Summary
这里，我们描述在一个虚拟现实环境中的行为过程中涉及的小鼠皮质的双光子成像的实验程序。
Abstract
近年来，双光子成像已经成为神经科学中一个宝贵的工具，因为它允许基因鉴定细胞的行为1-6中的活性慢性测量。这里我们描述了执行双光子成像技术在小鼠皮质，而动物导航虚拟现实环境的方法。我们注重的实验程序，是关键的行为动物成像在明亮的虚拟环境的各个方面。过程中出现的这个实验装置，我们这里的地址是关键的问题：尽量减少大脑运动有关的文物，最大限度地减少从虚拟现实投影系统漏光，并尽量减少激光诱导组织损伤。我们也提供来样软件来控制虚拟现实环境，并做瞳孔跟踪。这些程序和资源应该是可能要转换的常规双光子显微镜使用中表现小鼠。
Introduction
钙指标（基因编码的像GCaMP5 7或R-GECO 8，或合成染料像OGB或Fluo4）双光子成像已经成为测量神经元活动的行为小鼠1-6的有力方法。它使数百个细胞的在接近单个动作电位分辨率活动的同时进行测量，最多约800微米的脑表面9,10所示。此外，使用基因编码的钙指标（GECIS）神经元的活性可测慢性5,11,12，和在遗传背景明确细胞类型13。总之，这些方法提供了一定程度的打开了大量的神经元计算的体内研究中新的可能性，时间和空间分辨率。
手术治疗是必要的揭露和标记的小鼠大脑进行成像。细胞使用的是重组腺相关vir区典型地转我们（AAV）系统GECI送货和颅骨窗被植入在注射部位获得的光纤接入到大脑。甲头杆然后被连接到双光子显微镜下颅骨为头部固定。因为大多数的问题，清醒成像产生于准备不稳定，这些步骤的设计和实施是至关重要的。理想的情况是在这里描述的过程应该允许多达几个月后手术慢性成像。
为了在双光子成像使视觉引导的行为，头部固定鼠标坐在一个支持空气球跑步机，它可以用它来浏览虚拟现实环境。鼠标在跑步机上的运动被连接到运动中所显示周围鼠标14,15的环形屏幕上的虚拟环境。行为变量如运动，视觉刺激，而瞳孔的位置可以记录6。
T“>我们描述参与了小鼠探索虚拟现实环境慢性双光子成像的程序解决的关键点是：减少运动伪影，减少漏光，同时记录细胞数量的最大化，并最小化光损伤，我们还提供有关设置空中支持的跑步机，瞳孔跟踪，以及虚拟现实环境的细节。这里所描述的程序，可以用于成像的头部固定的小鼠荧光标记的细胞群中潜在的各种行为范式。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物的程序获得批准，并按照广巴塞尔城市州的兽医部门的指导下进行。
1。硬件和软件设置
- 双光子显微镜的设置：
- 用脉冲红外激光作为照明源（脉冲宽度<120飞秒）。
- 使用一个扫描头8或12 kHz的谐振扫描器和一个标准的振镜注组成：这使40或60赫兹的帧频在750×400像素。高帧速率对于减少脑运动诱发的图像失真的关键。此外，在更高的信号产量快速谐振扫描的结果，降低了光漂白16和光毒性。
- 使用压电高速Z-步进在多个深度依次获取时间交 错图像注：这是可选的，用于提高产量的数据以帧速率为代价。
- 使用时器的机械抑制器，以减少激光照射到组织中。调整抑制器的宽度取决于共振扫描器的振幅注：由于一个谐振扫描器的扫描路径的正弦性质，激光束移动可比慢于扫描周转点。以防止组织在这些转变点处的激光曝光是最大的损害，机械抑制器被引入扫描和管透镜，停止激光束之间的焦平面上。
- 对于数据采集结合使用高速数字化仪（800兆赫）与现场可编程门阵列（FPGA）。 注：FPGA的高通滤波器和分档的PMT信号转换成像素。高通滤波器对在一个带通滤波器的光电倍增管放大结果FPGA和有效的低通滤波器的组合为中心大致围绕所述激光（80兆赫）的重复率。样品FPGA代码是作为一个补充。
- 基于Dombeck和他的同事设计的空气支持的跑步机设置2
- 球保持器连接到使用的至少10mm内径的空气供给管的空气供给线。最大化的球保持器的空气供给口的横截面，并放置足量的主空气供应和球保持器之间注油管的：增加的横截面，空气供给管的长度增加可减少噪音的产生。
- 将聚苯乙烯发泡球（直径20厘米）的定制设计和3D打印的球座。
- 如果行为模式只需要向前（或向后）运动，通过在球的一侧插入一针（ 例如，一个19政皮下注射针）限制球的运动与水平（俯仰轴） 注意：通常动物适应设置更快在此减速旋转模式。
- 球的使用一个或两个光学计算机鼠标的轨道运动检测大约两个运动或所有三个轴，分别注：电脑鼠标最好应与至少干涉成像红外二极管工作。
- 虚拟现实环境设置
