Summary
פיתחנו רומן וטכניקה לשחזור לבודד את התרבויות העיקריות של תאי שריר חלק ריאתי עורקים (PASMC) מעכברים צעירים כP7 כ, ובכך לאפשר מחקר טוב יותר של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שרירים חלקה בילוד תא ורגיעה.
Abstract
יתר לחץ דם ריאה הוא גורם משמעותי לתחלואה ולתמותה בתינוקות. מבחינה היסטורית, יש כבר מחקר משמעותי של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שריר חלק בכלי הדם בPASMC מכבשים עוברי. בעוד כבשים להפוך מודל מצוין של יתר לחץ דם ריאת טווח, הם מאוד יקרים וחסרי התועלת של מניפולציה גנטית שנמצאה בעכברים. לעומת זאת, חוסר היכולת לבודד PASMC מעכברים הייתה מגבלה משמעותית של מערכת זו. כאן אנחנו יכולים לתאר את הבידוד של תרבויות העיקריות של העכבר PASMC מP7, P14, p21 ולעכברים באמצעות וריאציה של הטכניקה שתוארה לעיל של מרשל ואח'. -26 ששימש בעבר לבודד PASMC חולדה. PASMC העכברי אלה מייצגים כלי חדשני לחקר מסלולי איתות בתקופת הילוד. בקצרה, תרחיף של 0.5% (w / v) agarose + חלקיקי ברזל 0.5% בM199 תקשורת הוא החדיר לתוך מיטת כלי דם ריאתי דרך החדר ממני (RV).חלקיקי ברזל הם 0.2 מיקרומטר בקוטר ולא יכולים לעבור דרך מיטת נימי ריאה. לפיכך, לשכות הברזל בעורקי הריאה הקטנים (הרשות הפלסטינית). הריאות הן מנופחות עם agarose, הוסרה וניתקה. הכלים המכילים ברזל הם משכו למטה עם מגנט. לאחר collagenase (80 U / ml) טיפול וניתוק נוסף, כלי הם הכניסו לתוך צלחת תרבית רקמה בM199 מדיה המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS), ואנטיביוטיקה (M199 מדיה מלאה) כדי לאפשר נדידת תאים על גבי צלחת התרבות . צלחת ראשונית זה של תאים היא תערובת 50-50 של fibroblasts וPASMC. לפיכך, לניתץ הליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג אוכלוסיית PASMC טהורה יותר ולהסיר כל ברזל שיורית. זהות תא שריר החלק אושר על ידי immunostaining לחלקת שרירים שרירן וdesmin.
Introduction
יתר לחץ דם ריאתי הוא נורמלי במהלך חיים תוך רחמי מאז השליה משמשת כאיבר העיקרי של חילוף גזים ורק 10% מתפוקת הלב מופצים דרך מיטת כלי דם ריאתי. ברחם, לחצי ריאה דומים ללחצים מערכתיים בשל התנגדות כלי דם ריאתי גבוהה . עם התקדמות הריון, יש צמיחה מהירה של הרשות הפלסטינית הקטנה בתוך הריאות, מכינה את העובר לעלייה הדרמטית בזרימת דם ריאתי המתרחשת בלידה 1. כאשר מעבר הלידה הרגיל נכשל בתינוקות בטווח קרוב וטווח מלא, התוצאה היא יתר לחץ דם ריאה מתמשך של היילוד (PPHN). PPHN הוא תסמונת קלינית הנגרמת על ידי פתולוגיות בסיסיות רבות ושונות. עם זאת, כל התינוקות הללו חולקים תכונות משותפות pathophysiologic כגון עמידות גבוהה ריאות כלי דם, היפוקסמיה, והסטה מימין לשמאל של זרימת דם על פני חיבור קבוע בעובר כגון ductus arteriosus או עבוראמן ovale. PPHN משפיע 2-6 ל -1,000 לידה חיות ומעביר סיכון 8-10% מתמותה, כמו גם 2 תחלואה לטווח קצר וארוך טווח משמעותי. בנוסף, תינוקות במשקל לידה נמוכים מאוד מוקדמים עלולים לפתח יתר לחץ דם ריאתי כתוצאה ממחלת הריאות הבסיסית שלהם. מחלת הריאות הבסיסית הנפוצה ביותר של פגים היא דיספלזיה bronchopulmonary (BPD). אמנם את הסיכון הכולל של BPD בקורלציה עם גיל הריון ומשקל לידה, עדיין לא ברור למה משנה של תינוקות אלה מתפתח יתר לחץ דם ריאה משמעותי וכיצד לטפל כראוי תינוקות אלה. תוצאות עניות, כוללים נשאר בבית החולים ממושכים ותמותה מוגברת, נפוצות 3-6.
