Summary
We hebben een nieuwe en reproduceerbare techniek om primaire culturen van pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC) isoleren van muizen zo jong als P7 ontwikkeld, waardoor een betere studie van de signaalwegen betrokken bij neonatale gladde spiercellen samentrekken en ontspannen mogelijk.
Abstract
Pulmonale hypertensie is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij zuigelingen. Historisch gezien, is er sprake van aanzienlijke studie van de signaalwegen betrokken bij vasculaire gladde spiercontractie in PASMC uit foetaal schapen. Terwijl schapen een uitstekende model duur pulmonale hypertensie, ze zijn erg duur en niet de voordelen van genetische manipulatie in muizen. Omgekeerd, het onvermogen om PASMC isoleren van muizen was een belangrijke beperking van dit systeem. Hier beschrijven we de isolatie van primaire kweken van muizen PASMC van P7, P14 en P21 muizen met een variant van de eerder beschreven techniek van Marshall et al.. 26 die eerder werd gebruikt voor rat PASMC isoleren. Deze muizen PASMC vormen een nieuw instrument voor de studie van signaalwegen in de neonatale periode. Kort, een suspensie van 0,5% (w / v) agarose + 0,5% ijzerdeeltjes in M199 medium wordt toegediend in de pulmonale vasculaire bed via de rechter ventrikel (RV). Deijzerdeeltjes zijn 0,2 micrometer in doorsnede en kan niet door de pulmonale capillaire bed. Zo is het ijzer lodges in de kleine longslagaders (PA). De longen worden opgeblazen met agarose, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden naar beneden getrokken met een magneet. Na collagenase (80 U / ml) behandeld en na dissociatie, worden de kolven op een weefselkweekschaal in M199 medium met 20% foetaal bovine serum (FBS) en antibiotica (M199 complete media) gebracht celmigratie doorlaat tot de kweekschaal . Deze eerste plaat van cellen is een 50-50 mengsel van fibroblasten en PASMC. Aldus wordt de pull down procedure meerdere malen herhaald om een meer pure PASMC bevolking te bereiken en verwijder eventueel resterende ijzer. Gladde spiercellen identiteit wordt bevestigd door immunokleuring voor gladde spieren myosine en desmine.
Introduction
Pulmonale hypertensie is normaal tijdens intrauterine leven omdat de placenta fungeert als het belangrijkste orgaan van gasuitwisseling en slechts 10% van het hartminuutvolume wordt gecirculeerd door de pulmonaire vasculaire bed. In utero, pulmonale drukken zijn vergelijkbaar met systemische druk vanwege verhoogde pulmonale vaatweerstand . Als zwangerschap vordert, is er een snelle groei van de kleine PA binnen de longen, de voorbereiding van de foetus voor de dramatische stijging van de doorbloeding van de longen die optreedt bij de geboorte 1. Wanneer de normale perinatale overgang faalt in korte termijn en voldragen kinderen, het resultaat is persisterende pulmonale hypertensie van de pasgeborene (PPHN). PPHN is een klinisch syndroom dat wordt veroorzaakt door verschillende onderliggende pathologie. Echter, al deze kinderen hebben gemeenschappelijke pathofysiologische kenmerken, zoals verhoogde pulmonale vaatweerstand, hypoxemie, en rechts-naar-links-shunting van de bloedstroom in heel hardnekkige foetale verbindingen zoals de ductus arteriosus of vooramen ovale. PPHN beïnvloedt 2-6 per 1000 levendgeborenen en brengt een 8-10% risico op sterfte en aanzienlijke korte termijn en lange termijn morbiditeit 2. Bovendien kunnen zeer laag geboortegewicht prematuren pulmonale hypertensie ontwikkelen als gevolg van de onderliggende longaandoening. De meest voorkomende onderliggende longaandoening bij prematuren is bronchopulmonale dysplasie (BPD). Terwijl het totale risico op BPD correleert met de zwangerschapsduur en geboortegewicht, blijft het onduidelijk waarom een subset van deze kinderen ontwikkelt significante pulmonale hypertensie en hoe adequaat te behandelen deze zuigelingen. Slechte resultaten, met inbegrip van langdurige ziekenhuis verblijven en verhoogde mortaliteit, komen vaak voor 3-6.
