Summary
Kortisol (CORT) akkumuleres i den voksende håret av mennesker og ikke-menneskelige primater. Vi beskriver fremgangsmåter for ekstrahering og analyse av hår CORT med høy presisjon og følsomhet. Måling av hår CORT er spesielt godt egnet for å vurdere kronisk stress over perioder på uker til måneder.
Abstract
Stresshormonet kortisol (CORT) er sakte innlemmet i den voksende håret av mennesker, ikke-menneskelige primater, og andre pattedyr. Vi utviklet og validert en fremgangsmåte for CORT ekstraksjon og analyse av rhesus ape hår og senere tilpasset denne fremgangsmåte for bruk sammen med human hodehår. I motsetning til CORT "punktprøver" hentet fra plasma eller spytt, gir håret CORT en integrert mål på hypothalamus-hypofyse-binyrebark (HPA) system aktivitet, og dermed fysiologisk stress, i løpet av hormonet innlemmelse. Fordi menneskelig hodehår vokser til en gjennomsnittlig rate på 1 cm / måned, CORT nivåer hentet fra hår segmenter noen cm i lengden kan potensielt tjene som en biomarkør for stress opplevd over flere måneder.
I foreliggende fremgangsmåte blir hver hår prøve først vasket to ganger i isopropanol for å fjerne eventuelle CORT fra utsiden av håret som er blitt avsatt fra svette eller talg. Etter tørking iprøven blir malt til et fint pulver for å bryte opp hårets proteinmatriks og øke overflatearealet for ekstraksjon. CORT fra det indre av håret ekstraheres i metanol, blir metanolen fordampet, og ekstraktet rekonstitueres i analysebuffer. Utpakkede CORT, sammen med standarder og kvalitetskontroll, blir deretter analysert ved hjelp av en sensitiv og spesifikk kommersielt tilgjengelig enzym-immunoassay (EIA) kit. Avlesning fra EIA er konvertert til pg CORT per mg pulverisert hår vekt. Denne metoden har vært brukt i vårt laboratorium for å analysere hår CORT hos mennesker, flere arter av macaque aper, silkeaper, hunder og isbjørn. Mange studier både fra vår lab og fra andre forskningsgrupper har vist bred anvendelse av hår CORT for vurdering av kronisk stress eksponering i naturlig samt laboratoriemiljøer.
Introduction
Måling av CORT i plasma, spytt, eller av og til i urin eller avføring har blitt brukt som en indeks av fysiologisk stress siden Selye oppdagelse av rollen til HPA-aksen i stress en. Selv om tallrike artikler er publisert vedrørende HPA aktiviteten til akutt stressende situasjoner, har feltet vært hemmet av mangel på en enkel og pålitelig indeks av kronisk fysiologisk stress. Dette problemet oppstår fordi plasma og spytt både avkastning "Point" estimater av HPA-aktivitet som er gjenstand for circadian variasjon og kan bli forvirret av miljøforstyrrelser. Urin og fecal prøver gi målinger av CORT og / eller metabolitten utskillelse som spenner over et antall timer opp til en hel dag i enkelte tilfeller. Samling av flere prøver ved å bruke en hvilken som helst av disse matrisene kan gi et grovt komposittindeks på CORT nivåer over tid, men ingen av disse metoder gir en virkelig langvarig indeks av HPA aktivitet og respons av dette system til kroniske stressfaktorer.
Måling CORT i håret har begynt å fylle denne viktige behov i stress litteratur. Innledende studier av flere laboratorier viste tilstedeværelse av CORT i humant hår, men ikke undersøke hvorvidt hår CORT nivåer endres som en funksjon av stress 2. Som vårt laboratorium har vært interessert i mange år i reguleringen av den rhesus ape HPA-aksen ved ulike sosiale og atferdsmessige faktorer tre, setter vi ut for å etablere og validere metoder for utvinning og analyse av rhesus ape hår fire. Basert på premisset om at blod-borne CORT er langsomt og kontinuerlig innlemmet i voksende hår, er hensikten med denne nye metoden var å bruke nivåer av hår-avledet CORT som en integrert indeks av HPA aktivitet over perioder på uker til måneder.
