Isolering af pulmonal glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Summary

Vi har udviklet en ny og reproducerbar teknik til at isolere primære kulturer af pulmonale arterie glatte muskelceller (PASMC) fra mus som unge som P7, hvorved bedre undersøgelse af de signalveje, der er involveret i neonatal glatte muskelceller sammentrækning og afslapning.

Abstract

Pulmonal hypertension er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed hos spædbørn. Historisk har der været en betydelig undersøgelse af signalveje, der er involveret i den vaskulære glatte muskelsammentrækning i PASMC fra føtal får. Mens fårene foretage et glimrende model af udtrykket pulmonal hypertension, de er meget dyre og mangler fordelen af ​​genmanipulation fundet i mus. Omvendt, manglende evne til at isolere PASMC fra mus var en betydelig begrænsning af dette system. Her beskrev vi isolering af primære kulturer af muse PASMC fra P7, P14, P21 og mus ved hjælp af en variation af den tidligere beskrevne teknik Marshall et al. ^26. som tidligere blev brugt til at isolere rotte PASMC. Disse murine PASMC udgøre en ny redskab for studiet af signalveje i den neonatale periode. Kort fortalt, en opslæmning af 0,5% (w / v) agarose + 0,5% jernpartikler i M199 medier er infunderes i pulmonale vaskulære leje via den højre ventrikel (RV). Denjernpartikler er 0,2 um i diameter og kan ikke passere gennem den pulmonale kapillarleje. Således jern indgiver i de små pulmonale arterier (PA). Lungerne er oppustet med agarose, fjernet og dissocieret. De jern-holdige skibe er trukket ned med en magnet. Efter collagenase (80 U / ml) behandling og yderligere dissociation, er de fartøjer, sat ind i en vævskulturskål i M199 medium indeholdende 20% føtalt bovint serum (FBS), og antibiotika (M199 komplette medier) for at tillade cellemigrering på dyrkningsskålen . Denne indledende plade af celler er en 50-50 blanding af fibroblaster og PASMC. Således er pull down procedure gentages flere gange for at opnå en mere ren PASMC befolkning og fjerne eventuel overskydende jern. Glatte muskelceller identitet bekræftes ved immunfarvning for glat muskulatur myosin og desmin.

Introduction

Pulmonal hypertension er normalt under intrauterin liv siden moderkagen fungerer som den vigtigste organ gasudveksling og kun 10% af minutvolumen cirkuleres gennem den pulmonale vaskulære leje. I livmoderen, er pulmonale pres ligner systemiske pres på grund af forhøjet pulmonal vaskulær modstand . Som drægtighed skrider frem, er der hurtige vækst i den lille PA i lungen, fremstilling fosteret til den dramatiske stigning i pulmonal blodgennemstrømning, der forekommer ved fødslen ^1. Når den normale perinatal overgang fejler i kortsigtede og fuld sigt spædbørn, resultatet er vedvarende pulmonal hypertension hos nyfødte (PPHN). PPHN er en klinisk syndrom forårsaget af mange forskellige underliggende patologier. Men alle disse børn deler fælles patofysiologiske funktioner såsom forhøjet pulmonal vaskulær modstand, hypoxæmi, og højre-til-venstre shunt af blodgennemstrømningen tværs vedvarende føtale tilslutninger som ductus arteriosus elleramen ovale. PPHN påvirker 2-6 per 1.000 levendefødte, og formidler en 8-10% risiko for dødelighed samt betydelige kortsigtede og langsigtede sygelighed ^2.. Derudover kan meget lav fødselsvægt præmature spædbørn udvikle pulmonal hypertension som et resultat af deres underliggende lungesygdom. De mest almindelige underliggende lungesygdom af for tidligt fødte børn er bronkopulmonal dysplasi (BPD). Mens den samlede risiko for BPD korrelerer med gestationsalder og fødselsvægt, er det fortsat uklart, hvorfor en del af disse spædbørn udvikler betydelig pulmonal hypertension og hvordan man korrekt behandling af disse spædbørn. Dårlige resultater, herunder langvarige hospitalsophold og øget dødelighed, er almindelige ^3-6.