Historisch gezien hebben schapen foetale PASMC of varkens foetale PASMC van gezonde dieren die zijn gebruikt om de signaalwegen betrokken bij de normale longvaten overgang na de geboorte te bestuderen. Deze zijn meestal geïsoleerd van de vijfde generatie weerstand PA van eenn schapen of varkens foetus die wordt geleverd en gedood vóór elke spontane ademhaling 7-9. Daarnaast hebben sommige onderzoekers geïsoleerd en gebruikt PASMC van iets oudere en spontaan ademende lammeren en biggen op 3 dagen, 2 weken, en 4 weken 10-12. Meer recent, hebben sommige groepen met succes geïsoleerd en gebruikt PASMC geïsoleerd van lammeren met PPHN aan de derangements onderzoeken signaalwegen in de ziekte staat 13-17. Deze cellen hebben bewezen een waardevol instrument om te onderzoeken welke signaalwegen zijn cruciaal in zowel de normale en zieke op korte termijn en de termijn longvaatbed zijn. Echter, hebben ze geen inzicht geven in de signaalwegen beïnvloed bij prematuren met pulmonale hypertensie. Ook maken zij de mogelijkheden van genetische manipulatie gezien in muismodellen van ziekte.
Rat en muis modellen zijn al lange tijd gebruikt om het model BPD en meer recentelijk worden gebruikt om het model pulmonale hypertension gevolg van BPD 18-22. Neonatale ratten zijn verleidelijk om mee te werken als gevolg van hun grotere omvang, maar ze ook last hebben van een gebrek aan mogelijkheden voor genetische modificatie. Genetisch gemodificeerde dieren zijn uitgebreid gebruikt om de effecten van bepaalde gendoelstellingen in gehele dierlijke fysiologie bij neonatale muizen te onderzoeken, maar tot nu toe niemand eerder succesvol geïsoleerd PASMC Uit deze muizen. Door het isoleren PASMC kan meer informatie worden verkregen over routes veranderen als reactie op prikkels uit de omgeving en / of genetische modificatie specifiek in de longslagader gladde spieren. Daarnaast kan levend PASMC worden afgebeeld in real time om snelle veranderingen in belangrijke signaalmoleculen zoals calcium en zuurstofradicalen 23-25 te onderzoeken. We hebben onlangs beschreven succesvolle isolatie van PASMC van volwassen muizen met een variant van de techniek van Marshall et al.. 26 gebruikt voor het isoleren rat PASMC 23,25,26. We hebben nu een aangepastnd uitgebreid deze techniek om kleine muizen 7-21 dagen leeftijd (P7, P14 en P21). De belangrijkste beperking van deze nieuwe PASMC isolatietechniek is dat het meerdere muizen voldoende cellen voor experimenten genereren en dat de cellen groeien zeer langzaam, die kenmerkend primaire gladde spiercellen. Ondanks deze beperkingen, geloven wij deze techniek neonatale muis PASMC isolaat zal voor de versterkte onderzoek van de belangrijkste signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van longhypertensie en vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in dit gebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd dit protocol.
1. Longslagader Isolatie van neonatale muizen - Day One
- Bereid de complete M199 media - Mix 400 ml M199 met 100 ml (eindconcentratie = 20%) warmte geïnactiveerd FBS en 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomycine.
- Bereid de Serum Gratis M199 Media - Mix 500 ml M199 met 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomycine.
- Bereid de PA Agarose - Mix 0,05 g agarose plus 0,05 g ijzerdeeltjes in 10 ml steriel, serum-vrij M199 media.
- Bereid de Lung Agarose - Mix 0,1 g agarose in 10 ml steriel, serum-vrij M199 media.
- Bereid de collagenase - Mix collagenase in steriele, serumvrije media M199 bij een uiteindelijke concentratie van 80 U / ml en vervolgens steriel filter dit mengsel. Set-up van al het van tevoren apparatuur voordat euthanizing de muis.
- Stel PA agarose en longen agarose naar rechts koken alvorens euthanizing de muis.
- Euthanaseren de muis in het verdovingsmiddel pot met isofluraan overdosis en wees voorzichtig met de muis pup in contact te komen met de isofluraan niet toe te staan. De beste cel opbrengst wordt verkregen wanneer de cellen onmiddellijk na de dood worden geoogst om micro-stolsels vormen die in het verkeer na dood te voorkomen.
