Summary
Мы разработали новый и воспроизводимой техники для изоляции первичных культурах легочной артерии гладкомышечных клеток (PASMC) от мышей в возрасте P7, что позволяет лучше изучения сигнальных путей, участвующих в неонатальном сокращение гладких мышечных клеток и релаксации.
Abstract
Легочная гипертензия является одной из основных причин заболеваемости и смертности у детей. Исторически сложилось, что имело место значительное изучения сигнальных путей, участвующих в сосудистых гладких мышц в PASMC от плода овцы. В то время как овцы сделать отличную модель термин легочной гипертензии, они очень дорогие и не имеют преимущества генетических манипуляций нашли у мышей. И наоборот, невозможность изолировать PASMC от мышей значительное ограничение этой системы. Здесь мы описали выделение первичных культурах мышь PASMC от Р7, Р14, Р21 и мышей с использованием изменения ранее описанных техники Marshall и соавт. 26, который ранее был использован для изоляции крысы PASMC. Эти мышиный PASMC представляют собой новый инструмент для изучения путей передачи сигналов в неонатальном периоде. Вкратце, суспензию 0,5% (м / о) агарозном + 0.5% частиц железа в M199 медиа вливается в легочной сосудистого русла через правый желудочек (RV).частицы железа 0,2 мкм в диаметре и не может пройти через легочную капиллярного русла. Таким образом, железо лож в небольших легочных артерий (ПА). Легкие надуваются агарозы, удалены и диссоциированных. Железосодержащих суда снесены с помощью магнита. После коллагеназы (80 ед / мл) очистки и дальнейшей диссоциации, сосуды помещают в чашку для культуры ткани в M199 среде, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики (M199 полной среде), чтобы позволить миграции клеток на чашку для культивирования . Этот начальный пластине клеток 50-50 смесь фибробластов и PASMC. Таким образом, выпадающее процедура повторяется несколько раз, чтобы получить более чистый PASMC населения и удаления остаточного железа. Гладкая мышечная клетка идентичности подтверждается иммуноокрашивания для гладких мышц миозин и десмин.
Introduction
Легочной гипертензии во время нормальной внутриутробной жизни, так как плацента служит основным органом газообмена и только 10% от сердечного выброса циркулирует через легочные сосудистые кровать. В утробе матери, легочные давления аналогичны системного давления из-за повышенной легочной сосудистое сопротивление . Как беременность прогрессирует, наблюдается бурный рост малых PA в легких, что готовит для плода резкое увеличение легочного кровотока, которое происходит при рождении 1. Когда нормальные перинатальные переход терпит неудачу в краткосрочной и доношенных новорожденных, то в результате постоянной легочной гипертензии у новорожденных (PPHN). PPHN это клинический синдром, вызванный много различных основных патологий. Однако, все эти дети имеют общие патофизиологические особенности, такие как повышенное легочное сосудистое сопротивление, гипоксемии и право-налево шунтирование кровотока плода стойких соединений, таких как открытый артериальный проток илиАминь овальное. PPHN влияет 2-6 на 1000 живорожденных и передает 8-10% риска смертности, а также значительные краткосрочные и долгосрочные заболеваемости 2. Кроме того, очень низкий вес при рождении недоношенных детей может развиться легочная гипертензия в результате их основное заболевание легких. Наиболее распространенными основного заболевания легких недоношенных детей бронхолегочной дисплазии (БЛД). Хотя общий риск БЛД коррелирует с гестационного возраста и массы тела при рождении, остается непонятным, почему подмножество этих детей развивается значительное легочной гипертензии и, как надлежащим образом относиться к этим детям. Неблагоприятные исходы, в том числе длительные госпитализации и повышенной смертности, являются общими 3-6.
Исторически сложилось так, фетального овечьего PASMC или свиной фетальной PASMC от здоровых животных были использованы для изучения сигнальных путей, участвующих в нормальных легочных сосудов переход после рождения. Как правило, они изолированы от пятой PA сопротивление поколенияN овечий или свиной плода, которая поставляется и эвтаназии до любого спонтанного дыхания 7-9. Кроме того, некоторые исследователи выделили и использовали PASMC от чуть старше и спонтанном дыхании ягнят и поросят на 3 дня, 2 недели и 4 недели 10-12. В последнее время некоторые группы успешно выделены и использованы PASMC изолированы от ягнят с PPHN для изучения расстройств в сигнальных путях в болезненном состоянии 13-17. Эти клетки оказались ценным инструментом для изучения сигнальных путей, которые имеют решающее значение как в нормальной и больной краткосрочные и срочные легочных сосудах. Тем не менее, они не дают представления о сигнальных путях воздействия у недоношенных детей с легочной гипертензией. Они также не позволяют возможности генетической манипуляции видно на модели мыши заболевания.