מבחינה היסטורית, PASMC עוברי כבש או PASMC העוברי חזירית מבעלי החיים בריאים כבר בשימוש כדי ללמוד את מסלולי האיתות מעורבים במעבר בכלי הדם הריאתיים הרגיל לאחר לידה. אלה בדרך כלל מבודדים מהרשות הפלסטינית התנגדות הדור החמישית שלn כבש או עובר חזירי שמועבר ומורדם לפני כל נשימה ספונטנית 7-9. בנוסף, חלק מהחוקרים הצליחו לבודד ומנוצלים מPASMC מעט מבוגר ונושמים באופן ספונטני כבשים וחזרזירים ב3 ימים, 2 שבועות, ו 4 שבועות 10-12. לאחרונה, חלק מהקבוצות יש לבודד בהצלחה ומנוצלות PASMC מבודד מכבשים עם PPHN לבחון את derangements במסלולי איתות במצב המחלה 13-17. תאים אלה הוכיחו להיות כלי רב ערך כדי לבחון איזה מסלולי איתות הם קריטיים הן בכלי דם ריאתי בטווח קרוב וטווח הבריאים והחולים. עם זאת, הם לא נותנים תובנה מסלולי האיתות המושפעים בפגים עם יתר לחץ דם ריאתי. הם גם אינם מאפשרים את האפשרויות של מניפולציה גנטית ראתה במודלי עכבר של מחלה.
מודלים חולדה ועכבר היו בשימוש זמן רב למודל BPD ולאחרונה נמצאים בשימוש כדי הי"ד ריאת מודלpertension כתוצאה מהפרעת האישיות גבולית 18-22. חולדות ילודים הם מפתים לעבוד עם בשל הגודל הגדול שלהם, אבל הם גם סובלים ממחסור בפוטנציאל לשינוי גנטי. בעלי חיים מהונדסים גנטי היו בשימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעות של מטרות גן ספציפיות על פיזיולוגיה של בעלי חיים שלמים בעכברי יילודים, אך עד היום אף אחד לא מבודד בעבר בהצלחה PASMC מעכברים הקטנים האלה. על ידי בידוד PASMC, ניתן לקבל מידע רב יותר על איך לשנות מסלולים בתגובה לגירויים ו / או שינוי גנטי ספציפי בשריר חלק עורק הריאה סביבתיים. בנוסף, ניתן הדמיה החי PASMC בזמן אמת כדי לבחון שינויים מהירים במולקולות איתות מפתח כגון סידן וחמצן מינים תגובתי 23-25. לאחרונה תאר את הבידוד המוצלח של PASMC מעכברים בוגרים באמצעות וריאציה של הטכניקה של מרשל ואח'. -26 משמשים כדי לבודד חולדת PASMC 23,25,26. עכשיו יש לנו מותאםND הוארך בטכניקה זו כדי עכברים קטנים 7-21 ימים של גיל (P7, P14, P21 ו). המגבלה העיקרית לטכניקה בידוד PASMC החדשה זו היא שהיא דורשת עכברים מרובים כדי לייצר תאים מספיקים לניסויים ושהתאים גדלים באיטיות רבה, שהוא אופייני לתאי שריר חלק עיקריים. למרות מגבלות אלה, אנו מאמינים בטכניקה זו כדי לבודד PASMC עכבר ילוד תאפשר לחקירה המשופרת של מסלולי איתות המרכזיים המעורבים בהתפתחות של יתר לחץ דם ריאתי ומייצגות התקדמות משמעותית בתחום זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת נורת 'ווסטרן אישרה פרוטוקול זה.
1. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - יום אחד
- הכן את M199 מדיה המלאה - לערבב 400 מ"ל M199 עם 100 מ"ל (ריכוז סופי = 20%) FBS המומת חום ו5 מ"ל (ריכוז סופי = 1%) פניצילין / סטרפטומיצין.
- הכן את M199 תקשורת חופשי בסרום - מערבבים 500 מ"ל M199 עם 5 מ"ל (ריכוז סופי = 1%) פניצילין / סטרפטומיצין.