- Verwijder de muis uit de narcose pot, zet de muis om het operationele bestuur, en steriliseer de muis, instrumenten, en handschoenen met alcohol.
- Laad de scalpel met het blad en incise de muis van de nek tot de inferieure buik.
- Open de buik aan de linkerkant van de muis, bloot de nieren, en snijd de nierslagader om de muis te exsanguinate, waardoor stolsels te voorkomen in de kleine bloedvaten van de longen.
- Gebruik een schaar om langs de linkerkant van de muis te snijdenhet borstbeen aan de borstkas te openen.
- Zorgvuldig gebruik scalpel om het diafragma aan beide kanten te snijden en de borstholte volledig open. Gebruik een tang of pennen om de borstholte open te houden.
- Plak de camper met een 27 G ½ inch naald gericht op de PA en perfuseren de RV / PA / longen met steriel PBS tot de longen verschijnen witte (alle bloed gespoeld uit de pulmonale circulatie). Dit duurt ongeveer 3-5 ml PBS duren afhankelijk van de grootte van de muis. Het is belangrijk om eerst te spoelen om stolselvorming in de kleine longvaten te voorkomen.
- Zorgvuldig gebruik van stompe dissectie van de luchtpijp en de draad een hechtdraad eronder bloot te leggen.
- Zet de kleinste tang onder de luchtpijp voor steun en zet het 24 G angiocatheter in de luchtpijp. Plaats de angiocatheter alsof het plaatsen van een IV.
- Beveilig de angiocatheter in de luchtpijp met de hechtdraad geregen in stap 1.16.
- Neem kokend PA agarose uit kokend water, en keer goed te mengen. Koel de agarose tot ongeveer lichaamstemperatuur door wervelende op ijs. De agarose moet in oplossing blijven, maar niet zo warm dat de cellen van de PA beschadigen.
- Plak de camper met een 27 G ½ inch naald en perfuseren de RV / PA / longen met PA agarose totdat de longen worden grijs weergegeven. De ijzerdeeltjes in de agarose mengsel maakt de longen lijken grijs van kleur. Dit duurt ongeveer 3-5 ml agarose PA afhankelijk van de grootte van de muis nemen. Het is ook belangrijk om langzaam gaan als te snel injecteren kan leiden het strijkijzer lekken in de luchtwegen.
- Neem de long agarose uit kokend water en keer goed te mengen. Koel vervolgens de agarose tot ongeveer lichaamstemperatuur door wervelende op ijs. De agarose moet in oplossing blijven, maar niet zo warm dat de cellen van de longen beschadigen.
- Het opstellen van de long agarose en bevestig de spuit om de 24 G angiocatheter in de luchtpijp. Bezielen de agarose via de luchtpijp naar de longen vol lucht. De longen zijn easier om gehakt (zie latere stappen) als de longen op passende wijze worden opgeblazen.
- Verwijder de hart-long blok, en dompel het in 25 ml ijskoude PBS om de agarose (ca. 5 min.) stollen. Gebruik deze tijd om het schoonmaken van de chirurgische gebied.
- Voor neonatale muizen (P7-P21), de beste PASMC opbrengst komt van het combineren 2-3 pups in een batch van cellen. PASMC liever in contact met andere cellen voor optimale cel gezondheid en groei. Als men de muis wordt gebruikt per isolatie, dan de cellen zijn zeer schaars en niet goed groeien. Wanneer ze samen combineren dieren, oogst en chill het hart-long blokken en vervolgens te verplaatsen naar hakken zodra alle hart-long blokken zijn verwijderd uit de dieren.
- Ga naar de celkweek kap voor steriliteit vanaf dit punt verder.
- Plaats de gekoelde longen in de deksel van de 10 cm weefselkweek schotel en het hart, thymus, luchtpijp en eventuele bindweefsel uit de longen verwijder voorzichtig.
- Verplaats de longen naar de bodem van de 10 cm weefselkweekschaalen voeg ongeveer 1 ml ijskoude steriele PBS.
- Hak de longen in zeer kleine stukjes (1-2 mm) met 2 scalpels.