Flere metodiske utfordringer ble påtruffet i å utvikle den nåværende protokollen. Først tidligere studier hadde vist at små mengder of sirkulerende CORT utskilles i svette og talg og derfor kunne strøk utsiden av håret to. For å eliminere dette potensialet forvirre, utviklet vi en mild vaskeprosedyren som ser ut til å fjerne ekstern CORT samtidig ha en minimal effekt på CORT stede innen det voksende håret. Således, ape håret utsettes for denne fremgangsmåten (dvs. to tre-min vaskinger med isopropanol) tapte omtrent 7-8% av det totale hår CORT innhold, og en tredje vask fjernes mindre enn 1% mer steroid fra prøven 4. Det synes å være mer ekstern CORT i menneskehår, siden den samme prosedyre fjernet et gjennomsnitt på 27% total CORT innhold fra prøvene (K. Rosenberg and J. Meyer, upublisert). Som ape hår, men inneholdt en ekstra vaske mye mindre CORT (ca. 7%) enn de første to vaskinger. Derfor Resultatene fra begge ape og menneskehår støtter påstanden om at de fleste (om ikke alle) ytre CORT kan fjernes og samtidig opprettholde en stor fracsjon av CORT i det indre hår matrisen. For det andre pilotstudier viste også at slipe håret før ekstraksjon betydelig økt CORT utvinning fra prøven, antagelig ved å bryte åpen komplekse proteinholdig grunnmasse av håret i tillegg til å øke overflatearealet tilgjengelig for penetrering oppløsningsmiddel. To forskjellige slipemetoder ble utviklet, hver med fordeler og ulemper. Metode 1, som anvender en kulemølle, har fordelen av å produsere det fineste pulver. Imidlertid er en kulemølle en forholdsvis kostbart utstyr for elementet og, hvis det brukes med standard slipe glass og kuler, er det i stand til å slipe det bare to prøver på en gang. Små prøver er også vanskelig å behandle ved hjelp av en kulemølle med standard slipe krukker. Metode 2, som bruker en beadbeater, er mindre effektive i sin slipeevne. Som et resultat er gjennomsnittet CORT gjenoppretting omtrent 10% lavere ved hjelp av denne metoden i forhold til den kulemølle (upubliserte data). På den annen side, en beadbeaterer betydelig rimeligere enn en kulemølle, kan 16 til 24 prøvene slipes samtidig, avhengig av modellen, og fremgangsmåten er godt egnet for små prøver. På grunn av den ovenfor nevnte differensial utvinning, er det tilrådelig å bruke samme slipemetode for alle prøver i løpet av en bestemt undersøkelse.
Når hårprøver er blitt behandlet, blir de trukket ut med metanol og Cort i ekstraktene blir analysert ved hjelp av en sensitiv og spesifikk kommersiell EIA kit opprinnelig ble utviklet for å måle spytt CORT. Utvinning og analyseprosedyrene ble validert i en del ved å demonstrere at serielle fortynninger av ekstrakter fra ape hårprøver ga EIA avlesninger som tett parallell målingene hentet fra autentiske CORT standarder. Vi viste at håret CORT (i tillegg til plasma-og spytt CORT) var følsom for store livet stressor av et administrativt mandat flytting av apekatter til nye boligkvarter 4,5. Den presentat papir gir en detaljert redegjørelse av metodene som brukes rutinemessig i vårt laboratorium for å behandle menneskelige og ape hårprøver og å trekke ut og analysere CORT fra slike prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Prøvetaking og oppbevaring
- Menneskehår
- Sikre hele lengden av hår som skal avsøkes (opp til en blyant-bredde i diameter) med en gummistrikk eller klips. Klipp håret så nær hodebunnen som mulig (pass på å ikke nick huden) med en ren saks. Merk: Standardprøvetakingsområdet er den bakre toppunktet av skallen.