Historisk set har får føtal PASMC eller svin føtal PASMC fra sunde dyr blevet brugt til at studere signalveje involveret i den normale pulmonal vaskulær overgang efter fødslen. Disse er typisk isoleret fra femte generation modstand PA af enn får eller svin fosteret, der er leveret og aflives forud for enhver spontan respiration ^7-9. Derudover har nogle forskere isoleret og anvendt PASMC fra lidt ældre og trækker vejret spontant lam og grise på 3 dage, 2 uger, og 4 uger ^10-12. For nylig har nogle grupper held isoleret og anvendt PASMC isoleret fra lam med PPHN at undersøge derangements i signalveje i sygdomstilstanden ^13-17. Disse celler har vist sig at være et værdifuldt værktøj til at undersøge, hvilke signalveje er afgørende for både den normale og syge kort sigt og sigt lungekarrene. Men de giver ikke indsigt i de signalveje påvirket for tidligt fødte børn med pulmonal hypertension. Heller ikke de tillader mulighederne for genmanipulation ses i musemodeller af sygdom.

Rotte og musemodeller er længe blevet anvendt til model BPD og mere nylig bliver brugt til model pulmonal hypertension følge af BPD ^18-22. Neonatale rotter lokke til at arbejde med på grund af deres større størrelse, men også lider af mangel på muligheder for genmodificering. Genetisk modificerede dyr har været flittigt brugt til at undersøge virkningerne af specifikke gen mål for hele dyret fysiologi neonatale mus, men til dato ingen har tidligere med succes isoleret PASMC fra disse små mus. Ved at isolere PASMC kan større information indhentes om, hvordan veje skifter som reaktion på miljømæssige stimuli og / eller genetiske modifikation specifikt i lungepulsåren glatte muskulatur. Derudover kan levende PASMC skal afbildes i real tid til at undersøge hurtige ændringer i de centrale signalmolekyler såsom calcium og reaktive ilt arter ^23-25. Vi har for nylig beskrev den vellykkede isolering af PASMC fra voksne mus ved hjælp af en variation af den teknik Marshall et al. ^26. anvendt til at isolere rotte PASMC ^23,25,26. Vi har nu tilpasset ennd udvidede denne teknik til små mus 7-21 dage gamle (P7, P14, og P21). Den primære begrænsning for dette nye PASMC isolation teknik er, at det kræver flere mus til at frembringe tilstrækkelige celler til eksperimenter, og at celler vokser meget langsomt, hvilket er karakteristisk for primære glatmuskelceller. På trods af disse begrænsninger, mener vi denne teknik til at isolere neonatal mus PASMC vil muliggøre øget undersøgelse af centrale signalveje er involveret i udviklingen af ​​pulmonal hypertension og udgør et betydeligt fremskridt på dette område.

Protocol

Institutional Animal Care og brug Udvalg på Northwestern University godkendte denne protokol.