- הכן את Agarose הרשות הפלסטינית - מיקס 0.05 גרם agarose בתוספת 0.05 חלקיקי ברזל גרם ב 10 M199 תקשורת סטריליים, סרום ללא מ"ל.
- הכן את Agarose הריאות - מיקס 0.1 גרם agarose ב10 M199 תקשורת סטריליים, סרום ללא מ"ל.
- הכן את Collagenase - collagenase מיקס לסטריליים M199 תקשורת, סרום ללא בריכוז סופי של 80 U / מ"ל ולאחר מכן סינון סטרילי תערובת זו. הגדר את כל הציוד מבעוד מועד לפני הרדמת חסד העכבר.
- הגדרת הרשות agarose וריאות agarose לרתיחה ממש לפני הרדמת חסד העכבר.
- להרדים את העכבר בצנצנת עם חומר ההרדמה ממנת יתר isoflurane ולהיזהר שלא לאפשר את עכבר גור לבוא במגע עם isoflurane. תשואת התא הטובה ביותר מתקבלת כאשר התאים נקצרים מייד לאחר מותו על מנת להימנע ממייקרו קרישים היוצרים במחזור שלאחר מוות.
- הסר את העכבר מצנצנת ההרדמה, לאבטח את העכבר ללוח ההפעלה, ולעקר את העכבר, מכשירים, וכפפות עם אלכוהול.
- טען את האזמל עם הלהב ולחתוך את העכבר מהצוואר ועד הבטן הנחותה.
- פתח את הבטן בצד השמאל של העכבר, לחשוף את הכליות, וחתך את עורק הכליה כדי לאפשר את העכבר כדי לגרום לדימום מחודש, ובכך למנוע קרישים בכלי הדם הקטנים של הריאות.
- השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך הצד השמאלי של העכבר שלעצם החזה כדי לפתוח את בית החזה.
- להשתמש בזהירות אזמל כדי לחתוך את הסרעפת משני הצדדים ולפתוח את בית החזה באופן מלא. שימוש במלקחיים או סיכות כדי להחזיק את חלל החזה פתוח.
- היצמד קרוואנים עם מחט G ½ סנטימטר 27 מופנה כלפי הרשות הפלסטינית וperfuse RV / רשות / ריאות עם PBS סטרילי עד שהריאות מופיעות לבנה (כל הדם סמוק מתוך מחזור הדם הריאתי). זה ייקח כ 3-5 מ"ל של PBS תלוי בגודל של העכבר. חשוב לשטוף ראשון כדי למנוע היווצרות קריש דם בכלי דם הריאה קטנה.
- להשתמש בזהירות לנתיחה בוטה לחשוף את קנה הנשימה וחוט אחד מתחת לתפר.
- שים את המלקחיים הקטנים שמתחת לקנה הנשימה על תמיכה ולמקם G angiocatheter 24 לתוך קנה הנשימה. הנח את angiocatheter כאילו הצבת IV.
- אבטח את angiocatheter לתוך קנה הנשימה עם התפר מושחל בשלב 1.16.
- קח רותחת רשות agarose מחוץ למים רותחים, ולהפוך למערבבים היטב. לקרר את agarose כ טמפרטורת גוף על ידי מתערבל על קרח. Agarose צריכה להישאר בתמיסה, אך לא תהיה כל כך חם שזה יגרום ניזק לתאים של הרשות הפלסטינית.
- היצמד קרוואנים עם 27-G ½ אינץ' ומחט perfuse RV / הרשות / ריאות עם הרשות הפלסטינית עד agarose הריאות מופיעות אפורות. את חלקיקי הברזל בתערובת agarose יגרמו לריאות מופיעות בצבע אפורה. זה ייקח כ 3-5 מ"ל של הרשות הפלסטינית agarose תלוי בגודל של העכבר. כמו כן, חשוב ללכת לאט כמו הזרקה מהירה מדי עלול לגרום לברזל לדלוף לתוך דרכי הנשימה.
- קח את ריאות agarose מחוץ למים רותחים ולהפוך למערבבים היטב. לאחר מכן לקרר את agarose לכ טמפרטורת גוף על ידי מתערבל על קרח. Agarose צריכה להישאר בתמיסה, אך לא תהיה כל כך חם שזה יגרום ניזק לתאים של הריאות.