- Noen etterforskere har rapportert en nedgang i menneskelig hår CORT nivåer med avstanden fra hodebunnen 6, noe som kan skyldes utvasking av gjentatt eksponering for vann og sjampo 7 (men se Manenschijn et al. 8 og Thomson et al. 9 for strid resultater i som ingen segmental nedgang ble observert) For å minimere virkningen av dette potensialet "utvasking effekten", anbefaler vi å samle inn hår segmenter proksimale til hodebunnen med en lengde som ikke er større enn 3 cm (forutsatt en gjennomsnittlig vekst på 1 cm / måned 10, en 3 cm segment inneholder CORT som har blitt avsatt over omtrent de siste 3 måneder). For å oppnå dette, bruker en linjal for å måle 3 cm fra det første kuttet og kuttet på nytt for å gi den 3 cm prøven. Merk: Når håret har blitt kuttet til riktig lengde, er det ikke lenger nødvendig å holde trådene i innretting med mindre studien innebærer å kutte prøven i separate 1 cm lange segmenter for å etablere en retrospektiv kalender over CORT nedfall over tidsperioden før prøvetaking 6.
- Plasser hår prøve i en pose laget av aluminiumsfolie, et rent papirkonvolutt, eller en 15 ml skrukork polypropylen sentrifugerør av den type som brukes for prøve vasking. Som CORT er ekstremt stabile i håret 2, kan prøvene lagres på ubestemt tid ved -20 ° C og, om nødvendig, sendes den over natten ved romtemperatur.
- Håret samling prosedyren bør praktiseres på frivillige og praksis prøvene bør veies før du tar fatt på en full undersøkelse. Merk: hårprøver som SMAll som 5 til 10 mg, kan analyseres ved hjelp av metodene som er beskrevet her, selv om det er ønskelig å samle inn prøver> 10 mg for å minimalisere sannsynligheten for å få EIA-avlesninger under den laveste CORT standard.
- Monkey hår
- Barbere håret (100-250 mg) fra nakken ved hjelp av en standard dyr hårklipperen. Barbere så nær huden som mulig, være forsiktig med å nick huden og forårsake blødning fordi blodet CORT nivåene er ekstremt høy sammenlignet med de som finnes i hår. Merk: nakkeområdet ble valgt for rutinemessig prøvetaking, fordi det generelt er en god kilde for håret og kan lett observeres for Veksten før resampling.
- Plasser hår prøve i en pose laget av aluminiumsfolie eller en 15 ml skrukork polypropylen sentrifugerør. Monkey hårprøver skal lagres og sendes på samme måte som beskrevet ovenfor for human hårprøver.
- Fordi ape hår, i motsetning til humant hodehår, vokser til en viss lengde, og deretter stops vokser 11, er det vanligvis ikke gjennomførbart i dette tilfellet å bruke avstand fra huden som en kalender for CORT deponering. Men hvis et dyr kan prøves mer enn en gang (for eksempel under periodiske rutinemessige helse eksamener), er det ønskelig å utføre en innledende barber å sette en baseline tidspunkt og deretter reshave det samme området etter den ønskede tidsperioden er utløpt. CORT i den andre prøven ble avsatt under barbering-reshave intervall, som tillater en presis navngivelse av prøven CORT innhold til HPA aktivitet over at intervallet 5.
2. Sample Vasking og tørking
- Vasking
- Plasser hver hår prøve inn i en 15 ml skrukork polypropylen sentrifugerør.
- Tilsett 5 ml av væskekromatografi med høy ytelse (HPLC)-grade isopropanol til hvert rør etterfulgt av gjentatt snuing i 3 min ved hjelp av et rotasjonsledd.
- Dekanter isopropanol i en avfallsbeholder, idet det cikke å miste noe av prøven.
- Gjenta trinn 2.1.2 og 2.1.3 igjen.
- Tørking
- Tørk håret i minst 2-3 dager for å sikre fullstendig fordampning isopropanol.
Tre. Sample Sliping og Cort Utvinning - Metode 1 for store prøver
- Sample sliping
- Sett opp til 250 mg i tørket hår inn i en 10 ml rustfri stål slipekrukke sammen med en enkelt 12 mm rustfritt stål sliping ball.