Крысы и мыши модели уже давно используются для моделирования баррелей в сутки, в последнее время используются для модели HY легочнойpertension результате BPD 18-22. Новорожденных крыс соблазняют работать с из-за их больших размеров, но они также страдают от недостатка потенциал для генетической модификации. Генетически модифицированные животные широко используются для исследования влияния конкретных задач гена на весь физиологии животных у новорожденных мышей, но на сегодняшний день никто не ранее успешно изолированы PASMC из этих маленьких мышей. Выделяя PASMC, больше информации можно получить о том, как изменить пути в ответ на стимулы окружающей среды и / или генетической модификации в частности, в легочной артерии гладкие мышцы. Кроме того, живые PASMC могут быть отображены в режиме реального времени для изучения быстрых изменений в ключевых сигнальных молекул, таких как кальций и активные формы кислорода 23-25. Недавно мы описали успешная изоляции PASMC от взрослых мышей с использованием варианта техники Marshall и соавт. 26 используется для изоляции крысы PASMC 23,25,26. Теперь мы приспособилисьй распространил эту технику для небольших мышей 7-21 дневного возраста (P7, P14, P21 и). Основным ограничением к этой новой технике PASMC изоляции является то, что он требует несколько мышей генерировать достаточный клеток для экспериментов и, что клетки растут очень медленно, что характерно для первичного гладкомышечных клеток. Несмотря на эти ограничения, мы считаем эту технику, чтобы изолировать новорожденных PASMC мыши позволит расширенные исследования ключевых сигнальных путей, участвующих в развитии легочной гипертензии и представляет собой значительный шаг вперед в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональные уходу и использованию животных комитета Северо-западного университета утвержденным настоящим Протоколом.
1. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - День первый
- Подготовьте Полное M199 медиа - Смешать 400 мл M199 с 100 мл (конечная концентрация = 20%), инактивированной нагреванием FBS и 5 мл (конечная концентрация = 1%), пенициллина / стрептомицина.
- Подготовьте бессывороточную M199 Медиа - Смешать 500 мл M199 с 5 мл (конечная концентрация = 1%) пенициллина / стрептомицина.
- Подготовьте PA Агароза - Mix 0,05 г агарозы плюс 0,05 г частиц железа в 10 мл стерильного, бессывороточную M199 СМИ.
- Подготовьте легких Агароза - Mix 0,1 г агарозы в 10 мл стерильного, бессывороточную M199 СМИ.
- Подготовьте коллагеназы - Mix коллагеназы в стерильные бессывороточной M199 сред при конечной концентрации 80 ед / мл, а затем стерильный фильтр этой смеси. Установить все оборудование загодя до эвтаназии мыши.
- Установить PA агарозы и легких агарозы до кипения прямо перед эвтаназии мыши.
- Усыпить мышь в банку с анестетиком изофлурана передозировки и быть осторожными, чтобы не допустить мыши щенка вступают в контакт с изофлурана. Лучший выход клеток получается, когда клетки собирают сразу после смерти, чтобы избежать микро-сгустки, которые образуются в обращении после смерти.
- Отключив мышь из банки анестетик, закрепите мыши, чтобы операционная доска, и стерилизовать мыши, инструменты и перчатки с алкоголем.
- Загрузите скальпеля с лезвием надрезать и мыши от шеи до нижнего живота.
- Откройте живота с левой стороны мыши, подвергать почки, а также сокращение почечной артерии, чтобы обескровить мыши, что позволяет избежать тромбов в мелких сосудах легких.
- Используйте ножницы, чтобы разрезать вдоль левой стороны мыши изгрудины, чтобы открыть грудную клетку.
- Осторожно использовать скальпель, чтобы сократить диафрагму с обеих сторон и полностью открыть грудной полости. Используйте пинцет или булавки провести грудной полости открытым.
- Придерживайтесь RV с 27 G ½ дюйма иглы направлены ПА и заливать RV / PA / легких стерильной PBS, пока легкие не появляются белые (все крови вымываются из малого круга кровообращения). Это займет примерно 3-5 мл PBS в зависимости от размера мыши. Важно, чтобы смыть первым для предотвращения свертывания крови в мелких сосудов легких.