- צייר את ריאות agarose ולצרף את המזרק לangiocatheter G 24 בקנה הנשימה. להשרות את agarose דרך קנה נשימה כדי לנפח באופן מלא את הריאות. הריאות תהיה easieR כדי לרכך (ראה שלבים מאוחרים יותר), אם לריאות מנופחות כראוי.
- הסר את גוש לב הריאה, ולהטביע אותו לתוך 25 מ"ל של הקרח הקר PBS כדי לחזק את agarose (~ 5 דקות). השתמש בזמן זה כדי לנקות את אזור הניתוח.
- לעכברים בילוד (P7-p21), תשואת PASMC הטובה ביותר מגיעה משילוב של 2-3 גורים למנה אחת של תאים. PASMC מעדיף להיות במגע עם תאים אחרים לבריאות תא אופטימלית ולצמיחה. אם עכבר של אחד משמש לבידוד, ולאחר מכן את התאים מאוד דלילים ולא צומחים היטב. כאשר שילוב בעלי חיים, קציר ומקרר את גושי לב הריאה ביחד ולאחר מכן לעבור למיותר ברגע שהסירו את כל גושי לב הריאה מבעלי החיים.
- מעבר למכסת מנוע תרבית התאים על סטריליות מנקודה זו ואילך.
- מניחים את הריאות מצוננות לתוך המכסה של צלחת תרבית רקמת 10 ס"מ ולהסיר את הלב, בלוטת התימוס, קנה נשימה, וכל רקמת חיבור מהריאות בזהירות.
- הזז את הריאות לתחתית צלחת תרבית רקמת 10 ס"מולהוסיף כ 1 מ"ל קר כקרח PBS סטרילי.
- ברר את הריאות לחתיכות קטנות מאוד (1-2 מ"מ) עם 2 אזמלים.
- לשבור את הקצה של פיפטה סטרילית 5 מ"ל סרולוגית. פיפטה טחון תרחיף ריאות לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. השתמש קר כקרח PBS סטרילי נוסף כדי לשטוף את הצלחת על מנת להבטיח כי כל רקמת הריאות מקבל לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- מניחים את צינור חרוטי 50 מ"ל על גבי מגנט. חכה לרקמות המכילות ברזל כדי לעבור לצד של הצינור ליד המגנט. בהתאם ליחס של כלי המכיל ברזל לרקמת ריאה, חלק מכלי השיט, עדיין עשוי להיות צף בשלב זה. לשאוב את PBS לאט ובזהירות מנסה לא לשאוב רקמת ריאה הצפה מאחר ולא ברור אם הוא מכיל כלי דם.
- שטוף את ריאות גלולה 3x עם 5 מ"ל סטרילי PBS, שוב מנסה למזער את כמות רקמת ריאה שהוא aspirated.
- Resuspend גלולה הריאות במ"ל collagenase 3 ויוצקים לתוך צלחת תרבית רקמת 60 מ"מ. לאאנסה פיפטה זה; את נתחי הריאה יידבקו לפנים שלך פיפטה.
- השתמש 3 מ"ל נוסף כדי לשטוף את הצינור לאחר המזיגה, ויוצקים את זה לתוך צלחת תרבית רקמת 60 מ"מ גם כן.
- מקום ל37 ° C תרבות רקמות חממה במשך שעה 1.
- רקמת פיפטה + תרחיף עד collagenase ולמטה עם מחט 15 G בוטה במזרק 5 מ"ל עד שכל חלקי הריאה הגדולים הם שיבשו. הרקמה + תרחיף collagenase יהיה מעונן, בשלב זה ללא גושי רקמה נראים לעין.
- יוצקים לתוך צינור חדש 50 מ"ל סטרילי חרוטי ולצרף אל המגנט.
- לשטוף את צלחת רקמת התרבות עם כ 5 מ"ל של M199 תקשורת להשלים כדי להבטיח כי כל הרקמה כבר נאספו, ושופך את זה לתוך צינור חרוטי.
- לשאוב את collagenase + תקשורת supernatant. הפעם יהיה מעט מאוד floaters, וגלולה המכילה ברזל קומפקטית תהיה בצד של צינור חרוטי ליד המגנט.
- לשטוף עם 5 מ"ל מלא מדIA 3x. זה נדרש כדי להשבית collagenase.
- הוסף 3 מ"ל של מדיה מלאה, ומערבבים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend את הכדור המכיל ברזל.
- יוצקים את גלולה המושעית לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. באמצעות מיקרוסקופ, יהיו שברי כלי שיט קטנים מרחפים עם חלקיקי ברזל הכלולים בלומן הכלי.