- Grind prøven i 6 min ved en hastighet på 25 Hz ved hjelp av en kulemølle.
- Veie opp til 50 mg av pulverisert hår på en analytisk balanse og deretter overføre den til en ren 2,0 ml polypropylen mikrosentrifuge tube for påfølgende CORT utvinning.
- CORT utvinning
- Tilsett 1,0 ml av HPLC-grad av metanol til mikrosentrifugerør inneholdende den pulveriserte prøve.
- Sett lokk på røret og inkuber prøven for 18-24 timer ved romtemperatur med constant inversjon ved hjelp av en rotator.
- Sentrifuger rør ved 14000 opm i 1 min ved romtemperatur for å pelletere den pulveriserte hår.
- Overfør 0,6 ml av supernatanten til en ren 1,5 ml mikro tube, tar seg ikke å forstyrre pelleten av pulverisert hår.
4. Sample Sliping og Cort Utvinning - Metode 2 for små prøver
- Sample sliping
- Plasser opp til 60 mg av håret i en veid på forhånd 2 ml mikro tube forsterket for perle juling.
- Reweigh ampullen for å oppnå prøvevekten.
- Legg tre 3,2 mm krom stål perler til hvert hetteglass og deretter slipe prøven i minst 2 min i en perle beater. Hvis visuell inspeksjon avslører at prøven ikke er tilstrekkelig pulverisert, deretter utføre ekstra sliping for 0,5 eller 1 min. Merk: Ingen overføring av bakken håret er nødvendig i dette tilfelle, fordi CORT ekstraksjon blir utført på samme ampulle som sliping.
- CORT utvinning
- Tilsett 1,5 ml av HPLC-grad av metanol til mikrosentrifugerør inneholdende den pulveriserte prøve.
- Sett lokk på røret og inkuber prøven for 18-24 timer i romtemperatur med konstant inversjon ved hjelp av en rotator.
- Sentrifuger rør ved 10000 rpm i 5 min ved romtemperatur for å pelletere den pulveriserte hår. Merk: krom stål perler forbli i røret med håret under utvinning og sentrifugeringstrinn, som står for den lavere sentrifugehastighet i forhold til metode 1.
- Overfør 1,0 ml av supernatanten til en ren 1,5 ml mikro tube, tar seg ikke å forstyrre pelleten av pulverisert hår.
5. Løsemiddel fordampning og Sample Rekonstituering
- Tørk nedover metanol enten ved hjelp av en vakuumfordamper eller i en strøm av nitrogengass ved en vakuum-fordamper ikke er tilgjengelig. Dersom en vakuumfordamper blir brukt, kan den metanoldamp bli fanget ved hjelpav en kuldefelle eller en kjemisk felle utstyrt med et aktivert trekull patron.
- Etter fjerning av metanol, rekonstituere CORT ekstrakt i et passende volum av EIA analysebuffer (assayfortynning). Hvis relativt høye CORT verdier er forventet, og deretter bruke en buffervolum på 0,4 ml eller mer. Ved forholdsvis lave verdier er forventet, så volumet kan bli redusert til 0,2 ml eller mindre, for å øke følsomheten. Merk: 0,2 ml er tilstrekkelig volum til å kjøre duplikate alikvoter av prøven i det minste to ganger, i tilfelle et omløp av prøven er nødvendig.
- Enten analysen rekonstituert prøven umiddelbart eller fryses det ved -20 ° C for senere analyse. Merk: Hvis den rekonstituerte prøve er frosset, er det viktig å unngå sublimering under fryse perioden etter en endring i prøvevolum vil føre til en falsk CORT verdi når de endelige beregninger utføres.
6. CORT analysen og Data Conversion
- Analysen håret ekstrakter forCORT bruker en høy følsomhet enzymimmunoassay (EIA) kit. Merk: Hvis du bruker en kommersiell spytt CORT EIA kit, følg produsentens anbefalinger som spesifisert i settet innsats bortsett fra at stikkprøvene vil være like porsjoner av hver rekonstituert hår ekstrakt i stedet for spyttprøver.
