Summary
Vi har utviklet en ny og reproduserbar teknikk for å isolere primære kulturer av pulmonalarterien glatte muskelceller (PASMC) fra mus så unge som P7, og dermed gir bedre studie av signalveier involvert i neonatal glatt muskelcelle sammentrekning og avslapning.
Abstract
Pulmonal hypertensjon er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos spedbarn. Historisk har det vært en betydelig studie av signalveier involvert i vaskulær glatt muskulatur sammentrekning i PASMC fra fosterets sau. Mens sau foreta en utmerket modell av sikt pulmonal hypertensjon, er de veldig dyre og mangler den fordel av genetisk manipulering funnet hos mus. Omvendt, var den manglende evne til å isolere PASMC fra mus en betydelig begrensning for det systemet. Her har vi beskrevet isoleringen av primære kulturer av mus PASMC fra P7, P14, P21 og mus ved hjelp av en variant av den tidligere beskrevne teknikk for Marshall et al. 26. som tidligere ble anvendt for isolering av rotte PASMC. Disse murine PASMC representerer en roman verktøy for studiet av signalveier i nyfødtperioden. Kort, en oppslemming av 0,5% (w / v) agarose + 0,5% jernpartikler i M199 medium blir tilført i pulmonalkar via den høyre ventrikkel (RV). Denjern-partikler er 0,2 mikrometer i diameter, og kan ikke passere gjennom lunge kapillære seng. Således er jern hytter i de små lungearterier (PA). Lungene er oppblåst med agarose, fjernet og distanserte. De jern-holdige fartøy er dratt ned med en magnet. Etter collagenase (80 U / ml) behandling og videre isolasjonen Fartøyene er satt inn i en vevskultur tallerken i M199 medium inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (M199 fullstendige media) for å tillate cellemigrering inn i kulturen rett . Denne første plate av celler er en 50-50 blanding av fibroblaster og PASMC. Således er det trekke ned prosedyre gjentas flere ganger for å oppnå et mer rent PASMC befolkning og fjerne alle rester av jern. Glattmuskelcellet identitet er bekreftet av farging for glatt muskulatur myosin og desmin.
Introduction
Pulmonal hypertensjon normale under intrauterin liv siden placenta tjener som hovedorgan for gassutveksling og bare 10% av minuttvolum som den sirkuleres mellom pulmonalkar. In utero, lunge presset er lik systemiske trykk på grunn av forhøyet pulmonar vaskulær motstand . Som svangerskapet utvikler seg, er det raske veksten av den lille PA i lungene, forbereder fosteret for den dramatiske økningen i pulmonal blodstrøm som oppstår ved fødselen en. Når den vanlige perinatal overgang mislykkes i nær sikt og full fullbårne barn, er resultatet vedvarende pulmonal hypertensjon hos nyfødte (PPHN). PPHN er et klinisk syndrom forårsaket av mange forskjellige underliggende patologi. Men alle disse barna har felles pathophysiologic funksjoner som forhøyet pulmonal vaskulær motstand, hypoksemi, og høyre-til-venstre shunt av blodet flyter over vedvarende fosterets tilkoblinger som ductus arteriosus eller foramen ovale. PPHN rammer 2-6 per 1000 levendefødte, og formidler en 8-10% risiko for dødelighet samt betydelige kortsiktige og langsiktige sykelighet to. I tillegg kan meget lav fødselsvekt premature barn utvikler pulmonal hypertensjon som et resultat av deres underliggende lungesykdom. Den vanligste underliggende lungesykdom av premature barn er bronkopulmonal dysplasi (BPD). Mens den generelle risikoen for BPD korrelerer med svangerskapsalder og fødselsvekt, er det fortsatt uklart hvorfor en undergruppe av disse barna utvikler betydelig pulmonal hypertensjon og hvordan du riktig behandle disse barna. Dårlige resultater, inkludert langvarige sykehusopphold og økt dødelighet, er vanlig 3-6.