- Осторожно использовать тупым, чтобы разоблачить трахеи и одной нитью под швом.
- Положите наименьший щипцов под трахеи за поддержку и разместить 24 ангиокатетер G в трахею. Поместите ангиокатетер как будто размещении IV.
- Закрепите ангиокатетер в трахею с резьбой шва в шаге 1.16.
- Возьмите кипения PA агарозы из кипятка, и инвертировать хорошо перемешать. Охладите Agaroсебе примерно до температуры тела, вращая на льду. Агарозы должна оставаться в растворе, но не быть такой горячей, что это может повредить клетки ПА.
- Придерживайтесь RV с 27 G ½ дюйма иглы и заливать RV / PA / легкие PA агарозы, пока легкие не выглядят серыми. Частицы железа в смеси агарозы сделает легкие серым цветом. Это займет примерно 3-5 мл PA агарозы в зависимости от размера мыши. Важно также, чтобы идти медленно, как потребители инъекционных слишком быстро может привести к утечке железа в дыхательные пути.
- Возьмите легкие агарозы из кипящей воды и перевернуть, чтобы хорошо перемешать. Затем охладить агарозном примерно температуры тела по закрученной на льду. Агарозы должна оставаться в растворе, но не быть такой горячей, что это может повредить клетки легких.
- Составьте легких агарозы и приложить шприц к 24 ангиокатетер G в трахее. Настаивать агарозы через трахею, чтобы полностью наполнить легкие. Легких будет easieR Для фарша (см. ниже шагов) если легкие надлежащим завышены.
- Снимите сердце-легкие блока, и погрузить его в 25 мл ледяной PBS, чтобы укрепить агарозы (~ 5 мин). Используйте это время, чтобы очистить хирургической области.
- Для новорожденных мышей (P7-P21), лучший выход PASMC происходит от сочетания 2-3 щенков в одну партию клеток. PASMC предпочитают быть в контакте с другими клетками для оптимального здоровья и рост клеток. Если одна мышь используется в изоляции, то клетки очень редко и плохо растут. При объединении животных, сбора урожая и холод сердце-легкие блоки вместе, а затем переехать в мясорубке, когда все сердце-легкие блоки были сняты с животных.
- Переместить в капот культуре клеток на стерильность с этого момента.
- Поместите охлажденные легких в крышке 10 см чашку для культуры ткани и осторожно удалить сердце, тимус, трахеи, и любой из соединительной ткани легких.
- Перемещение легких в нижней части 10 см чашку для культуры ткании добавить примерно 1 мл ледяной стерильной PBS.
- Фарш легких на очень мелкие кусочки (1-2 мм) с 2 скальпели.
- Перерыв кончик прочь стерильные 5 мл серологические пипетки. Внесите фарш легких суспензии в стерильные 50 мл коническую трубку. Используйте дополнительные стерильные ледяным PBS мыть плиту чтобы гарантировать, что все ткани легких попадает в 50 мл коническую трубку.
- Поместите 50 мл коническую трубку на магните. Дождитесь железосодержащих ткани перейти на стороне трубки рядом с магнитом. В зависимости от соотношения железосодержащих судно в легочной ткани, некоторые из сосудов может все еще завис в этой точке. Аспирируйте от PBS медленно и осторожно, стараясь не аспирации ткани легкого плавающего поскольку неясно, если он содержит сосуды.
- Промыть легких гранул 3 раза с 5 мл стерильного PBS, снова пытается уменьшить количество легочной ткани, что отсасывали.
- Ресуспендируйте легких осадок в 3 мл коллагеназы и вылить в 60 мм блюдо культуры ткани. Непопытаться пипетки это; легких кусками будет придерживаться интерьер вашего пипетки.
- Используйте дополнительные 3 мл для промывки труб после заливки, и залить это в 60 мм блюдо культуры ткани, а также.
- Место в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 1 часа.
- Внесите ткани + коллагеназе суспензии вверх и вниз с 15 G тупой иглой на 5 мл шприц, пока все большие куски легких не нарушена. Ткань + коллагеназе суспензия будет облачно в этот момент без видимых кусков ткани.
- Налейте в новые стерильные 50 мл коническую трубку и приложить к магниту.