1.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Day One

1. Forbered Komplet M199 medier - Mix 400 ml M199 med 100 ml (slutkoncentration = 20%) varmeinaktiveret FBS og 5 ml (slutkoncentration = 1%) Penicillin / streptomycin.
2. Forbered serumfri M199 Media - 500 ml M199 med 5 ml (slutkoncentration = 1%) Penicillin / streptomycin.
3. Forbered PA Agarose - Mix 0,05 g agarose plus 0,05 g jernpartikler i 10 ml sterile, serum-frie M199 medier.
4. Forbered Lung Agarose - Mix 0,1 g agarose i 10 ml sterile, serum-frie M199 medier.
5. Forbered Collagenase - Mix kollagenase i sterile, serumfrie M199 medier ved en endelig koncentration på 80 U / ml og derefter sterilt filter denne blanding. Oprette alle udstyret før tid, før euthanizing musen.
6. Set PA agarose og lunge agarose i kog lige før euthanizing musen.
7. Aflive musen i den bedøvende krukke med isofluran overdosis og være omhyggelig med ikke at lade musen hvalpen til at komme i kontakt med isofluran. Den bedste celle udbytte opnås, når cellerne høstes straks efter døden for at undgå mikro-blodpropper, der dannes i cirkulation efter døden.
8. Fjern musen fra bedøvelsesmiddel jar, fastgøre musen til operativsystemet bord, og sterilisere musen, instrumenter og handsker med alkohol.
9. Indlæse skalpel med bladet og incise musen fra halsen til den ringere maven.
10. Åben maven på musens venstre side, udsætte nyre og skar den renale arterie at tillade musen til exsanguinate og derved undgå blodpropper i de små blodkar i lungerne.
11. Brug en saks til at klippe langs musens venstre side afbrystbenet for at åbne brystkassen.
12. Omhyggeligt bruge skalpel til at skære mellemgulvet på begge sider og åbn brysthulen. Brug pincet eller ben for at holde brysthulen åbne.
13. Stick RV med en 27 G ½ tomme kanyle rettet mod PA og perfundere RV / PA / lungerne med sterilt PBS, indtil lungerne synes hvid (alt blod skylles ud af lungekredsløbet). Dette vil tage omkring 3-5 ml PBS afhængigt af størrelsen af ​​musen. Det er vigtigt at skylle først at forhindre koageldannelse i de små lunge fartøjer.
14. Omhyggeligt bruge stump dissektion for at blotlægge luftrøret og tråden én sutur nedenunder.
15. Sæt de mindste pincet nedenunder luftrøret for støtte og placere 24 G angiokateter ind i luftrøret. Placer angiokateter som om at placere en IV.
16. Fastgør angiokateter i luftrøret med sutur gevind i trin 1.16.
17. Tag kogende PA agarose af kogende vand, og vend for at blande godt. Afkøl AgaroSE til ca kropstemperatur ved omrystning på is. Agarose bør forblive i opløsning, men ikke være så varmt, at det vil ødelægge cellerne i PA.
18. Stick RV med en 27 G ½ tomme nål og perfundere RV / PA / lunger med PA agarose, indtil lungerne forekommer grå. De jernpartikler i agarose blandingen vil gøre lungerne synes grå i farven. Dette vil tage omkring 3-5 ml PA agarose afhængigt af størrelsen af ​​musen. Det er også vigtigt at gå langsomt som injicere for hurtigt kan forårsage jern at sive ind i luftvejene.
19. Tag lunge agarose ud af kogende vand og vendes for at blande godt. Derefter køle agarose til ca kropstemperatur ved omrystning på is. Agarose bør forblive i opløsning, men ikke være så varmt, at det vil ødelægge cellerne i lungerne.
20. Udarbejd lunge agarose og fastgør sprøjten til 24 G angiokateter i luftrøret. Indgyde agarose gennem luftrøret til fuldt puste lungerne. Lungerne bliver Easier for at hakke (se senere trin), hvis lungerne hensigtsmæssigt oppustet.
21. Fjern hjerte-lunge blok, og nedsænke det i 25 ml iskold PBS at størkne agarose (~ 5 min). Brug denne tid til at rydde op i kirurgiske område.
22. For neonatale mus (P7-P21), den bedste PASMC udbytte kommer fra kombinere 2-3 unger i en batch af celler. PASMC foretrækker at være i kontakt med andre celler for optimal celle sundhed og vækst. Hvis en mus anvendes pr isolation, hvorefter cellerne er meget sparsomme og ikke vokser godt. Ved kombination dyr, høst og chill hjerte-lunge blokke sammen og derefter flytte til hakning når alle hjerte-lunge-blokke er blevet fjernet fra dyrene.
23. Flyt til cellekultur hætte til sterilitet fra dette punkt og fremefter.
24. Placer kølet lunger i låget af 10 cm vævsdyrkningsskål og fjern forsigtigt hjerte, thymus, luftrør, og alle bindevæv fra lungerne.
25. Flyt lungerne til bunden af ​​den 10 cm vævsdyrkningsskålog tilsættes ca 1 ml iskold steril PBS.
26. Hakke lungerne i meget små stykker (1-2 mm) med 2 skalpeller.
27. Bryd spidsen ud af en steril 5 ml serologisk pipette. Pipette hakket lunge gylle til sterile 50 ml konisk rør. Bruge yderligere steril iskold PBS at vaske pladen for at sikre, at alle lungevæv får i 50 ml konisk rør.
28. Placer 50 ml konisk rør på magneten. Vent til jern-holdige væv at flytte til side af røret ved siden af ​​magneten. Afhængigt af forholdet mellem jern-holdigt fartøj til lungevæv, kan nogle af de fartøjer, stadig være flydende på dette punkt. Aspirer off PBS langsomt og forsigtigt forsøger ikke at aspirere flydende lungevæv da det er uklart, om det indeholder fartøjer.
29. Vask lunge pellet 3x med 5 ml sterilt PBS, igen forsøger at minimere mængden af ​​lungevæv, der suges.
30. Resuspender lunge pellet i 3 ml collagenase og hæld i 60 mm vævskulturskål. Må ikkeprøv at pipettere dette, lunge bidder vil holde sig til det indre af dit pipette.
31. Brug et ekstra 3 ml at skylle glasset efter at hælde, og hæld dette i 60 mm vævskulturskål så godt.
32. Sted i 37 ° C vævsdyrkningsinkubator i 1 time.
33. Pipette væv + collagenase gylle op og ned med en 15 G stump nål på en 5 ml sprøjte, indtil alle de store lunge stykker forstyrres. Vævet + collagenase gylle vil være uklar på dette punkt uden synlige væv bidder.
34. Hæld i en ny steril 50 ml konisk rør og tillægger magneten.
35. Vask vævsdyrkningsskål med cirka 5 ml komplet M199 medier for at sikre, at al vævet er blevet opsamlet, og hæld i den koniske rør.
36. Aspirer off collagenase + media supernatant. Denne gang vil der være meget få flydere, og en kompakt jern-holdige pellet vil være på den side af den konisk rør ved siden af ​​magneten.
37. Vask med 5 ml komplet withbl.a. 3x. Dette er nødvendigt for at inaktivere collagenase.
38. Tilsæt 3 ml komplette medier, og bland op og ned et par gange for at opblande jern-holdige pellet.
39. Hæld den resuspenderede pellet til en 35 mm vævskulturskål. Hjælp af et mikroskop, vil der være mindre skibstyper fragmenter flyder rundt med jernpartikler indeholdt i karhulrummet.
40. Placer vævsdyrkningsskål (mærket plade nul) i vævskultur inkubator natten over. De første celler til at migrere væk på pladen nul er ca 50% fibroblaster og 50% PASMC baseret på farvning for glatte muskelceller markører. Denne plade kaldes forgyldt nul og i sidste ende kasseres efter de efterfølgende berigelse trin.