- 编写的虚拟现实环境注：根据Panda3D中，一个可以自由使用的游戏引擎的示例环境，是作为一个补充。使用Wings3D，一个开源的3D建模工具生成的虚拟环境中的对象。该示例程序读取的数据采集卡的位置信息，并在虚拟环境中其转换成运动。该代码还执行所需要投影到屏幕上的环形的环境中进行非线性变换。环形屏幕的详细结构已在别处14,17描述。
- 使用LED投影或LED背光电脑屏幕显示的虚拟环境。集成门CIRCUIT为LED的成像过程中注意快速闪烁：在视觉刺激过程中的双光子成像的固有问题是漏光从视觉刺激系统，该系统可以通过屏蔽客观减少始发。然而，从视觉刺激系统漏光可以完全通过投影机的光输出同步到共振扫描器（在未获得的数据）的转机点取消，因为与在成像过程中使用的视觉刺激LED舞台做果蝇 18。这导致视觉上的刺激和数据采集的一种有效的高速交替（参见图2）。闪烁的频率（24千赫）的数量级以上的闪光融合阈订单，高于该闪烁是由动物不再感知。电子电路图该变形的一个商业的LED投影仪如图3所示。
- 小狗金正日跟踪
- 使用基于CMOS摄像机（每秒30帧）为瞳孔位置跟踪。确保相机不包含红外遮挡滤器注：瞳孔是在录音过程中，由于从双光子激发激光通过眼睛离开杂散光的高对比度显示。瞳孔的位置和直径是使用自定义编程软件基于酒谷和伊萨19的设计中提取的实时性。
2。注射遗传钙指示剂和窗口种植体
正在执行的钙指示剂20和颅窗口21的注入的注入如先前有以下补充说明：
- 使用玻璃移液管注入回填病毒溶液并连接到压力喷射系统注入病毒进入感兴趣区域。调整压力取决于吸管内直径一般约70-140毫巴，超过1-2分钟的过程中注入约100 NL病毒解决方案。在低频率（0.05秒的脉冲在2赫兹）递送低体积喷射脉冲应，以防止沿所述吸移管注入期间病毒的溢流被用于注：为了监测注射量，吸液管可被标记在小，立体显微镜下均匀间隔的长度（ 例如 0.5mm）的。在标记之间的弯月面的位移可以被用来估计注射体积。
- 数周后喷射这应导致密标记的细胞的直径为约500微米的大丸剂。在感兴趣的区域GECI表达的功效取决于GECI和子组合的选择，以及对感染性滴度和所用的重组AAV的血清型注：作为代表性的例子，注射AAV2/1-EF1α-GCaMP5与病毒针锋相对8×10 12 GC /毫升到小鼠的结果令人满意表达初级视觉皮层呃在大约两周注射后（ 图1）。
- 头部酒吧不应妨碍鼠标的视野，但应具有足够的刚性，以允许稳定的成像过程中的行为。这通常需要两个连接点上的头杆的任一侧（参见图1）。要牢固附着的头吧颅骨，确保最大化和干性暴露颅骨这里头栏将被连接的区域。此外，用解剖刀或注射器，划伤颅骨创建浅表槽从而增加了表面积的胶合。连接头棒牙科水泥前盖上氰基丙烯酸酯组织粘合剂骨。
3。实验步骤
- 两到三个星期以下病毒注射液，检查颅窗口植入物外延下的清晰度和表现荧光照明。浅表血管清晰可见，轮廓分明的边界是一个很好的指示该窗口植入物适合于成像（参见图1）。
- 测量和调整激光功率低于50毫瓦值的样品。
- 打开气流球形跑步机。
- 在显微镜下头部固定，短暂麻醉动物用异氟醚，以减少压力。将动物变成一个异氟醚麻醉的容器，等到动物停止移动（大约10秒）。取出动物，并立即头部固定在显微镜下。
- 定位的可视显示系统，尽可能接近的动物仍然允许访问的动物。少视觉接触的动物具有与实验者，就越强调的动物将在试验的初始阶段。
- 确保颅窗口植入物是免费的灰尘和污垢。干净的水如果必要的。
- 应用超声清胶为颅窗口和水浸泡的目的之间的液浸介质。这解决了缓慢的图像质量下降的问题，是由于水的蒸发或泄漏，并减轻了需要安装头栏上的锥形装水注：离心机凝胶前使用，以除去所有的气泡，并注意不要产生任何空气应用所述凝胶的过程中的气泡。气泡会严重降低图像质量。
- 换了一块黑色胶带围绕目标和头部酒吧遮光。
- 移动虚拟环境的舞台到其最终位置，并调整摄像机的瞳孔跟踪。
- 设置激光阻断，以匹配在实验过程中所用的扫描幅度。
- 开始记录数据。
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Representative Results
在标有GECI细胞群的双光子钙成像的图像质量在很大程度上依赖于颅窗口植入物的质量。二周后病毒注射颅窗口应检查清楚。不应该有肉芽组织或骨再生长可见（ 图1A）。此外，浅表血管的图案应该保持不变和脉管系统的边界应当清晰明确。在同一时间，GECI表达也可以进行检查。标记细胞勃利应该是清晰可见的落射荧光显微镜（ 图1B）下。