- מניחים את צלחת תרבית הרקמה (שכותרתו צלחת אפס) בתרבית רקמת החממה בן לילה. התאים הראשונים להגר מחוץ לצלחת אפס כ -50 fibroblasts% ו -50% PASMC, המבוסס על סמנים לצביעת שריר חלק. צלחת זה נקראת אפס מצופה וסופו של דבר, לאחר שהושלכה את צעדי העשרה שלאחר מכן.
2. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - היום השני
- יוצקים את תקשורת supernatant מצלחת אפס לתוך צינור נקי 50 מיליליטר חרוטי.
- לשאוב את supernatant התקשורת. הפעם לא יהיה כמעט שום floaters, וברזל conta קומפקטיining גלולה תהווה בצד של צינור חרוטי ליד המגנט.
- לשטוף עם 5 מ"ל מדיה מלאה 3X.
- הוסף 3 מ"ל של מדיה מלאה, ומערבבים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend את הכדור המכיל ברזל.
- יוצקים לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. באמצעות מיקרוסקופ, שברי כלי שיט קטנים מרחפים עם חלקיקי ברזל הכלולים בלומן כלי נתפסים. זו תהיה צלחת אחד (איור 1 א).
- מניחים את צלחת תרבית הרקמה בתרבית רקמת החממה.
3. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - ששת ימים
- יוצקים את תקשורת supernatant מצלחת אחת לתוך צינור נקי 50 מיליליטר חרוטי. חוזר על פעולה זו מספר פעמים שיש לי מבטח את כל תאי שריר חלק התושב בקיר של כלי שיט הזדמנות להעביר אותו על צלחת תרבית תאים. יש תמורה הולכת ופוחתת עם כל צעד כלומר כל צלחת תהיה פחות ופחות תאים לדבוק.
- לשאוב את supernatant התקשורת. הפעם לא יהיה כמעט שום floaters, וגלולה המכילה ברזל קומפקטית תהווה בצד של צינור חרוטי ליד המגנט.
- לשטוף עם 5 מ"ל מדיה מלאה 3X.
- הוסף 3 מ"ל של מדיה מלאה, ומערבבים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend את הכדור המכיל ברזל.
- יוצקים לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. באמצעות מיקרוסקופ, שברי כלי שיט קטנים מרחפים עם חלקיקי ברזל הכלולים בלומן כלי נתפסים. זו תהיה צלחת שתיים.
- מניחים את צלחת תרבית הרקמה בתרבית רקמת החממה.
4. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - יום תשיעי
- יוצקים את supernatant התקשורת מצלחת צלחת תרבית הרקמה שתיים לתוך צינור נקי 50 מיליליטר חרוטי.
- צלחת Refeed שתיים עם M199 מדיה מלאה, ואת המקום בחזרה לתרבית הרקמהחממה.
- לשאוב את supernatant התקשורת. הפעם לא יהיה כמעט שום floaters, וגלולה המכילה ברזל קומפקטית תהווה בצד של צינור חרוטי ליד המגנט.
- לשטוף עם 5 מ"ל מדיה מלאה 3X.
- הוסף 3 מ"ל של מדיה מלאה ולערבב למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend את הכדור המכיל ברזל.
- יוצקים לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. באמצעות מיקרוסקופ, שברי כלי שיט קטנים מרחפים עם חלקיקי ברזל הכלולים בלומן כלי נתפסים. זו תהיה צלחת שלוש.
- מניחים את צלחת תרבית הרקמה בתרבית רקמת החממה.
5. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - שלוש עשרה יום
- לשאוב את התקשורת מצלחות 1-3.
- לשטוף בעדינות את התאים עם חם, PBS סטרילית.
- הוסף סרט דק של טריפסין (~ 0.25-0.5 מ"ל) טריפסין לכל צלחת לtrypsinize את תאים. תאים מאוד חסיד ויצטרכו להיות בטריפסין ברקמת cultuמחדש בחממה במשך כ 10 דקות כדי להרים את הצלחת.
- תאים מצלחות קציר לתוך 5 מ"ל מדיה מלאה בצינור חרוטי 50 מ"ל מצורף למגנט לשלוף את כל חלקיקי ברזל שיורית.
- לשטוף כל אחת מהצלחות עם 0.5 מ"ל נוסף של מדיה מלאה ולהוסיף שתקשורת לצינור חרוטי 50 מ"ל.