2.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Dag Two

1. Hæld mediet supernatanten fra pladen nul i en ren 50 ml konisk rør.
2. Aspirer off medierne supernatanten. Denne gang vil der være næsten ingen flydere og en kompakt jern-contalingen pellet vil danne på den side af den konisk rør ved siden af ​​magneten.
3. Vask med 5 ml komplette medier 3x.
4. Tilsæt 3 ml komplette medier, og bland op og ned et par gange for at opblande jern-holdige pellet.
5. Hæld i en 35 mm vævskulturskål. Ved hjælp af et mikroskop, er små fartøj fragmenter flyder rundt med jernpartikler indeholdt i karlumen set. Dette vil være plade ét (figur 1A).
6. Placer vævsdyrkningsskål i vævskultur inkubator.

3.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Dag Six

1. Hæld mediet supernatanten fra pladen en i en ren 50 ml konisk rør. Gentage dette trin flere gange sikrer, at alle de glatte muskelceller bopæl i karvæggen har mulighed for at migrere ud på en cellekultur plade. Der er en aftagende afkast for hvert skridt, dvs hver plade vil have færre og færre celler overholde.
2. Aspirer off medierne supernatanten. Denne gang vil der være næsten ingen flydere, og en kompakt jern-holdige pellet vil danne på den side af den konisk rør ved siden af ​​magneten.
3. Vask med 5 ml komplette medier 3x.
4. Tilsæt 3 ml komplette medier, og bland op og ned et par gange for at opblande jern-holdige pellet.
5. Hæld i en 35 mm vævskulturskål. Ved hjælp af et mikroskop, er små fartøj fragmenter flyder rundt med jernpartikler indeholdt i karlumen set. Dette vil være plade to.
6. Placer vævsdyrkningsskål i vævskultur inkubator.