- Forbered en kvalitetskontroll (QC) hår ekstrakt til bruk i hver analyse.
- Samle en rekke ekstra hårprøver og heller behandle dem individuelt som i trinn 4,1 og 4,2 eller bassenget dem for store utvalgets behandling som i trinn 3,1 og 3,2.
- Fordampe løsemiddel og rekonstituere ekstrakter som i trinn 5,1 og 5,2, deretter basseng de rekonstituerte utdrag fra flere individuelle eller samleprøver.
- Alikvot et passende volum av den samlede rekonstituerte ekstrakt (f.eks 0,10 ml) i individuelle mikrosentrifugerør og fryses for senere bruk.
- Tine og kjøre en QC delmengde i to eksemplarer på hver immunoassay mikro å gi en refeRence CORT verdi for å sjekke kvaliteten på hvert løp.
- En intra-assay variasjonskoeffisient (CV, definert som standard avvik dividert med middelverdien av et sett av utvalgsverdier) kan beregnes ved å analysere 10-12 QC brønner i det samme løp, mens en inter-assay CV kan beregnes ved hjelp av QC-verdier over en gruppe av løyper. Hvis ens mikroplateleser programvare beregner en CV for de dupliserte brønner som representerer hvert hår ekstrakt, deretter en alternativ metode for å bestemme intra-assay CV er å beregne gjennomsnittet av de individuelle CV verdier over hele platen.
- Hvis en hvilken som helst prøve ekstrakt gir en leser som er større enn den høyeste CORT standard i EIA, og deretter en annen alikvot av ekstraktet fortynnes med en passende mengde av analysebuffer og påfølgende EIA-avlesningen korrigert for fortynningsfaktoren. Prøver blir også rutinemessig analyseres på nytt hvis CV for duplikatbrønner er> 10%.
- Fordi CORT EIA Pakkene er laget for å måle CORT vaLues i flytende prøver, slik som spytt eller plasma, må utgangssignalet fra mikroplateleser programvare bli omdannet til mengden av CORT per vektenhet av pulverisert hår. Følgende formel konverterer analysen produksjonen i mikrogram / dl til pg CORT per mg hår:
(A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
hvor A = ug / dl fra assay utgang, B = vekt (i mg) av hår underkastet ekstraksjon, C = vol. (I ml) av metanol tilsatt til den pulveriserte hår, L = vol. (I ml) av metanol utvinnes fra ekstrakten og deretter tørket ned, E = vol. (I ml) av analysebuffer som brukes til å rekonstituere det tørkede ekstrakt, og F = sluttverdi av hår CORT konsentrasjon i pg / mg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser utskriften fra et representativt sett av menneskelige hårprøver (voksen mannlige og kvinnelige forsøkspersoner) behandlet ved hjelp av metode 2 sliping og utvinning. Dataprogrammer ble brukt til å generere data-utgang, og for å passe til en 4-parameter sigmoidal kurve til Cort standarder (figur 2). De mellom-vel CV'er fra denne platen varierte 0,01 til 5,73% med en gjennomsnittlig intra-assay CV på 1,34%. Den inter-assay CV bestemmes ved hjelp av QC verdier fra ni siste menneskelig hår analyser ble 4,41%. De 37 prøvene analysert på denne platen gitt et utvalg av hår CORT verdier 3,1 til 650 pg / mg (median = 10,2 pg / mg; gjennomsnitt ± SD = 36,0 ± 110 pg / mg).
Metode 1 brukes i vårt laboratorium for å behandle hår prøver fra ikke-humane primater og andre store dyr. En representant analysen av voksen rhesus ape hår (for det meste fra kvinner) ga en rekke CORT verdier 50,1 til 102 pg / mg (median = 75,0; gjennomsnitt ± SD= 75,8 ± 14,0 pg / mg). Den gjennomsnittlige intra-assay CV for denne analyse var 2,08%, og den inter-assay CV bestemmes ved hjelp av QC-verdier fra ni siste ape hår assays ble 4,63%.
