropylen centrifugrör.
- Tillsätt 5 ml av högeffektiv vätskekromatografi (HPLC)-grade isopropanol till varje rör följt av upprepad inversion under 3 min med användning av en rotator.
- Häll av isopropanol i en avfallsbehållare, med cfinns för att inte förlora någon av provet.
- Upprepa steg 2.1.2 och 2.1.3 gång.
- Torkning
- Torka håret i minst 2-3 dagar för att säkerställa fullständig isopropanol avdunstning.
3. Prov Slipning och CORT Extraction - Metod 1 för stora prov
- Prov slipning
- Placera upp till 250 mg av det torkade håret i en 10 ml rostfri slip burk tillsammans med en enda 12 mm rostfritt stål slipning boll.
- Mal provet under 6 min vid en hastighet av 25 Hz genom att använda en kulkvarn.
- Väg upp till 50 mg pulveriserad hår på en analysvåg och sedan överföra det till ett rent 2,0 ml polypropylen mikrocentrifugrör för efterföljande CORT utvinning.
- CORT extraktion
- Lägg till 1,0 ml av HPLC-kvalitet metanol till mikrocentrifugrör innehållande pulvriserat prov.
- Förslut röret och inkubera provet under 18-24 h vid rumstemperatur med constant inversion med användning av en rotator.
- Centrifugera rören vid 14.000 rpm under 1 min vid rumstemperatur för att pelletera den pulvriserade hår.
- Överför 0,6 ml av supernatanten till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör, noga med att inte störa pelleten av pulveriserad hår.
4. Prov Slipning och CORT Extraction - Metod 2 för små prover
- Prov slipning
- Placera upp till 60 mg av håret i en i förväg vägd 2 ml mikrocentrifugrör förstärkt för pärla stryk.
- Väg åter flaskan för att få provvikten.
- Lägg tre 3.2 mm krom stål pärlor till varje flaska och sedan slipa provet i minst 2 minuter i en pärla visp. Om visuell inspektion visar att provet är otillräckligt pulveriseras, sedan utföra ytterligare slipning för 0,5 eller 1 min. OBS: Det behövs ingen överlåtelse av marken håret i detta fall eftersom CORT extraktion utförs i samma flaska som slipning.
- CORT extraktion
- Lägg till 1,5 ml av HPLC-kvalitet metanol till mikrocentrifugrör innehållande pulvriserat prov.
- Förslut röret och inkubera provet under 18-24 h vid rumstemperatur med konstant inversion med användning av en rotator.
- Centrifugera rören vid 10.000 rpm under 5 min vid rumstemperatur för att pelletera den pulvriserade hår. Obs: Kulorna krom stål kvar i tuben med håret under utvinning och centrifugeringssteg, som står för den lägre centrifugeringshastighet jämfört med metod 1.
- Överför 1,0 ml av supernatanten till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör, noga med att inte störa pelleten av pulveriserad hår.
5. Lösningsmedelsindunstning och Prov Rekonstitution
- Torka ned metanol med användning av antingen en vakuumindunstare eller en ström av kvävgas vid en vakuumindunstare är inte tillgänglig. Om en vakuumindunstare användes kan den metanolånga infångas medelstav en kylfälla eller en kemisk fälla utrustad med aktiverad träkol patron.
- Efter avlägsnande av metanol, rekonstruera den CORT extrakt i en lämplig volym av MKB analysbuffert (analysutspädningsmedel). Om relativt höga CORT värden förväntas, sedan använda en buffertvolym på 0,4 ml eller mer. Om relativt låga värden förutses, då kan volymen minskas till 0,2 ml eller mindre för att öka känsligheten. Anm: 0,2 ml är tillräcklig volym för att köra dubbla portioner av provet minst två gånger om en repris av provet krävs.
- Antingen analysera den rekonstituerade provet omedelbart eller frysa den vid -20 ° C för senare analys. OBS: Om det rekonstituerade provet fryst, är det viktigt att undvika sublimering under frys perioden sedan en förändring i provvolymen kommer att leda till en falsk CORT värde när de slutliga beräkningarna utförs.