- הפעם, תיקח את supernatant התקשורת (לא לשאוב), וזורקים את חלקיקי ברזל גלולה.
- פלייט התאים ב5 מ"ל M199 תקשורת להשלים בצלחת 60 מ"מ יש תאי מחוברות בכמה ימים. לחלופין, צלחת התאים ב10 M199 מ"ל תקשורת המלאה בצלחת 10 ס"מ, וPASMC ייקחו עוד כ 1-2 שבועות כדי להגיע לנקודת מפגש.
6. בידוד ריאתי עורקים מעכברים ילודים - יום ארבעה עשר
- לשנות את התקשורת לM199 תקשורת להשלים טרי כדי להסיר כל טריפסין שיורית. יהיה אוכלוסייה דקה של PASMC על צלחת תרבית הרקמה (איור 1).
7. טיפול שגרתי
- לשנות את התקשורת לM199 תקשורת להשלים טרי כ 2x בשבוע.
- בזמן חלוקת תאים אלה, כ -10 דקות בחממה בסרט של טריפסין (0.25-0.5 מ"ל) נדרש לתאים כדי להרים את הצלחת. באמצעות סרט טריפסין מאפשר replating של PASMC בלי ספינינג את התאים. אם משתמשים יותר מדי טריפסין, ולאחר מכן PASMC יש centrifuged להסתובב בחוץ טריפסין, או התאים לא readhere לצלחת. לפעמים, אחרי שצנח לתאים, קשה לקבל את PASMC resuspended לM199 מדיה מלאה.
- בתצפיות, PASMC המבודד מתנהג כמו תאי שריר חלק מהימן עבור 4-5 קטעים, אבל את התאים המבודדים יהיו כתם לתא שריר חלק סמנים עד חלוף 7. לספור 60 מ"מ נקווה ראשון או 10 ס"מ על צלחת שלוש עשרה יום כחלוף 2 (ציפוי לאחר החשיפה הראשונה לטריפסין).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך ואחרי הבידוד, PASMC נבחנים גם על ידי מיקרוסקופ אור ועל ידי immunostaining לסמני תא שריר חלק. על ידי מיקרוסקופ אור בתחילת הפרוטוקול, PASMC נתפסים נודד על גבי צלחת תרבית הרקמה מהברזל הקטן המכיל כלי (איור 1 א). לאחר איגום צלחות אחד עד שלושה בשלושה עשרה יום, ולאחר מכן חלקיקי ברזל הם כבר לא ראו כמו אלה כבר הוציאו בצעד איגום הסופי. במקום זאת, אוכלוסייה של PASMC הוא ראה על צלחת תרבית הרקמה (איור 1).
בהתבסס על immunostaining, התאים הראשוניים שנודדים מהכולים המכילים ברזל הם כ 50% וfibroblasts PASMC 50% (מידע לא מוצג). מאז יש לי fibroblasts יתרון צמיחה משמעותי, fibroblasts יהיה מעל לגדול יותר זמן PASMC על אפס צלחת. מסיבה זו, אפס צלחת נמחקת ברגע שיש PASMC בבירור מבודד על הצלחות שלאחר מכן. לאחר איחוד, האוכלוסייהשל PASMC הוא> PASMC 90% שהכתם חיוביים עבור שניהם שרירים שרירן α-חלק וdesmin (איור 2). כשצלם ב20X, תאים דמויי כישור מרובים נראים בקנה אחד עם פנוטיפ תא שריר חלק (איור 2 א). כשצלם בהגדלה גבוהה יותר (40X), lamellopodia של הקצה המוביל של תאים בודדים הם דמיינו שהם נודדים ולגדול לקראת תאי שריר חלק אחרים בצלחת (איור 2).
Phosphodiesterase 5 (PDE5) באו לידי ביטוי בPASMC וhydrolyzes cGMP, מתווך מפתח של טון כלי דם, לGMP פעיל. ירידה בPDE5 משחק תפקיד קריטי במעבר כלי דם ריאתי התקין לאחר לידה. במודלים של בעלי חיים גדולים, PDE5 מוסדר התפתחותית לאורך הריון, והביטוי ואת פעילותה באופן דרמטי נופלים לאחר לידת 27. על מנת לאשר כי אלה PASMC המבודד לשמור על הפנוטיפ בקנה אחד עם השלב ההתפתחותי שלהם, בדקנו PDE5 Enzפעילות yme בעכבר PASMC מבודדת מP7, P14, וp21 לעכברים, כמו גם עכברים בוגרים. אנו רואים את הרמות הגבוהות ביותר של פעילות PDE5 בPASMC מבודדת מעכברי P7. רמות אלו נופלות בPASMC מבודד מP14 P21 ועכברים. הרמות הנמוכים ביותר של פעילות PDE5 הם ציינו בPASMC מבודד מעכברים בוגרים (איור 3).