Figur 1. Programvare-utgang for en representativ menneskehår CORT assay. De duplikate brønner er som følger: S1-S6 - CORT standarder som strekker seg fra 0,012 ug / dl (S6) til 3,0 ug / dl (S1), S7 - 0 CORT brønner; B1 - ikke-spesifikk binding (NSB) brønner som mangler anti-CORT antistoff (programvaren trekker den gjennomsnittlige NSB optisk tetthet [OD] verdi fra alle de andre OD avlesninger automatisk), C1 og C2 - høye og lave CORT kalibratorer fra produsenten, T1 - QC;
T2-T38 - stikkprøvene. Fra C1 til T38, er den øvre verdi i hver celle i matrisen den målte OD verdi e fra den tilsvarende godt, og den nedre verdi i den venstre celle i paret er den CORT verdi i mg / dl beregnet fra den midlere OD-verdien. Merk at prøvene T9 og T31 ga målinger over høyeste CORT standard. Som et resultat ble begge prøvene senere fortynnet 4 ganger i analyse fortynningsmiddel og analyseres på nytt. De reanalysert verdier ble brukt etter korrigering for fortynningsfaktoren. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Standard-kurven av OD-verdier versus log CORT konsentrasjon for det samme menneskehår assay. The R-kvadrat verdi vist i panel A er beregnet godheten av tilpasning av kurven til standarder./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Håret CORT fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor er enkel å utføre, er relativt billig, gjør bruk av lett tilgjengelige kjemikalier, reagenser og utstyr, og krever utstyr som, med ett unntak, er sannsynlig å være tilstede i et typisk analytisk laboratorium. Unntaket er et slipeapparat som for eksempel en kulemølle eller mini-beadbeater. Vi registrerer at enkelte forskningsmiljøer hakke hårprøver i små fragmenter omtrent 1 mm i lengde 12, men basert på våre observasjoner vi anbefaler å utføre sliping i stedet for hakking hvis det er mulig. Et annet område av metodevariasjon i litteraturen omfatter om ikke å vaske håret før CORT ekstraksjon 13, og hvis så, i hvilken vaskebetingelser i bruk. Dersom vasking ikke er utført, så man risikerer muligheten for at den metanolekstrakt vil ikke bare inneholde CORT innarbeidet sakte over uker eller måneder med hårvekst, men også svette-og / eller talg-avledet CORT avsatt nylig påoverflaten av håret. Studier på isbjørnprøver støtter eksistensen av to CORT fraksjoner i håret: en løst-bundet fraksjon flyttbar etter kort isopropanol vask av intakt hår som antagelig representerer i hovedsak overflateforurensing, og en mer tett bundet fraksjon som er tilgjengelig med omfattende metanol utvinning av pulverisert hårprøver 14. Den samme konklusjonen kan trekkes fra den synkende mengder CORT utvunnet fra ape og menneske hår ved gjentatte isopropanol vasking (se innledningen). På den annen side, dersom vaskingen utføres, og valget av oppløsningsmiddel og vaskeforhold, kan ha en betydelig innvirkning på de resulterende CORT verdier. The Society of Hair Testing har gitt retningslinjer for valg av et passende oppløsningsmiddel til å redusere håret hevelse og potensiell oppløst stoff eluering fra det indre av håret matrisen under vaskeprosessen 15. Selv om disse anbefalingene ble utviklet for bruk til narkotikatesting i håret, er de relevant for steroid analyse i tillegg.