Historisk sett har sau fetal PASMC eller svin fosterets PASMC fra friske dyr blitt brukt til å studere signalveier involvert i normal pulmonal vaskulær overgang etter fødselen. Disse er vanligvis isolert fra femte generasjon motstand PA av enN sauer eller svin foster som er levert og avlives før enhver spontan respirasjon 7-9. Dessuten har noen etterforskere isolert og utnyttet PASMC fra litt eldre og spontant puste lam og grisunger på tre dager, to uker og fire uker 10-12. Flere nylig, har enkelte grupper lyktes i å isolere og utnyttet PASMC isolert fra lam med PPHN å undersøke derangements i signalveier i sykdomstilstanden 13-17. Disse cellene har vist seg å være et verdifullt verktøy for å undersøke hvilke signalveier er avgjørende i både normal og sykelig kort sikt og sikt lunge blodkar. Men de gir ikke innsikt i signalveier påvirket hos premature barn med pulmonal hypertensjon. Heller ikke de lar mulighetene for genetisk manipulasjon sett i musemodeller av sykdom.
Rotte-og musemodeller har lenge blitt brukt til å modellere BPD og mer nylig blir brukt til å modellere pulmonar hypertension følge BPD 18-22. Nyfødte rotter er fristende å jobbe med på grunn av deres større størrelse, men de også lider av mangel på potensial for genmodifisering. Genmodifiserte dyr har vært mye brukt for å undersøke effektene av spesifikke genet mål på hel dyrefysiologi i neonatal mus, men hittil ingen har tidligere lyktes i å isolere PASMC fra disse små mus. Ved å isolere PASMC, kan bedre informasjon fås om hvordan trasé endre seg i respons på miljømessige stimuli og / eller genetisk modifisering spesifikt i lungearterien glatt muskulatur. I tillegg kan leve PASMC avbildes i sanntid for å undersøke hurtige endringer i sentrale signalmolekyler som kalsium og reaktive oksygenforbindelser 23-25. Vi har nylig beskrevet den vellykkede isolering av PASMC fra voksne mus ved hjelp av en variant av teknikken for Marshall et al. 26. anvendt for isolering av rotte PASMC 23,25,26. Vi har nå tilpasset ennd utvidet denne teknikken til små mus 7-21 dagers alder (P7, P14, og P21). Den primære begrensning til denne nye PASMC isolasjon teknikk er at den krever flere mus for å generere tilstrekkelig celler for forsøk og at cellene vokser meget langsomt, noe som er karakteristisk for primære glatte muskelceller. Til tross for disse begrensningene, tror vi denne teknikken til å isolere neonatal mus PASMC vil gi rom for den forbedrede etterforskningen av viktige signalveier er involvert i utviklingen av pulmonal hypertensjon og representerer et betydelig fremskritt på dette feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care og bruk Committee ved Northwestern University godkjent denne protokollen.
En. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Day One
- Forbered Komplett M199 media - Mix 400 ml M199 med 100 ml (endelig konsentrasjon = 20%) varmeinaktivert FBS og 5 ml (endelig konsentrasjon = 1%) Penicillin / streptomycin.
- Forbered Serum Gratis M199 Media - Bland 500 ml M199 med 5 ml (endelig konsentrasjon = 1%) Penicillin / streptomycin.
- Klargjør PA Agarose - Mix 0.05 g agarose pluss 0,05 g jern partikler i 10 ml sterilt, serum-frie M199 media.
- Klargjør Lung Agarose - Mix 0,1 g agarose i 10 ml sterilt, serum-frie M199 media.
- Klargjør Collagenase - blanding kollagenase i sterile, serumfrie M199 medium til en sluttkonsentrasjon på 80 U / ml og deretter sterilt filter denne blandingen. Sett opp alt utstyret på forhånd før euthanizing musen.
- Sett PA agarose og lunge agarose å koke rett før euthanizing musen.
- Avlive mus i bedøvelse krukke med isofluran overdose og være forsiktig for ikke å tillate musen valpen å komme i kontakt med isofluran. Den beste celle utbytte oppnås når cellene blir høstet umiddelbart etter døden for å unngå mikro-klumper som dannes i sirkulasjon etter døden.
- Ta musen fra narkosen jar, sikre musen til operasjonssalen styret, og sterilisere mus, instrumenter og hansker med alkohol.