- Breek de tip van een steriele 5 ml serologische pipet. Pipet gehakt long drijfmest in steriele 50 ml conische buis. Met extra steriel ijskoud PBS wassen van de plaat te verzekeren dat alle longweefsel krijgt in de 50 ml conische buis.
- Plaats de ml conische buis 50 op de magneet. Wacht tot de ijzer bevattende weefsel om naar opzij van de buis naast de magneet. Afhankelijk van de verhouding van ijzer-bevattende vaartuig longweefsel, sommige vaten kunnen nog te zweven op dit punt. Aspireren van de PBS langzaam en voorzichtig proberen niet te drijven longweefsel te zuigen omdat het onduidelijk is wanneer het schepen bevat.
- Was de pellet long 3x met 5 ml steriel PBS, opnieuw proberen de hoeveelheid longweefsel dat is opgezogen minimaliseren.
- Resuspendeer de pellet in long 3 ml collagenase en giet in 60 mm weefselkweekplaat. Nietprobeer deze pipet, de longen brokken zal vasthouden aan het interieur van uw pipet.
- Met nog 3 ml op de buis na het gieten spoelen en giet dit in 60 mm weefselkweekplaat ook.
- Plaats in de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
- Pipet weefsel + collagenase drijfmest op en neer met een 15 G stompe naald op een 5 ml spuit totdat alle grote long stukken worden verstoord. Het weefsel + collagenase drijfmest zal op dit punt helder zijn, zonder zichtbare weefsel brokken.
- Giet in een nieuwe steriele 50 ml conische buis en hechten aan de magneet.
- Was de weefselkweekschaal met ongeveer 5 ml compleet M199 media te verzekeren dat al het weefsel is verzameld en giet dit in de conische buis.
- Aspireren van de collagenase + media supernatant. Deze keer zullen er zeer weinig floaters, en een compacte ijzerhoudende pellet zal zijn aan de kant van de conische buis naast de magneet.
- Was met 5 ml compleet media 3x. Dit is nodig om de collagenase inactiveren.
- Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
- Giet de geresuspendeerde pellet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop, zullen er kleine fragmenten vat circuleren met ijzerdeeltjes in het vat lumen.
- Plaats de weefselkweek schotel (gelabeld plaat nul) in de weefselkweek incubator 's nachts. De eerste cellen af te migreren naar bord nul zijn ongeveer 50% fibroblasten en 50% PASMC, gebaseerd op kleuring voor gladde spieren markers. Deze plaat heet plated nul en uiteindelijk weggegooid na de daaropvolgende verrijking stappen.
2. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Day Two
- Giet de media supernatant van plaat nul in een schone 50 ml conische buis.
- Aspireren uit de media supernatant. Deze keer zullen er bijna geen floaters, en een compacte ijzer-containing pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
- Was met 5 ml volledige media 3x.
- Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
- Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal een plaat (Figuur 1A).
- Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.
3. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Day Six
- Giet de media supernatant van de plaat een in een schone 50 ml conische buis. Herhalen van deze stap meerdere keren verzekert dat alle gladde spiercellen in de wand van het vat verblijven de gelegenheid af migreren op een celcultuurplaat. Er is een afnemende rendement bij elke stap dwz elke plaat zal minder en minder cellen hechten.
- Aspireren uit de media supernatant. Deze keer wordt bijna geen floaters en een compacte ijzer bevattende pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
- Was met 5 ml volledige media 3x.
- Voeg 3 ml compleet medium, en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
- Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal plaat twee.
- Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.
4. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Negen
- Giet de media supernatant uit de weefselkweek schotel plaat twee in een schone 50 ml conische buis.
- Opnieuw invoeren plaat twee met volledige M199 media, en plaats terug in de weefselkweekincubator.
- Aspireren uit de media supernatant. Deze keer wordt bijna geen floaters en een compacte ijzer bevattende pellet wordt gevormd op de zijde van de conische buis naast de magneet.
- Was met 5 ml volledige media 3x.
- Voeg 3 ml van complete media en meng op en neer een paar keer om resuspendeer de ijzerhoudende pellet.
- Giet in een 35 mm weefselkweek schotel. Met behulp van een microscoop worden kleine vaartuigen fragmenten zweven rond met ijzerdeeltjes in het vat lumen gezien. Dit zal plaat drie.
- Plaats de weefselkweek schotel in de weefselkweek incubator.
5. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Dertien
- Verstuif de media af van de platen 1-3.
- Voorzichtig wassen van de cellen met warme, steriele PBS.
- Voeg een dunne film van trypsine (~ 0,25-0,5 ml) trypsine aan elke plaat te trypsinize uit cellen. Cellen zijn zeer hechtend en moeten in trypsine bevattende weefsel culture incubator voor ongeveer 10 min op te heffen van de plaat.
- Oogst cellen van de platen in 5 ml volledige media in een 50 ml conische buis bevestigd aan de magneet te trekken uit eventueel resterende ijzerdeeltjes.
- Was beide platen met een extra 0,5 ml compleet medium en toevoegen dat media om de 50 ml conische buis.
- Deze keer, neem de media supernatant (niet aspireren), en gooi de ijzerdeeltje pellet.
- Plaat de cellen in 5 ml compleet medium M199 in een 60 mm schaal tot confluente cellen in een paar dagen. Als alternatief, het bord van de cellen in 10 ml compleet M199 media in een 10 cm plaat, en PASMC zal nog ongeveer 1-2 weken duren tot confluentie bereiken.
6. Longslagader Isolatie van Neonatale Mice - Dag Veertien
- Verander de media om verse volledige M199 media om eventueel resterende trypsine te verwijderen. Er zal een dunne bevolking van PASMC op de weefselkweek schotel (Figuur 1B) zijn.
7. Routine Care
- Verander de media om verse volledige M199 media ongeveer 2x per week.
- Bij het splitsen van deze cellen, ongeveer 10 min in de incubator in een film van trypsine (0,25-0,5 ml) vereist voor de cellen op te heffen van de plaat. Met behulp van de trypsine film laat opnieuw platen van de PASMC zonder stoppen met draaien van de cellen. Als teveel trypsine wordt gebruikt, de PASMC worden gecentrifugeerd te spinnen de trypsine of de cellen niet readhere de plaat. Soms, nadat de cellen af te draaien, is het moeilijk om de PASMC geresuspendeerd in compleet medium M199 krijgen.
- In observaties, de geïsoleerde PASMC gedragen als gladde spiercellen betrouwbaar voor 4-5 passages, maar de geïsoleerde cellen zal vlek voor gladde spiercellen markers tot passage 7. Tel de eerste gepoolde 60 mm of 10 cm plaat op dag dertien als doorgang 2 (plating na de eerste blootstelling aan trypsine).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens en na isolatie, zijn PASMC onderzocht zowel met lichtmicroscopie en door immunokleuring voor gladde spiercellen markers. Met lichtmicroscopie in het begin van het protocol, worden PASMC gezien migreren naar de weefselkweek schotel uit de kleine ijzeren opslagvaten (Figuur 1A). Na pooling platen een tot drie op dag dertien, dan ijzerdeeltjes zijn niet langer gezien als die zijn uitgevoerd in de laatste pooling stap getrokken. In plaats daarvan, een populatie van PASMC wordt gezien op de weefselkweek schotel (Figuur 1B).
Gebaseerd op immunokleuring, de eerste cellen die migreren uit de ijzerhoudende schepen ongeveer 50% en 50% fibroblasten PASMC (gegevens niet getoond). Aangezien fibroblasten hebben een aanzienlijke groei voordeel, de fibroblasten zal na verloop van tijd overwoekeren de PASMC op plaat nul. Om deze reden, wordt plaat nul weggegooid zodra er duidelijk geïsoleerd PASMC op de latere platen. Na pooling, de bevolkingvan PASMC is> 90% PASMC die positieve kleuring voor zowel α-gladde spieren myosine en desmine (figuur 2). Als afgebeeld in 20X, worden meerdere spoelvormige cellen waargenomen overeenstemming met een gladde spiercellen fenotype (Figuur 2A). Als afgebeeld bij een grotere vergroting (40x), de lamellopodia van de voorrand van afzonderlijke cellen gevisualiseerd als ze migreren en groeien naar andere gladde spiercellen op de schotel (Figuur 2B).