6. CORT analys och Data Conversion
- Analysera extrakten hår förCORT använder en högkänslig enzymimmunoanalys (EIA) kit. OBS: Om du använder en kommersiell saliv CORT EIA kit, följ tillverkarens rekommendationer som anges i satsen insatsen med undantag för att proverna blir dubbla portioner av varje rekonstituerad hår extrakt istället för salivprov.
- Förbered en kvalitetskontroll (QC) hår extrakt för användning i varje analys.
- Samla ett antal extra hår prover och antingen bearbeta dem individuellt som i steg 4.1 och 4.2 eller förenar dem för stora prov bearbetning som i steg 3.1 och 3.2.
- Indunsta lösningsmedlet och rekonstruera de extrakt som i steg 5.1 och 5.2, sedan slå ihop de ombildade extrakt från flera enskilda eller sammanslagna prover.
- Alikvotera lämplig volym av den poolade rekonstituerade extraktet (t.ex. 0,10 ml) i individuella mikrocentrifugrör och frysa för senare användning.
- Tina och kör en QC alikvot i två exemplar på vart och immunmikroplatta för att ge en refeRence CORT värde för kontroll av kvaliteten på varje körning.
- En intra-assay variationskoefficienten (CV; definieras som standardavvikelsen dividerad med medelvärdet av en uppsättning av exempelvärden) kan beräknas genom att analysera 10-12 QC brunnar i samma körning, under det att en inter-assay CV kan beräknas med hjälp av QC värden över en grupp av körningar. Om en s mikroplattläsare programvara beräknar en CV för kontrollerna representerar varje hår extrakt, då en alternativ metod för bestämning av intra-assay CV är att beräkna medelvärdet av dessa individuella CV-värdena över hela plattan.
- Om någon provextrakt ger en läsning högre än den högsta CORT standard i MKB, sedan en annan alikvot av extraktet späds med en lämplig mängd analysbuffert och den efterföljande MKB avläsning korrigeras för utspädningsfaktorn. Prover också rutinmässigt analyseras om om CV för kontrollerna är> 10%.
- Eftersom CORT EIA kit är utformade för att mäta CORT vaLues i vätskeformiga prover, såsom saliv eller plasma, måste utsignalen från mikroplattläsare programvara omvandlas till mängden CORT per viktenhet av pulverformigt hår. Följande formel omvandlar analys produktionen i ug / dl till pg CORT per mg hår:
(A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
där A = ng / dl från analys utgång, B = vikt (i mg) av hår utsattes för extraktion, C = vol. (I ml) metanol sattes till den pulverformiga hår, D = vol. (I ml) av metanol utvinnas från extraktet och torkas därefter ned, E = vol. (I ml) i analysbuffert användes för att rekonstituera det torkade extraktet, och F = slutvärde av hår CORT koncentration i pg / mg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar utskriften från ett representativt urval av människohår prover (vuxna manliga och kvinnliga försökspersoner) bearbetats med metod 2 slipning och utvinning. Dataprogram användes för att generera den data som matas ut och för att passa en 4-parameters sigmoidal kurva till Cort standarderna (Figur 2). De mellan-och CV från denna platta varierade från 0,01 till 5,73% med en genomsnittlig intra-assay CV på 1,34%. Den inter-assay CV bestäms med hjälp av QC-värden från nio senaste människohår analyser var 4,41%. De 37 prover som analyserats på denna platta gav en rad hår CORT värden från 3,1 till 650 pg / mg (median = 10,2 pg / mg, medelvärde ± SD = 36,0 ± 110 pg / mg).
Metod 1 används i vårt laboratorium för att behandla hår prover från icke-mänskliga primater och andra stora djur. En representativ analys av vuxna rhesusapa hår (mestadels från kvinnor) gav en rad CORT värden 50,1-102 pg / mg (median = 75,0; medelvärde ± SD= 75,8 ± 14,0 pg / mg). Den genomsnittliga intra-assay CV för denna analys var 2,08%, och den inter-assay CV bestäms med hjälp av QC-värden från nio senaste apa hår analyser var 4,63%.