4.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Dag Nine

1. Hæld mediet supernatanten fra vævsdyrkningsskål plade to i en ren 50 ml konisk rør.
2. Refeed plade to med komplet M199 medier og sted tilbage i vævskulturinkubator.
3. Aspirer off medierne supernatanten. Denne gang vil der være næsten ingen flydere, og en kompakt jern-holdige pellet vil danne på den side af den konisk rør ved siden af ​​magneten.
4. Vask med 5 ml komplette medier 3x.
5. Tilsæt 3 ml komplette medier og bland op og ned et par gange for at opblande jern-holdige pellet.
6. Hæld i en 35 mm vævskulturskål. Ved hjælp af et mikroskop, er små fartøj fragmenter flyder rundt med jernpartikler indeholdt i karlumen set. Dette vil være plade tre.
7. Placer vævsdyrkningsskål i vævskultur inkubator.

5.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Dag Thirteen

1. Aspirer mediet ud af plader 1-3.
2. Forsigtigt vaske cellerne med varm, steril PBS.
3. Tilføj en tynd film af trypsin (~ 0,25-0,5 ml) trypsin til hver plade til Trypsinisér off celler. Celler er meget vedhængende og bliver nødt til at være i trypsin i vævet culture kuvøse for ca 10 min at løfte pladen.
4. Høst celler fra pladerne i 5 ml komplette medier i en 50 ml konisk rør fastgjort til magnet til at trække eventuelle resterende jernpartikler.
5. Vask hver af pladerne med yderligere 0,5 ml komplette medier og tilføje, at medierne til 50 ml konisk rør.
6. Denne gang tager medierne supernatanten (ikke aspirere), og kassér jernpartikel pellet.
7. Plade cellerne i 5 ml komplet M199 medier i en 60 mm skål til at have konfluente celler i et par dage. Alternativt plade cellerne i 10 ml komplet M199 medier i en 10 cm plade og PASMC vil tage yderligere ca 1-2 uger at nå sammenløb.

6.. Lungepulsåren Isolering fra Neonatal Mice - Dag Fjorten

1. Skift medierne til frisk komplet M199 medier for at fjerne eventuelle trypsin. Der vil være en tynd befolkning PASMC på vævsdyrkningsskål (figur 1B).

7.. Rutinemæssig Care

1. Skift medierne til frisk komplet M199 media ca 2x om ugen.
2. Ved kløvning disse celler, er omtrent 10 minutter i inkubatoren i en film af trypsin (0,25-0,5 ml), der kræves for at cellerne kan løftes pladen. Brug af trypsin filmen tillader genudpladning af PASMC uden centrifugering ned cellerne. Hvis for meget trypsin anvendes, så PASMC skal centrifugeres for at komme ud af trypsin, eller cellerne vil ikke readhere til pladen. Nogle gange, efter at spinding ned cellerne, er det svært at få PASMC resuspenderet i komplette M199 medier.
3. I sine bemærkninger, opfører den isolerede PASMC ligesom glatte muskelceller pålideligt til 4-5 passager, men de isolerede celler vil pletten for glatmuskelcelle markører op til passagen 7.. Tæl første poolede 60 mm eller 10 cm plade på dagen tretten som passage 2 (plating efter første eksponering for trypsin).

Representative Results

Under og efter isolering, er PASMC undersøgt både ved lysmikroskopi og ved immunfarvning for glatte muskelceller cellemarkører. Ved lysmikroskopi tidligt i protokollen, er PASMC ses migrerer på vævsdyrkningsskål fra den lille jern indeholder fartøjer (figur 1A). Efter pooling plader en gennem tre på dagen tretten, jernpartikler derefter ikke længere betragtes som de er blevet trukket ud i den endelige pooling trin. I stedet er en population af PASMC ses på vævsdyrkningsskål (figur 1B).

Baseret på immunofarvning, er de første celler, der vandrer off jern-holdige fartøjer cirka 50% fibroblaster og 50% PASMC (data ikke vist). Da fibroblaster har en betydelig vækst fordel fibroblaster vil over tid overgrow på PASMC på plade nul. Af denne grund er pladen nul kasseres, når der er tydeligt isoleret PASMC på de efterfølgende plader. Efter pooling, befolkningenaf PASMC er> 90% PASMC som farvet positive for både α-glat muskel myosin og desmin (figur 2). Når afbildet på 20X, er multiple spindel-formede celler set i overensstemmelse med en glat muskelcelle-fænotype (figur 2A). Når afbildet ved højere forstørrelse (40X), den lamellopodia af forkanten af enkelte celler visualiseres, når de trækker og vokse op mod andre glatte muskelceller på skålen (figur 2B).