- Laste skalpell med bladet og incise musen fra nakken til dårligere magen.
- Åpne buken på musens venstre side, utsetter nyrene, og kutte nyrearterien å tillate musen til å exsanguinate, og dermed unngå blodpropp i de små blodårene i lungene.
- Bruk saks til å klippe langs musens venstre side avsternum for å åpne brystkassen.
- Nøye bruke skalpell til å kutte mellomgulvet på begge sider og fullt åpne brysthulen. Bruk pinsett eller pinner til å holde brysthulen åpen.
- Stick RV med en 27 G ½ tommers nål rettet mot PA og perfuse RV / PA / lunger med sterilt PBS inntil lungene ser hvitt (alt blod spyles ut av pulmonal sirkulasjon). Dette tar omtrent 3-5 ml PBS, avhengig av størrelsen av musen. Det er viktig å spyle først for å forhindre dannelse av blodpropper i de små lunge fartøy.
- Nøye bruke stump disseksjon å avsløre luftrøret og tråd ett sting under.
- Sett de minste tang under luftrøret for støtte og plassere 24 G angiocatheter inn i luftrøret. Plasser angiocatheter som om å plassere en IV.
- Fest angiocatheter inn i luftrøret med sutur tredd i trinn 1.16.
- Ta kokende PA agarose ut med kokende vann, og invertere å blande godt. Avkjøl AgaroSE til ca kroppstemperatur ved å svinge på is. Den agarose trenger å forbli i løsning, men ikke være så varm at den vil skade cellene i PA.
- Stick RV med en 27 G ½ tommers nål og perfuse RV / PA / lunger med PA agarose til lungene se grå ut. Jernet partikler i agarose blanding vil gjøre lungene synes grå i farge. Dette tar omtrent 3-5 ml PA agarose, avhengig av størrelsen av musen. Det er også viktig å gå sakte som injiserer for fort kan føre til at jern for å lekke inn i luftveiene.
- Ta lunge agarose ut med kokende vann og invertere å blande godt. Deretter avkjøles den til ca agarose kroppstemperatur ved å svinge på is. Den agarose trenger å forbli i løsning, men ikke være så varm at den vil skade cellene av lungen.
- Tegn opp lungene agarose og fest sprøyten til 24 G angiocatheter i luftrøret. Sette mot agarose gjennom luftrøret å fullt blåse lungene. Lungene blir easier å hakke (se senere trinn) hvis lungene er riktig oppblåst.
- Fjern hjerte-lunge-blokken, og senke den inn i 25 ml iskald PBS for å størkne agarose (~ 5 min). Bruk denne tiden til å rydde opp i kirurgiske området.
- For neonatal mus (P7-P21), kommer det beste PASMC utbytte fra kombinere 2-3 unger i en gruppe med celler. PASMC foretrekker å være i kontakt med andre celler for optimal celle helse og vekst. Hvis en mus blir benyttet pr isolasjon, da cellene er meget tynt og ikke vokser godt. Når man kombinerer dyr, høste og chill hjerte-lunge blokkene sammen og deretter flytte til hakking når alle hjerte-lunge blokker er fjernet fra dyrene.
- Flytt til cellekultur hette for sterilitet fra dette punktet videre.
- Plasser kjølt lungene inn i lokket på 10 cm vev kultur tallerken og forsiktig fjerne hjertet, thymus, luftrøret, og noen bindevev fra lungene.
- Beveg lungene til bunnen av den 10 cm vevskultur tallerkenog legge til ca 1 ml iskald sterile PBS.
- Finhakk lungene i veldig små biter (1-2 mm) med to kniver.
- Bryte tuppen av av en steril 5 ml serologisk pipette. Pipette hakket lunge slurry i sterile 50 ml konisk tube. Bruk ytterligere steril iskald PBS for å vaske platene for å sikre at alt av lungevev kommer inn i 50 ml konisk rør.
- Plasser 50 ml konisk rør på magneten. Vent til den jern-holdige vev til å bevege seg til siden av røret ved siden av magneten. Avhengig av forholdet mellom jern-holdige kar for lungevev, kan noen av fartøyene fremdeles være flytende på dette punktet. Sug av PBS sakte og forsiktig prøver ikke å aspirere flytende lungevevet siden det er uklart om det inneholder fartøyer.