Fosfodiësterase 5 (PDE5) wordt uitgedrukt in PASMC en cGMP hydrolyseert, een belangrijke mediator van de vasculaire tonus, in inactieve GMP. Afname van PDE5 speelt een cruciale rol in de normale pulmonaire vasculaire overgang na de geboorte. In grote diermodellen, is PDE5 ontwikkelingsgereguleerde over zwangerschap, en zijn expressie en activiteit dalen dramatisch na de geboorte 27. Om te bevestigen dat deze geïsoleerde PASMC behouden van een fenotype in overeenstemming met hun ontwikkelingsfase, onderzochten we PDE5 enzyme activiteit in muizen PASMC geïsoleerd uit P7, P14 en P21 muizen, en volwassen muizen. We zien de hoogste niveaus van PDE5 activiteit in de PASMC geïsoleerd van P7 muizen. Deze niveaus vallen in het PASMC geïsoleerd van P14 en P21 muizen. Het laagste niveau van PDE5 activiteit worden vermeld in de PASMC geïsoleerd uit volwassen muizen (Figuur 3).
Figuur 1. Neonatale PASMC gevisualiseerd door lichtmicroscopie. PASMC worden gevisualiseerd met behulp van een lichtmicroscoop bij 20X. A) Op dag drie van het protocol, kan spoelvormige PASMC worden gezien migreren van de zwarte ijzeren gevulde kleine PA op de weefselkweek schotel. B) Op dag veertien na pooling kan een populatie van PASMC zichtbaar op de weefselkweekschaal.
Figuur 2. Neonatale PASMC Stain Positief voor Smooth Muscle Markers. PASMC werden uitgeplaat op collageen behandelde dekglaasjes, in 4% formaldehyde gefixeerd, en gepermeabiliseerd met 0,2% Triton-X zoals eerder beschreven 7,23. A) PASMC uit P7, P14 en P21 muizen werden gekleurd met anti-desmine (1:200 verdunning) of anti-gladde spier myosine (1:2000 verdunning) in 5% BSA, gevolgd door rhodamine red-anti-konijn secundair bij een 1:200 verdunning. Fluorescentie werd zichtbaar gemaakt met een epifluorescentie microscoop bij 20X. B) PASMC van P14 en P21 muizen werden gekleurd met anti-gladde spier myosine of desmine als hierboven en fluorescentie werd zoals boven in de 40X gevisualiseerd.
Figuur 3. Fosfodiësterase 5 (PDE5) activiteit isOntwikkeling gereguleerd in PASMC. PASMC werden geoogst voor totaal eiwit en getest op PDE5 enzymatische activiteit zoals eerder beschreven met behulp van een commercieel verkrijgbare colorimetrische cyclisch nucleotide fosfodiësterase testkit 7. Elk monster werd gelezen ± sildenafil (100 nM). Het verschil tussen de pmol cGMP gehydrolyseerd per mg totaal eiwit per minuut ± sildenafil vertegenwoordigt de PDE5-specifieke cGMP-hydrolytische activiteit. N = 4 voor P7 PASMC, n = 10 voor P14 PASMC, n = 4 voor P21 PASMC en n = 8 voor volwassen PASMC. * P <0,05 versus P7 PASMC, # p <0,05 versus P14 PASMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we voor het eerst de isolatie van PASMC van muizen op P7, P14 en P21. Om dit te bereiken, wordt een suspensie van agarose en 0,2 uM ijzerdeeltjes toegediend langs de RV in de PA. Vanwege de kleine omvang van de ijzerdeeltjes, kunnen ze niet door de pulmonale capillaire bed en zijn dus afgezet in de kleine PA. De longen worden opgeblazen, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden getrokken uit de oplossing met behulp van een magneet. Uiteindelijk worden de schepen uitgeplaat in een weefselkweek schotel, en cellen migreren van het schip en op de cultuur plaat. De eerste plaat van cellen is een mengsel van fibroblasten en PASMC, en de pull down procedure wordt meerdere malen herhaald om een verrijkte PASMC bevolking af te leiden. Bij langdurige blootstelling aan hoge niveaus, is er een theoretisch risico dat restijzer de redox evenwicht binnen de geïsoleerde cellen kunnen beïnvloeden. Zo wordt zorg besteed aan de laatste stap om alle resterende ijzer te verwijderenvoorafgaand aan het bundelen en uitdragen van de cellen. Immunokleuring voor α-gladde spieren myosine en desmine is gedaan om te bevestigen dat de verrijkte populatie is> 90% PASMC. Deze cellen hebben PDE5 enzymatische activiteit, in overeenstemming met een vasculaire gladde spiercel fenotype. Interessant is dat de PDE5 enzymactiviteit is anders in PASMC geïsoleerd uit muizen van verschillende leeftijden, wat suggereert voortdurende ontwikkeling voorschrift in de PASMC na isolatie.