איור 1. PASMC ילודים דמיינו ידי מיקרוסקופ אור. PASMC הם דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור ב20X.) ביום שלישי של הפרוטוקול, ניתן לראות בצורת PASMC ציר נודד מהרשות הפלסטינית הקטנה מלאה בברזל השחורה על גבי צלחת בתרבית הרקמה. ב ') ביום ארבעה עשר לאחר איחוד, אוכלוסייה של PASMC ניתן לראות על הצלחת בתרבית הרקמה.
איור 2. PASMC ילודים כתם חיובי עבור סמני שריר חלק. PASMC היו מצופה על coverslips הזכוכית שטופלו בקולגן, קבוע בפורמלין 4%, וpermeabilized עם 0.2% Triton-X כפי שתואר לעיל 7,23.) PASMC מP7, P14, P21 ו עכברים היו מוכתמים בשרירן נגד חלקה שריר (1:2,000 דילול) ב5% BSA, ואחריו rhodamine אדום נגד ארנב משני בדילול 1:200 אנטי desmin (1:200 דילול) או. הקרינה הייתה דמיינו עם מיקרוסקופ epifluorescence ב20X. ב ') PASMC מP14, p21 ולעכברים הוכתמו שרירן שריר חלק או אנטי desmin כאמור לעיל, והקרינה הייתה דמיין כאמור לעיל ב40X.
איור 3. Phosphodiesterase 5 פעילות (PDE5) היאמוסדר התפתחותית בPASMC. PASMC נקצרו לחלבון כולל וassayed לPDE5 פעילות האנזימטית כפי שתואר לעיל באמצעות מחזורי colorimetric זמין מסחרי נוקלאוטיד phosphodiesterase assay ערכה 7. כל דגימה הוקראה ± sildenafil (100 ננומטר). ההבדל בין pmol הידרוליזה cGMP לחלבון כולל מ"ג לדקת ± sildenafil מייצג את פעילות cGMP-hydrolytic PDE5 הספציפית. N = 4 עבור P7 PASMC, N = 10 עבור P14 PASMC, n = 4 לP21 PASMC, וN = 8 למבוגר PASMC. * P <0.05 לעומת P7 PASMC, # p <0.05 לעומת P14 PASMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים בפעם הראשונה את הבידוד של PASMC מעכברים בP7, P14, P21 ו. על מנת להשיג זאת, תרחיף של agarose ו -0.2 חלקיקי ברזל מיקרומטר הם חדורים דרך קרוואנים לרשות הפלסטינית. בשל גודלו הקטן של חלקיקי הברזל, הם לא יכולים לעבור דרך מיטת נימי ריאה ומופקדת ברשות הפלסטינית ובכך הקטנה. הריאות הן מנופחים, הוסרו וניתקה. הכלים המכילים ברזל שלף של פתרון באמצעות מגנט. סופו של דבר, את כלי צופה לתוך צלחת תרבית רקמה, ותאים נודדים מהכולים לצלחת והתרבות. הצלחת הראשונית של תאים היא תערובת של fibroblasts וPASMC, ולמשוך למטה בהליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי לגזור אוכלוסיית PASMC מועשרת. עם חשיפה ממושכת לרמות גבוהות, קיים סיכון תיאורטי שיורית ברזל עשוי להשפיע על איזון חיזור בתוך התאים המבודדים. לפיכך, טיפול נלקח בשלב האחרון כדי להסיר את כל הברזל שיוריתלפני איחוד והפצת התאים. Immunostaining לα-שרירן שריר חלק וdesmin נעשה כדי לאשר שהאוכלוסייה המועשרת היא> 90% PASMC. תאים אלה PDE5 פעילות האנזימטית, עולים בקנה אחד עם פנוטיפ תא שריר חלק בכלי הדם. מעניין לציין, כי פעילות האנזים PDE5 היא שונה בPASMC מבודד מעכברים בגילים שונים, המצביעה על המשך רגולציה התפתחותית בתוך PASMC לאחר בידוד.