Måling CORT i håret i stedet for plasma eller spytt tilbyr en rekke fordeler to. Viktigst, gir denne tilnærmingen en biomarkør av integrerte CORT nivåer over perioder på uker til måneder som er upåvirket av den tiden av dagen når prøvene er samlet eller etter kort stresset eksponering før samlingen. Hair samling er ikke-invasiv, selv om prøvetaking av enkelte dyrearter som rhesusaper eller bjørn kan kreve anesthetization av faget av sikkerhetsmessige grunner. En annen fordel er at CORT er ekstremt stabile i håret, sammenlignet med andre eksempel matriser, som tillater analyse av historiske eller arkiverings eksempler, selv om de har vært lagret ved omgivelsestemperatur i en lang tidsperiode. Endelig har CORT nivåer i menneskelig hår segmenter kuttet på suksessivt større avstand fra hodebunnen noen ganger blitt brukt til å lage en retrospektiv kalender av HPA aktivitet over tid. I slike tilfeller er det særligly viktig å være klar over det tidligere nevnte "utvasking" effekt produsert av gjentatt hårvask. Selv om noen studier har ikke klart å gjenskape denne effekten 8,9, er det verdt å merke seg at i disse studiene prøvene ikke ble vasket før metanolekstraksjon. Denne viktige metodiske forskjellen kan bidra til å forklare hvorfor håret CORT nivåer ikke avta med avstand fra hodebunnen.
Noen begrensninger av håret CORT tilnærmingen bør også nevnes. Først, kan denne tilnærmingen ikke oppdage endringer i døgnrytmen rhythmicity av HPA-aktivitet (som sett i noen deprimerte pasienter) eller oppvåkning CORT respons. Hair CORT nivåer også kanskje ikke oppdage effekten av relativt korte stressfaktorer som har oppstått i løpet av hormonet innlemmelse. Derfor bør denne tilnærmingen være tenkt som komplementær til målinger av spytt og / eller plasma CORT, ikke som en erstatning for slike målinger. For det andre, mens anvendelse av hår CORT skalsannsynligvis være av særlig verdi for forskere interessert i psykososiale og miljømessige stressfaktorer, er det viktig å huske på at forhøyet HPA aktivitet kan forekomme under en rekke forhold, blant annet fysisk trening, metabolske forstyrrelser, og smittsomme sykdommer. Tredje, mens data foreligger fra både mennesker og aper som støtter hypotesen om at håret CORT kommer i hovedsak fra blodet to, denne hypotesen har ennå ikke blitt bevist. Faktisk Ito og medarbeidere 16 har demonstrert eksistensen av en funksjonell HPA-lignende system i microdissected humane hårsekkene opprettholdt i organkultur. I hvilken grad hårsekkene bidra til CORT målt i håret forblir ukjent på denne tiden.
På bare noen få år siden oppstarten som en ny biomarkør av HPA-aksen aktivitet, har håret CORT blitt brukt i en rekke applikasjoner på tvers av en rekke arter. Mange av disse programmene faller innenfor flere store themes sikte på å bestemme hvor lenge tids HPA-aktivitet er relatert til kronisk stress, endokrine lidelser så som Cushings sykdom, eller nevropsykiatriske lidelser som post-traumatisk stresslidelse 2,17-19. Andre studier har brukt hår CORT å undersøke HPA-aksen funksjon i forhold til atferds temperament, normal utvikling, påvirkning av utviklingsmessige faktorer som tidlige barndomserfaringer hos mennesker eller ulike oppdrettsforhold i aper, miljøsikring av viltlevende dyr, og retrospektiv undersøkelse av historiske eller arkivprøver. Arter studert oppdatert med hensyn til håret CORT inkludere mennesker, flere arter av ikke-menneskelige primater (aper, vervet apekatter og bavianer), hunder, katter, storfe, hester og flere arter av bjørn. Det er sannsynlig at bruk av hår CORT å vurdere langsiktig HPA aktivitet, om å undersøke den fysiologiske respons på kronisk stress eller å ta andre eksperimentelle spørsmål, vil fortsette å exPand og som skal anvendes i enda større rekke arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å fortolle.
Acknowledgments
Vi takker Kymberlee O'Brien, Celia Moore, og Edward Tronick (Department of Psychology, University of Massachusetts, Boston) for å gi den menneskelige hårprøver analysert i denne studien, og Stephen Suomi og Amanda Dettmer (Laboratory of Comparative Etologi, NICHD) for gi rhesus ape hårprøver. Initial utvikling og fortsatt bruk av denne metoden har vært støttet av NIH RR11122 til MAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