理想的情况是制备足够使得诱导的小鼠的运动的双光子图像的失真是不可见的图像中的帧登记（ 图2）后保持稳定。共振扫描器的扫描路径是正弦导致非线性图像失真。在TUrnaround点的数据不会因图像拉伸在这部分的扫描路径的收购。如果上述视觉刺激系统，投影机的位置的LED的光源，被正确定时到周转点，漏光应该只在这段时间（ 图2）是显而易见的。光源的闪烁频率必须在扫描频率的两倍。关键是使这项工作是快速上升和下降的指示灯和控制电子元件（ 图3）倍。
图1：在头部固定鼠标手术两周后颅窗的顶视图。 （A）该头杆被优化的重量和形状，以增加稳定性，在成像实验行为，同时减少对动物的负担。 Ŧ他头杆由铝制成，并具有厚度为1毫米。比例尺为5mm（B）GCaMP5表达后约80 NL 4注射剂（AAV2/1-EF1α-GCaMP5）落射荧光图像。注入深度大约为400微米。比例尺为1毫米。头吧（C）示意图。在mm所有的测量。 点击这里查看大图。
图2。通过减少光泄漏改善信号噪声。在虚拟现实环境的投影机的LED光源被同步到共振扫描器仅在扫描周转周期时数据不记录（橙色博来打开XES）。激光阻断从显微镜在这个例子中去除以示出的光泄漏从视觉刺激而产生的效果。图像（平均数据为8秒）拍摄于小鼠视觉皮层转AAV2/1-EF1α-GCaMP5。 点击这里查看大图。
电子设备的图3。电路图用于闪烁常规LED投影仪。该门电路是由一个TTL输入驱动至与谐振扫描器同步快速闪烁。 C1：电容1nF的; D1，D2：二极管1N4148; INV1：变频器HEF40106（1 6使用）; LED1 - 在投影仪的LED，R1：电阻47Ω，R2：电阻为2.2kΩ，R3：重sistor 100Ω; T1，T5，T6，T7：晶体管IF9321，T2：晶体管BC846; T3：晶体管BC170; T4：晶体管BC856。请注意，该电路必须重复所有三个颜色通道的投影机（绿，蓝红，） 点击此处查看大图。
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Discussion
的关键行为的双光子成像的成功是制备在两个方面的稳定性：
- 以上的天交窗口植入的过程中，组织的炎症反应可以导致增强肉芽组织和软骨会阻碍或什至阻止成像的形成。
- 在实验过程中的大脑有足够稳定，以防止运动伪影败坏神经活动相关的荧光信号。
为了保持到最低限度颅窗口植入术中应尽可能快地和直接向脑损伤进行了炎症免疫反应，应不惜一切代价避免。极为重要的是要确保颅窗口种植体保持气密的实验，以防止炎症的整个持续时间。
为了尽量减少大脑运动相关的成像伪影小心不要损坏或在手术过程中去除硬脑膜。其余的运动引起的脑运动可以当运动被限制在平行于成像平面（X / Y平面）的平面为被校正。运动中的x / y的最大容许标准差大约是5微米。对于沿z轴运动这个值大约是1微米，使得运动程度小于显微镜的分辨率极限以下。
共振扫描仪在扫描路径转变点的低速可导致激光诱导组织损伤。为了防止这种情况，激光器可以在周转使用在扫描望远镜一抑制器阻塞。如果该抑制器的设置是否正确，并根据客观的平均激光功率保持在低于50毫瓦，成像是可能的时间多天长时间，而不会造成任何可见的激光损伤。一种替代方法，以激光的机械消隐是使用快速普克尔盒，从而降低激光器功率的turnarouNDS。然而，该方法具有该普克尔盒通常会引入不希望的光束畸变的缺点。
头部固定啮齿动物的资质来浏览虚拟环境已经使人们有可能长期的细胞图像种群进行了广泛的行为任务3,4,6,22小鼠的皮质。然而，值得注意的是头部固定固有限制在一个球形的跑步机上的行为和运动在许多方面不等同于奔放的运动或正常的行为。
在未来，这里描述的虚拟现实成像方法的强度将可能是钙成像的有针对性的光遗传学刺激行为过程中的结合。与此有可能以光学操纵突触前细胞和图像的突触后的目标，同时监控所得到的行为变化。此外，作为钙指标自如的CEL内扩散升，这也将是可能的行为过程中选择性地测量在亚细胞区室的活性。由于运动引起的脑运动，例如录音已由以获得稳定的录音难度的限制。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由弗里德里希·米歇尔生物医学研究所，马普学会，和人类前沿科学计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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