- Vask lunge pellet 3 x med 5 ml sterilt PBS, igjen prøver å minimere mengden av lungevev som aspireres.
- Resuspender lunge pellet i 3 ml collagenase og hell i 60 mm vev kultur parabolen. Må ikkeprøve å pipette dette, lunge biter vil holde seg til det indre av pipetten din.
- Bruk en ekstra 3 ml å skylle røret etter å helle, og hell dette i 60 mm vev kultur parabolen også.
- Plasser i 37 ° C vevskultur-inkubator i 1 time.
- Pipette vev + collagenase slurry opp og ned med en 15 G stump nål på en 5 ml sprøyte til alle de store lunge stykker blir forstyrret. Vevet + collagenase slurry vil være overskyet på dette punktet uten synlige vev biter.
- Hell over i et nytt sterilt 50 ml konisk rør og feste seg til magneten.
- Vask vevskultur fatet med omtrent 5 ml av komplette M199 medium for å sikre at alt av den vev ble tatt ut, og helle denne inn i det koniske rør.
- Sug av collagenase + media supernatanten. Denne tid vil det være svært få flytere, og en kompakt jern-holdig pellet blir på siden av det koniske røret ved siden av magneten.
- Vask med 5 ml komplett Medbl.a. 3x. Dette kreves for å inaktivere collagenase.
- Tilsett 3 ml av komplette media, og bland opp og ned et par ganger for å resuspendere jern-holdige pellet.
- Hell resuspenderte pellet inn i en 35 mm vev kultur parabolen. Ved hjelp av et mikroskop, vil det være lite fartøy fragmenter flyter rundt med jern-partikler som finnes i fartøyet lumen.
- Plasser vevskultur tallerken (merket plate null) i vevskultur inkubator over natten. De første cellene til å migrere bort på plate null er ca 50% fibroblaster og 50% PASMC, basert på farging for glatte muskelceller markører. Denne platen er kalt belagt null og til slutt kastes etter de påfølgende berikelse trinn.
2. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Day Two
- Hell mediet supernatant fra platen null i en ren 50 ml konisk rør.
- Sug av media supernatanten. Denne gangen vil det være nesten ingen flytere, og en kompakt jern-Containing pellet vil danne på siden av det koniske røret ved siden av magneten.
- Vask med 5 ml komplett media 3x.
- Tilsett 3 ml av komplette media, og bland opp og ned et par ganger for å resuspendere jern-holdige pellet.
- Hell i en 35 mm vev kultur parabolen. Ved hjelp av et mikroskop, er små fartøy fragmenter flyter rundt med jern partikler som finnes i fartøyet lumen sett. Dette vil være en plate (figur 1A).
- Plasser vev kultur fatet i vevet kultur inkubator.
3. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Dag seks
- Hell media supernatanten fra plate én i en ren 50 ml konisk tube. Gjenta dette trinnet flere ganger sikrer at alle de glatte muskelceller bosatt i veggen av karet har en mulighet til å migrere bort på en cellekultur plate. Det er en avtagende avkastning med hvert trinn dvs. hver plate vil ha færre og færre celler holder seg.
- Sug av media supernatanten. Denne tid vil det være nesten ingen flytere, og en kompakt jern-holdig pellet vil danne på siden av det koniske røret ved siden av magneten.
- Vask med 5 ml komplett media 3x.
- Tilsett 3 ml av komplette media, og bland opp og ned et par ganger for å resuspendere jern-holdige pellet.
- Hell i en 35 mm vev kultur parabolen. Ved hjelp av et mikroskop, er små fartøy fragmenter flyter rundt med jern partikler som finnes i fartøyet lumen sett. Dette blir platen to.
- Plasser vev kultur fatet i vevet kultur inkubator.
4. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Dag Nine
- Hell media supernatanten fra vevskultur fatet plate to i en ren 50 ml konisk rør.
- Refeed plate to med komplett M199 media, og legg tilbake i vevet kulturkuvøse.