Phosphodiesterase 5 (PDE5) udtrykkes i PASMC og hydrolyserer cGMP, en vigtig mediator af vaskulær tone, til inaktive GMP. Falde i PDE5 spiller en kritisk rolle i den normale pulmonal vaskulær overgang efter fødslen. I store dyremodeller er PDE5 udviklingsmæssigt reguleret tværs drægtighed, og dens udtryk og aktivitetsniveau falder drastisk efter fødslen ^27.. For at bekræfte, at disse isolerede PASMC bevare en fænotype overensstemmelse med deres udviklingsstadium, vi undersøgte PDE5 EnzYME aktivitet i muse PASMC isoleret fra P7, P14 og P21 mus, samt voksne mus. Vi ser de højeste niveauer af PDE5 aktivitet i PASMC isoleret fra P7 mus. Disse niveauer falder i PASMC isoleret fra P14 og P21 mus. De laveste niveauer af PDE5-aktivitet, er angivet i PASMC isoleret fra voksne mus (Figur 3).

Figur 1. Neonatal PASMC visualiseret ved lysmikroskopi. PASMC visualiseres ved hjælp af et lysmikroskop ved 20X. A) På dag tre af protokollen, kan spindel-formet PASMC ses migrere fra det sorte jern-fyldt lille PA på vævsdyrkningsskål. B) På dag fjorten efter gruppering, kan en population af PASMC ses på vævsdyrkningsskål.

Figur 2. Neonatal PASMC Stain Positivt for Smooth Muscle markører. PASMC blev udpladet på kollagen-behandlede dækglas, fikseret i 4% formaldehyd, og permeabiliseredes med 0,2% Triton-X som tidligere beskrevet ^7,23. A) PASMC fra P7, P14, og P21 mus blev farvet med anti-desmin (1:200 fortynding) eller anti-glat muskulatur myosin (1:2.000 fortynding) i 5% BSA, efterfulgt af rhodamin-rød anti-kanin sekundært ved en 1:200 fortynding. Fluorescens blev visualiseret med et epifluorescensmikroskop ved 20X. B) PASMC fra P14 og P21 mus blev farvet med anti-glat muskulatur myosin eller desmin som ovenfor, og fluorescens blev visualiseret som ovenfor ved 40X.

Figur 3. Phosphodiesterase 5 (PDE5) Aktivitet erUdviklingsmæssigt reguleret i PASMC. PASMC blev høstet for total protein og analyseret for PDE5 enzymatiske aktivitet som tidligere beskrevet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kolorimetrisk cyklisk nukleotid phosphodiesterase assay kit ^7.. Hver prøve blev læst ± sildenafil (100 Nm). Forskellen mellem den pmol cGMP hydrolyseret pr mg totalt protein per minut ± sildenafil repræsenterer PDE5-specifikke cGMP-hydrolytisk aktivitet. N = 4 for P7 PASMC, n = 10 for P14 PASMC, n = 4 for P21 PASMC og n = 8 for voksne PASMC. * P <0,05 versus P7 PASMC, ^# p <0,05 versus P14 PASMC.