Hoewel deze techniek is intellectueel zeer eenvoudig, een veel voorkomend probleem is lage opbrengst van PASMC. Er kunnen meerdere redenen voor dit probleem, zelfs als 2-3 muizen elkaar samengevoegd. Eerst wordt de beste celopbrengst bereikt als de isolatie procedure onmiddellijk wordt gestart na de muis bezwijkt aan de isofluraan overdosis. Zodra de dood is ingetreden, micro-stolsels vormen de gehele vaatbed. Deze stolsels in de longvaten wordt voorkomen dat de ijzeren deeltjes uit om in zoveel kleine PA, waardoor devouwen de opbrengst. Ook de levensvatbaarheid van de geïsoleerde PASMC wordt zorgwekkender langer de muis dood voor isolatie. De absolute belangrijkste stap die PASMC opbrengst beïnvloedt is de ijzer-infuus. Indien de longen niet merkbaar grijs na de infusie ijzer, de mogelijke redenen: 1) het strijkijzer gaat retrograde in het rechter atrium en de lever, 2) er gat of scheur in de RV, of 3) er micro-stolsels in de pulmonale circulatie ergens verhinderen goede ijzer infuus. Tenslotte hebben we gemerkt dat PASMC geïsoleerd uit verschillende genetisch gemodificeerde stammen van muizen vertonen opvallend verschillende groeicijfers in de cultuur na isolatie. Daarom, wanneer de eerste poging deze techniek, is het het beste om een wild-type stam van muizen gebruikt.
Uiteraard verontreiniging een zorg altijd men isoleren van cellen uit een geheel dier. Alle instrumenten worden gesteriliseerd en afgeveegd met alcohol voorafgaand aan de procedure, en dan een keer de hart-long blok wordt verwijderd, all van de volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap met steriele techniek. Met behulp van deze voorzorgsmaatregelen in combinatie met antibiotica-bevattende media is vrijwel elke vorm van verontreiniging geëlimineerd.
Met de isolatie van alle primaire cellijn, is er een bezorgdheid over hoe lang een cel zal haar fenotype in de cultuur te behouden. Schapen FPASMC geïsoleerd van controle en PPHN lammeren behouden hun gladde spier fenotype voor 8 en 5 passages, respectievelijk 7,14. Voor de muis PASMC, de cellen beginnen te verliezen signalerende responsen door passage 5 en gladde spieren merkers passage 7 (gegevens niet getoond). Dit wijst op een van de beperkingen van deze techniek. Meerdere muizen moeten kleine hoeveelheden cellen te bereiken en de tijd van isolatie voldoende cellen voor experimenten lang, 2-4 weken, afhankelijk van het aantal cellen nodig. Ten slotte, wanneer cellen worden geïsoleerd, men heeft slechts drie passages te werken met hen voordat ze hun gladde spiercellen signalering verliezenantwoorden. Een potentiële ruimte voor verbetering zou een werkwijze waarbij deze cellen kunnen worden ingevroren en met succes hersteld van vloeibare stikstof ontwikkelen. Dit zou een lab regelmatig maken en te bevriezen cellen muizen beschikbaar, en onderzoekers kunnen ontdooien en gebruik maken van de cellen voor experimenten nodig.
Ondanks de technische uitdaging van het uitvoeren van de isolatie en de lange tijdlijn voor isolatie, die PASMC vormen een nieuw en waardevol instrument voor de studie van signaaltransductiewegen in ontwikkelingslanden murine pulmonale vasculatuur. Wij geloven dat deze techniek neonatale muis PASMC isolaat zal voor de versterkte onderzoek van de belangrijkste signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van pulmonaire hypertensie, wat zal leiden tot een beter begrip van de pathogenese en zorgen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH HL109478 (KNF). De auteurs erkennen en dank Gina Kim en Joann Taylor voor hun hulp bij het isoleren en het handhaven van de PASMC in de cultuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