- Sug av media supernatanten. Denne tid vil det være nesten ingen flytere, og en kompakt jern-holdig pellet vil danne på siden av det koniske røret ved siden av magneten.
- Vask med 5 ml komplett media 3x.
- Tilsett 3 ml av komplette media og bland opp og ned et par ganger for å resuspendere jern-holdige pellet.
- Hell i en 35 mm vev kultur parabolen. Ved hjelp av et mikroskop, er små fartøy fragmenter flyter rundt med jern partikler som finnes i fartøyet lumen sett. Dette blir platen tre.
- Plasser vev kultur fatet i vevet kultur inkubator.
5. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Dag Tretten
- Aspirer media av av platene 1-3.
- Forsiktig vaske cellene med varme, sterile PBS.
- Legg en tynn film av trypsin (~ 0,25-0,5 ml) trypsin til hver plate til trypsinize av celler. Cellene er meget vedheftende og må være i trypsin i vevet culture inkubator for ca 10 min å løfte av platen.
- Høste celler på platene inn i 5 ml komplett medium i et 50 ml konisk rør festet til magnet for å trekke ut eventuelle rester av jern-partikler.
- Vask hver av platene med en ytterligere 0,5 ml komplett medium og tilsett det mediet til 50 ml konisk rør.
- Denne gangen tar media supernatanten (ikke suge), og kast jern partikkel pellet.
- Plate cellene i 5 ml komplett M199 medier i en 60 mm parabolen for å ha konfluente celler i løpet av få dager. Alternativt plate cellene i 10 ml komplett M199 medier i en 10 cm plate, og PASMC vil ta ytterligere ca 1-2 uker å nå samløpet.
6. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus - Dag Fjorten
- Endre media til ferske komplett M199 media for å fjerne alle rester av trypsin. Det vil være en tynn populasjon av PASMC på vevskultur konkavitet (figur 1B).
7. Rutinemessig vedlikehold
- Endre media til ferske komplett M199 media ca 2x per uke.
- Når splitte disse cellene, er omtrent 10 minutter i inkubatoren i en film av trypsin (0,25-0,5 ml) som er nødvendig for at cellene skal løftes av platen. Bruke trypsin film gjør replating av PASMC uten å spinne ned cellene. Hvis for mye trypsin brukes, er den PASMC må sentrifugeres for å spinne ut av trypsin, og cellene vil ikke readhere til plate. Noen ganger, etter spinne ned cellene, er det vanskelig å få PASMC resuspendert til komplette M199 media.
- I observasjoner, den isolerte PASMC oppføre seg som glatte muskelceller pålitelig for 4-5 passasjer, men de isolerte cellene vil farge for glatt muskelcelle markører opp til passering 7. Tell først samlet 60 mm eller 10 cm plate på dag tretten som passage to (platekledning etter første eksponering for trypsin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under og etter isolasjon, er PASMC undersøkt både ved lysmikroskopi og ved farging for glatt muskelcelle markører. Ved lysmikroskopi tidlig i protokollen, er PASMC sett migrerer på vev kultur tallerken fra den lille jern inneholder fartøy (figur 1A). Etter pooling plater en gjennom tre på dag tretten, da jern partikler er ikke lenger sett på som de som har blitt trukket ut i den endelige pooling trinn. I stedet blir en populasjon av PASMC sees på vevskultur konkavitet (figur 1B).
Basert på farging, de første cellene som vandrer utenfor jern-holdige fartøyene er ca 50% fibroblaster og 50% PASMC (data ikke vist). Siden fibroblaster har en betydelig vekst fordel, fibroblaster vil over tid overgrow den PASMC på tallerkenen null. Av denne grunn er plate null forkastet når det er klart isolert PASMC på de påfølgende platene. Etter pooling, befolkningenav PASMC er> 90% PASMC som beis positivt både α-glattmuskel myosin og desmin (figur 2). Når avbildes ved 20X, er flere spindel-formede celler sett i samsvar med et glatt muskel celle fenotype (figur 2A). Når fotografert ved høyere forstørrelse (40X), den lamellopodia av forkanten av enkeltceller er visualisert som de vandrer og vokse mot andre glatte muskelceller på fatet (figur 2B).