Discussion

I dette manuskript, beskriver vi for første gang isolering af PASMC fra mus ved P7, P14, og P21. For at opnå dette, er en opslæmning af agarose og 0,2 um jernpartikler infunderes gennem RV i PA. På grund af den lille størrelse af jernpartikler, kan de ikke passere gennem det pulmonale kapillærbane og deponeres således i den lille PA. Lungerne er oppustet, fjernet og dissocieret. De jern-holdige skibe trækkes ud af opløsning ved anvendelse af en magnet. I sidste ende er de fartøjer, udpladet i en vævskulturskål, og cellerne migrere fra beholderne og på agarplade. Den oprindelige plade af celler er en blanding af fibroblaster og PASMC, og pull down procedure gentages flere gange for at udlede en beriget PASMC befolkning. Med langvarig udsættelse for høj, er der en teoretisk risiko for, at resterende jern kan påvirke redox balance i de isolerede celler. Således er omhyggelig i det sidste trin for at fjerne alle resterende jernforud for pooling og plantemateriale cellerne. Immunfarvning for α-glat muskulatur myosin og desmin er gjort for at bekræfte, at den berigede befolkning er> 90% PASMC. Disse celler har PDE5 enzymatisk aktivitet, i overensstemmelse med en vaskulær glat muskelcelle-fænotype. Interessant, PDE5-enzymet aktiviteten er anderledes i PASMC isoleret fra mus i forskellige aldre, hvilket tyder på fortsat udviklingsmæssige regulering inden for PASMC efter isolering.

Mens denne teknik er intellektuelt meget ligetil, et fælles problem er lavt udbytte af PASMC. Der kan være flere grunde til dette problem, selv når 2-3 mus samles sammen. Først bliver bedste celleudbytte opnås, hvis isolation indledes umiddelbart efter musen bukker under for det isofluran overdosis. Når døden er indtruffet, mikro-blodpropper form, hele vaskulære seng. Disse blodpropper i de pulmonale kar vil forhindre de jernpartikler fra at komme ind i så mange små PA, hvorved destigende udbyttet. Også levedygtighed isolerede PASMC bliver større bekymring længere musen er død før isolation. Den absolutte afgørende skridt, der påvirker PASMC rente er jern infusion. Hvis lungerne ikke er mærkbart gråt efter jern infusionen, de mulige årsager er: 1) jern går retrograd i højre atrium og lever, 2) der er hul eller rift i RV, eller 3) der er mikro-blodpropper i lungekredsløbet sted forhindrer god jern infusion. Endelig har vi bemærket, at PASMC isoleret fra forskellige genetisk modificerede stammer af mus udviser påfaldende forskellige vækstrater i kultur efter isolering. Derfor, når først forsøger denne teknik, er det bedst at bruge en vildtype-stamme af mus.

Det er klart, forurening er en bekymring som helst man isolere celler fra en hel dyr. Alle instrumenter er steriliseret og aftørres med alkohol forud for proceduren, og derefter en gang til hjerte-lunge blok er fjernet, all de efterfølgende trin er udført i en vævskultur hætte med steril teknik. Ved hjælp af disse forholdsregler sammen med antibiotika-holdige medier har stort set elimineret eventuel forurening.

Med isolering af enhver primær cellelinie, er der en bekymring om, hvor længe en celle vil opretholde sin fænotype i kultur. Får FPASMC isoleret fra kontrol og PPHN lam opretholde deres glatte muskulatur fænotype for 8 og 5 passager henholdsvis ^7,14. For musen PASMC, begynder cellerne at miste signalering reaktioner ved passage 5 og glatte muskelceller markører ved passage 7 (data ikke vist). Dette fremhæver en af ​​begrænsningerne ved denne teknik. Flere mus er nødvendige for at opnå små mængder af celler, og tiden fra isolation nok celler til eksperimenter er lang, 2-4 uger afhængig af antallet af nødvendige celler. Endelig, når celler isoleres, man kun har tre passager til at arbejde med dem, før de mister deres glatte muskelceller signaleringresponses. Et potentielt område for forbedring ville være at udvikle en metode, hvorved disse celler kan fryses og nyttiggøres med succes fra flydende kvælstof. Dette ville tillade en laboratorium til at foretage regelmæssige og fryse celler som mus er tilgængelige, og derefter undersøgere kunne tø og udnytte de celler til forsøgene efter behov.

Trods den tekniske udfordring at udføre isoleringen og den lange tidslinjen til isolering, repræsenterer disse PASMC en roman og uvurderligt værktøj for studiet af signalveje i udviklingslandene murine lungekarrene. Vi mener, at denne teknik til at isolere neonatal mus PASMC vil muliggøre forbedret undersøgelse af centrale signalveje involveret i udviklingen af ​​pulmonal hypertension, hvilket vil føre til en bedre forståelse af sygdommens patogenese og mulighed for udvikling af nye behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.