אמנם שיטה זו היא פשוטה מאוד מבחינה אינטלקטואלית, בעיה נפוצה היא תשואה נמוכה של PASMC. לא יכול להיות סיבות רבות לבעיה זו, גם כאשר 2-3 עכברים הם אספו יחד. ראשית, תשואת התא הטובה ביותר מושגת אם הליך הבידוד הוא שיזם מייד לאחר העכבר נכנע למנת יתר isoflurane. ברגע שמוות אירע צורת מיקרו קרישים, לאורך מיטת כלי הדם. קרישי דם אלו בכלי דם ריאתי ימנעו את חלקיקי הברזל להגיע אל כמה שיותר קטנה הרשות הפלסטינית, ובכך דהקמטים התשואה. כמו כן, את הכדאיות של PASMC המבודד הופכת לדאגה גדולה יותר הוא העכבר מת לפני הבידוד. צעד מפתח המוחלט שמשפיע על תשואת PASMC הוא עירוי הברזל. אם הריאות אינן ניכר אפורות לאחר עירוי הברזל, הסיבות האפשריות הן: 1) הברזל הולך מדרדר אל המבואה ובכבד, 2 ימין) יש חור או קרע בקרוואנים, או 3) יש מיקרו קרישים במחזור דם ריאתי באיזה מקום למנוע עירוי ברזל טוב. לבסוף, יש לנו לב שPASMC מבודד מזנים מהונדסים גנטי שונים של עכברים מפגין שיעורי צמיחה שונים לחלוטין בתרבות לאחר בידוד. לכן, בעת הניסיון ראשון בטכניקה זו, עדיף להשתמש בזן פראי סוג של עכברים.
ברור שזיהום הוא דאגה כל זמן מבודד את תאים מכל בעלי חיים. כל המכשירים הם מעוקרים וניגב עם אלכוהול לפני ההליך, ולאחר מכן פעם גוש לב הריאה מוסר, אלl מהשלבים הבאים נעשים במכסת מנוע בתרבית רקמה עם טכניקה סטרילית. שימוש באמצעי זהירות אלה, יחד עם אמצעי תקשורת המכיל אנטיביוטיקה ביטלו למעשה כל זיהום.
עם הבידוד של כל שורת תאים ראשונית, קיים חשש לגבי כמה זמן תא ישמור על הפנוטיפ שלה בתרבות. מבודד משליטה וכבשי PPHN כבש FPASMC לשמור על הפנוטיפ שריר החלק שלהם במשך 8 ו -5 קטעים, בהתאמה 7,14. לPASMC העכבר, התאים מתחילים לאבד את תגובות איתות על ידי חלוף 5 וסמני שריר חלק של קטע 7 (מידע לא מוצג). זה מדגיש את אחת המגבלות של טכניקה זו. עכברים מרובים נדרשים כדי להשיג כמויות קטנות של תאים, והזמן מבידוד למספיק תאים לניסויים ארוך; 2-4 שבועות בהתאם למספר התאים הדרושים. לבסוף, ברגע שתאים מבודדים, צריך רק שלושה קטעים לעבוד איתם לפני שהם מאבדים את תא שריר חלקם איתותתגובות. אזור אחד פוטנציאל לשיפור יהיה לפתח שיטה לפיה תאים אלה יכולים להיות קפוא והתאוששו בהצלחה מחנקן נוזלי. הדבר זה יאפשר למעבדה כדי להפוך באופן קבוע ולהקפיא את התאים כמו עכברים זמינים, ולאחר מכן חוקרים יכולים להפשיר ולנצל את התאים לניסויים כנדרשים.
למרות האתגר הטכני של ביצוע הבידוד וציר הזמן הארוך לבידוד, PASMC אלה מייצגים כלי חדשני ורב ערך לחקר מסלולי איתות בכלי דם ריאתי העכברי פיתוח. אנו מאמינים בטכניקה זו כדי לבודד PASMC עכבר ילוד תאפשר לחקירה המשופרת של מסלולי איתות המרכזיים המעורבים בהתפתחות של יתר לחץ דם ריאתי, אשר יוביל להבנה טובה יותר של היווצרות המחלה ולאפשר פיתוח של טיפולים חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL109478 (KNF). החוקרים מכירים בכך ומודים לג'ינה וג'ואן קים טיילור על עזרתם בבידוד ושמירת PASMC בתרבות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