Fosfodiesterase 5 (PDE5) er uttrykt i PASMC og hydrolyserer cGMP, en viktig formidler av vaskulær tone, til inaktive GMP. Nedgang i PDE5 spiller en avgjørende rolle i normal pulmonal vaskulær overgang etter fødselen. I store dyremodeller, er PDE5 utviklingshemmede regulert på tvers av svangerskapet, og dens uttrykk og aktivitet falle dramatisk etter fødselen 27. For å bekrefte at disse isolerte PASMC beholde en fenotype forenlig med deres utviklingsstadiet, undersøkte vi PDE5 enzYme aktivitet i mus PASMC isolert fra P7, P14, og P21 mus, så vel som voksne mus. Vi ser de høyeste nivåene av PDE5 aktivitet i PASMC isolert fra P7 mus. Disse nivåene falle i PASMC isolert fra P14 og P21 mus. De laveste nivåene av PDE5 aktivitet er nevnt i PASMC isolert fra voksne mus (figur 3).
Figur 1. Neonatal PASMC Visualisert ved lysmikroskopi. PASMC er visualisert ved hjelp av et lysmikroskop på 20X. A) På dag tre av protokollen, kan spindel-formet PASMC sees migrere fra svart jern-fylt liten PA på vev kultur parabolen. B) På dag fjorten etter pooling, kan en befolkning på PASMC bli sett på vevet kultur parabolen.
Figur 2. Neonatal PASMC Stain Positively for glatt muskulatur Markers. PASMC ble platet ut på kollagen-behandlede glass Dekkglass, fiksert i 4% formaldehyd, og permeabilized med 0,2% Triton-X som tidligere beskrevet 7,23. A) PASMC fra P7, P14, og P21 mus ble farget med anti-desmin (1:200 fortynning) eller anti-glattmuskel myosin (1:2,000 fortynning) i 5% BSA, etterfulgt av rhodamin-røde anti-kanin sekundært ved en fortynning på 1:200. Fluorescens ble visualisert med en epifluorescence mikroskop på 20X. B) PASMC fra P14 og P21 mus ble farget med anti-glatt muskulatur myosin eller desmin som ovenfor, og fluorescens ble visualisert som ovenfor på 40X.
Figur 3. Fosfodiesterase 5 (PDE5) Aktivitet erUtviklingsmessig regulert i PASMC. PASMC ble høstet for total protein og analysert for PDE5 enzymatisk aktivitet som tidligere beskrevet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kolorimetrisk syklisk nukleotid fosfodiesterase analysen kit 7. Hver prøve ble avlest ± sildenafil (100 nM). Forskjellen mellom pmol cGMP hydrolysert pr mg totalt protein pr minutt ± sildenafil representerer den PDE5-spesifikk cGMP-hydrolytisk aktivitet. N = 4 til P7 PASMC, n = 10 for P14 PASMC, n = 4 til P21 PASMC, og n = 8 for voksen PASMC. * P <0,05 versus P7 PASMC, # p <0,05 versus P14 PASMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet, beskriver vi for første gang isolering av PASMC fra mus ved P7, P14, og P21. For å oppnå dette, blir en oppslemning av agarose og 0,2 mikrometer jernpartikler sprøytet inn gjennom RV inn PA. På grunn av den lille størrelsen på de jern-partikler, kan de ikke passere gjennom lunge kapillære sengen og blir således avsatt i liten PA. Lungene er oppblåst, fjernet og distanserte. De jern-holdige fartøy er trukket ut av løsningen ved hjelp av en magnet. Til syvende og sist er skipene belagt i en vev kultur tallerken, og cellene vandrer av fartøyene og på kultur plate. Den første plate av celler er en blanding av fibroblaster og PASMC, og trekke ned prosedyren gjentas flere ganger for å utlede en beriket populasjon PASMC. Ved lengre utsettelse for høye nivåer, er det en teoretisk risiko for at residual jern kan påvirke redoks balanse innenfor de isolerte celler. Dermed er omsorg tatt i det siste trinnet for å fjerne alle rester av jernfør pooling og spre cellene. Farging for α-glatt muskulatur myosin og desmin er gjort for å bekrefte at det anrikede befolkningen er> 90% PASMC. Disse cellene har PDE5 enzymatisk aktivitet, i samsvar med en vaskulær glattmuskelcelle fenotype. Interessant, er PDE5 enzym aktivitet annerledes i PASMC isolert fra mus i ulike aldre, noe som tyder på fortsatt utviklingsmessige regulering innenfor PASMC etter isolasjon.