Figur 1. Programvara utgång för en representativ människohår CORT analys. De dubbla brunnar enligt följande: S1-S6 - CORT standarder varierande från 0,012 ng / dl (S6) till 3,0 | j, g / dl (S1); S7 - 0 CORT brunnar B1 - ospecifik bindning (NSB) brunnar som saknar anti-CORT antikropp (den programvara subtraherar automatiskt genomsnitts NSB optisk densitet [OD] värde från alla andra OD-avläsningar), C1 och C2 - höga och låga CORT kalibratorer som tillhandahålls av tillverkaren, T1 - QC;
T2-T38 - proverna. Från C1 till T38 är den uppmätta OD-vär det övre värdet i varje cell i matrisen e från motsvarande väl, och det lägre värdet i den vänstra cellen i paret är CORT värdet i ug / dl beräknas utifrån medelvärdet av OD. Observera att prover T9 och T31 gav läsningar ovanför högsta CORT standard. Som ett resultat, var båda proverna senare utspädd 4 gånger i analysspädningsmedel och analyseras om. De omanalyseras värdena användes efter korrigering för spädningsfaktorn. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Standardkurva för OD-värden kontra log CORT koncentration för samma människohår analys. R-kvadratvärde som visas i panel A är den beräknade godhet passning av kurvan till standarderna./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Håret CORT förfarande som beskrivs ovan är enkel att utföra, är relativt billigt, använder sig av lättillgängliga kemikalier, reagenser och material, och kräver utrustning som, med ett undantag, kommer sannolikt att vara närvarande i en typisk analyslaboratorium. Undantaget är en malningsanordning, såsom en kulkvarn eller mini-beadbeater. Vi noterar att vissa forskargrupper finhacka hår prover i små fragment ungefär 1 mm i längd 12, men baserat på våra observationer vi rekommenderar att utföra slipning istället för hackning, om det alls är möjligt. Ett annat område av metodologiska variationen i litteraturen handlar om att inte tvätta håret före CORT extraktion 13, och i så fall i vilken tvätt förhållanden använder. Om tvättning inte utförs, då riskerar man möjligheten att metanolextraktet innehåller inte bara CORT införlivas långsamt under veckor eller månader av hårväxt utan också svett-och / eller talg-härledda CORT deponeras nyligen påytan av håret. Studier på isbjörns prover stödja förekomsten av två CORT fraktioner i håret: en löst bunden fraktion borttagbar med kort isopropanol tvättning av intakt hår som förmodligen representerar främst nedsmutsning av ytor, och ett mer tätt bundna fraktionen som är tillgänglig med omfattande metanol utvinning av pulveriserade hårprover 14. Samma slutsats kan dras av minskande mängder CORT extraherade från apa och människohår genom upprepad isopropanol tvätt (se Inledning). Å andra sidan, om tvättning utförs, då valet av lösningsmedel och tvättbetingelser kan ha en betydande inverkan på de resulterande CORT värden. The Society of Hair Testning har publicerat riktlinjer för val av ett lämpligt lösningsmedel för att minimera hår svullnad och potentiella löst ämne eluering från det inre av håret matrisen under tvättprocessen 15. Även om dessa rekommendationer utvecklades för applicering på drogtestning i håret, de är relevant för steroid analys också.