Selv om denne teknikken er intellektuelt veldig grei, er et vanlig problem lav yield på PASMC. Det kan være flere årsaker til dette problem, selv når 2-3 mus blir oppsamlet sammen. Først er det beste celle avkastning oppnås dersom isolasjon prosedyren er iverksatt umiddelbart etter at musa succumbs til isofluran overdose. Når døden har inntruffet, mikro-klumper form gjennom det vaskulære bed. Disse blodpropp i lunge blodkar vil hindre at jern partikler fra å komme inn så mange små PA, og dermed dekrøller utbyttet. Dessuten blir levedyktigheten til den isolerte PASMC av større bekymring jo lengre mus er døde før isolering. Den absolutte viktig skritt som påvirker PASMC avkastning er jern infusjonen. Dersom lungene er ikke merkbart grått etter jern infusjon, de mulige årsakene er: 1) jernet går retrograd i høyre forkammer og lever, 2) det er hull eller rift i RV, eller 3) er det mikro-klumper i pulmonal sirkulasjon sted hindre god jern infusjon. Til slutt har vi lagt merke til at PASMC isolert fra ulike genmodifiserte stammer av mus viser påfallende ulike vekstrater i kultur etter isolasjon. Derfor, når de først prøver denne teknikken, er det best å bruke en vill-type stamme av mus.
Selvfølgelig er forurensning en bekymring som helst man isolere celler fra en hel dyr. Alle instrumenter er sterilisert og tørkes med alkohol før prosedyren, og deretter en gang hjerte-lunge blokken er fjernet, all til de etterfølgende trinn blir utført i en vevskultur hette med steril teknikk. Ved hjelp av disse forholdsreglene sammen med antibiotika-holdige medier har praktisk talt eliminert noen forurensning.
Ved isolering av en hvilken som helst primær cellelinje, er det en bekymring om hvor lenge en celle vil opprettholde sin fenotype i kultur. Sau FPASMC isolert fra kontroll og PPHN lam opprettholde sin glatt muskulatur fenotype for 8 og 5 passasjer, henholdsvis 7,14. For mus PASMC, cellene begynner å miste signalering responser etter passasje 5 og glatt muskel merkene ved passasje 7 (data ikke vist). Dette understreker en av begrensningene ved denne teknikken. Flere mus er nødvendig for å oppnå små mengder av celler, og tiden fra isolasjonen til nok celler for forsøk er lang, 2-4 uker, avhengig av antallet celler som trengs. Til slutt, når cellene er isolert, man har bare tre passasjer å jobbe med dem før de mister sin glatt muskulatur cellesignaliseringresponser. En mulig område for forbedring ville være å utvikle en fremgangsmåte hvorved disse cellene kan bli frosset og gjenvunnet fra flytende nitrogen med hell. Dette ville tillate en lab for å jevnlig lage og fryse celler som mus er tilgjengelig, og deretter etterforskerne kunne tine og utnytte cellene for eksperimenter som trengs.
Til tross for den tekniske utfordringen med å utføre isolasjon og den lange tidslinjen for isolasjon, disse PASMC representerer en ny og uvurderlig verktøy for studier av signalveier i utviklingsland murine lunge blodkar. Vi tror denne teknikken til å isolere neonatal mus PASMC vil gi rom for den forbedrede etterforskningen av viktige signalveier er involvert i utviklingen av pulmonal hypertensjon, noe som vil føre til bedre forståelse av sykdommen patogenesen og gi rom for utvikling av nye behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH HL109478 (KNF). Han anerkjenner og takker Gina Kim og Joann Taylor for deres hjelp i å isolere og opprettholde PASMC i kultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