Mätning CORT i håret i stället för plasma eller saliv erbjuder ett antal fördelar 2. Viktigast av allt, ger denna metod en biomarkör för integrerade CORT nivåer under perioder av veckor till månader som är opåverkad av den tid på dygnet när prover samlas in eller genom korta spänningsexponering före samlingen. Hår samling är icke-invasiv, även om provtagning av vissa djurarter, t.ex. rhesusapor eller björnar kan kräva bedövning i ämnet av säkerhetsskäl. En annan fördel är att CORT är extremt stabila i håret jämfört med andra provmatriser, som tillåter analys av historiska eller arkiverings prover, även om de har förvarats vid omgivande temperatur under en lång tidsperiod. Slutligen har CORT nivåer i människohår segment skärs vid successivt större avstånd från hårbotten ibland använts för att skapa en retrospektiv kalender av HPA-aktivitet över tid. I sådana fall är det specielltly viktigt att vara medveten om den tidigare nämnda "wash-out"-effekt som produceras genom upprepad hårtvätt. Även om vissa studier har misslyckats med att replikera denna effekt 8,9, är det värt att notera att i de studier proverna inte tvättas före metanolutvinning. Denna viktiga metodologiska skillnad kan hjälpa till att förklara varför håret CORT nivåerna inte sjunker med avståndet från hårbotten.
Vissa begränsningar av håret CORT strategi bör också nämnas. För det första kan denna metod inte upptäcka förändringar i dygnsrytm rhythmicity av HPA-aktivitet (som sett i vissa deprimerade patienter) eller uppvaknandet CORT svar. Hår CORT nivåer också kanske inte upptäcker effekterna av relativt korta stressfaktorer som inträffat under tiden för hormon inkorporering. Därför bör trodde att detta tillvägagångssätt som ett komplement till mätningar av saliv och / eller plasma CORT, inte som en ersättning för sådana mätningar. För det andra, medan användningen av hår CORT kommersannolikt vara av särskilt värde för forskare som är intresserade av psykosociala och miljöpåverkande faktorer, är det viktigt att komma ihåg att förhöjda HPA-aktivitet kan ske under olika förhållanden, inklusive motion, metabola störningar, och infektionssjukdomar. För det tredje, medan det finns data från både människor och apor som stöder hypotesen att håret CORT härrör huvudsakligen från blodet 2, denna hypotes har ännu inte bevisats. Faktum Ito och medarbetare 16 har visat att det finns en fungerande HPA-liknande system i microdissected mänskliga hårsäckar bibehålls i organkultur. Den grad till vilken hårsäckar bidra till CORT mätt i hårstrået är okänd vid denna tidpunkt.
På bara några år sedan starten som en ny biomarkör i HPA-axeln aktivitet, har håret CORT använts i en mängd olika applikationer inom många arter. Många av dessa program faller inom flera stora tHemes som syftar till att bestämma hur långsiktig HPA-aktivitet är relaterad till kronisk stress, endokrina sjukdomar såsom Cushings sjukdom eller neuropsykiatriska störningar såsom posttraumatiskt stressyndrom 2,17-19. Andra studier har använt hår CORT att undersöka HPA-axel funktion i relation till beteende temperament, normal utveckling, påverkan av utvecklingsmässiga faktorer såsom tidiga barndomsupplevelser i människor eller olika uppfödningsförhållanden i apor, bevarande av vilda levande djur miljö, och retrospektiv undersökning av historiska eller arkivprover. Arter som studerats hittills när det gäller hår CORT inkluderar människor, flera arter av icke-mänskliga primater (makaker, vervet apor och babianer), hundar, katter, nötkreatur, hästar och flera arter av björnar. Det är troligt att användningen av hår CORT att bedöma långsiktig HPA-aktivitet, om att undersöka den fysiologiska reaktion på kronisk stress eller för att ta itu med andra experimentella frågor, kommer att fortsätta att exPAND och som skall tillämpas på ett ännu större urval av arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Kymberlee O'Brien, Celia Moore, och Edward Tronick (Psykologiska institutionen, University of Massachusetts, Boston) för att tillhandahålla de mänskliga hår prover som analyserats i denna studie, och Stephen Suomi och Amanda Dettmer (Laboratoriet för jämförande etologi, NICHD) för tillhandahålla Rhesusapa hårprover. Initial utveckling och fortsatt användning av denna metod har fått stöd av NIH RR11122 till MAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