- Промыть блюдо культуры тканей с приблизительно 5 мл полной среды М199, чтобы гарантировать, что все ткани были собраны, и вылить это в коническую трубку.
- Аспирируйте от коллагеназы + СМИ супернатант. На этот раз будет очень мало плавающие и компактный железосодержащих гранул будет на стороне коническую трубку рядом с магнитом.
- Промыть 5 мл полной MedИ.А. 3x. Это необходимо для инактивации коллагеназы.
- Добавьте 3 мл полной среды, и смешать вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендируйте железосодержащих гранул.
- Вылейте Ресуспендированный осадок в 35 мм блюдо культуры ткани. С помощью микроскопа, что будет небольшая фрагменты судна, плавающие вокруг с частицами железа, содержащегося в просвете сосуда.
- Место блюдо культуры ткани (обозначение пластины ноль) в культуре ткани инкубаторе в течение ночи. Первый клеток мигрировать на тарелку с нуля примерно 50% фибробластов и 50% PASMC, основанный на окрашивание на маркеры гладких мышц. Эта пластина называется покрытием нулю, и в конечном счете отбрасывается после последующих стадий обогащения.
2. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - день второй
- Вылейте СМИ супернатант из пластины нуля в чистый 50 мл коническую трубку.
- Аспирируйте от средств массовой информации супернатант. На этот раз не будет почти никаких плавающих предметов, и компактного железа Containing гранулы образуют на стороне коническую трубку рядом с магнитом.
- Промыть 5 мл полной среды 3x.
- Добавьте 3 мл полной среды, и смешать вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендируйте железосодержащих гранул.
- Налейте в 35 мм блюдо культуры ткани. С помощью микроскопа, небольшие фрагменты плавает судно с железом частиц, содержащихся в просвет сосуда не видно. Это будет одной пластине (рис. 1А).
- Место блюдо культуры ткани в культуре ткани инкубатора.
3. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - День шестой
- Вылейте СМИ супернатант из одной пластины в чистый 50 мл коническую трубку. Повторяя этот шаг несколько раз гарантирует, что все клетки гладких мышц проживающих в стенке сосуда имеют возможность мигрировать с на пластине культуры клеток. Существует убывающей отдачи с каждым шагом т.е. каждая пластина будет все меньше и меньше клетки придерживаются.
- Аспирируйте от средств массовой информации супернатант. На этот раз не будет почти никаких плавающих и компактной железосодержащие гранулы образуют на стороне коническую трубку рядом с магнитом.
- Промыть 5 мл полной среды 3x.
- Добавьте 3 мл полной среды, и смешать вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендируйте железосодержащих гранул.
- Налейте в 35 мм блюдо культуры ткани. С помощью микроскопа, небольшие фрагменты плавает судно с железом частиц, содержащихся в просвет сосуда не видно. Это будет пластине два.
- Место блюдо культуры ткани в культуре ткани инкубатора.
4. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - День девятый
- Вылейте СМИ супернатанта из культуры тканей блюдо пластины два в чистый 50 мл коническую трубку.
- Подпитку пластины два с полным M199 средства массовой информации, и место обратно в культуре тканиинкубатора.
- Аспирируйте от средств массовой информации супернатант. На этот раз не будет почти никаких плавающих и компактной железосодержащие гранулы образуют на стороне коническую трубку рядом с магнитом.
- Промыть 5 мл полной среды 3x.
- Добавьте 3 мл полной среды и смешать вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендируйте железосодержащих гранул.
- Налейте в 35 мм блюдо культуры ткани. С помощью микроскопа, небольшие фрагменты плавает судно с железом частиц, содержащихся в просвет сосуда не видно. Это будет три пластины.
- Место блюдо культуры ткани в культуре ткани инкубатора.
5. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - День тринадцатый
- Аспирируйте СМИ от пластин 1-3.
- Осторожно промыть клетки с теплой, стерильной PBS.
- Добавить тонкая пленка трипсин (~ 0,25-0,5 мл) трипсин в каждой пластине в Trypsinize с клетками. Клетки очень приверженцем и должны быть в трипсин в ткани Cultuповторно инкубаторе в течение примерно 10 минут отрываться от пластины.
- Урожай клетки с плит в 5 мл полной среды в 50 мл коническую пробирку, прикрепленный к магниту вытащить любых остаточных частиц железа.
- Промойте каждую из пластин с дополнительными 0,5 мл полной среды и добавить, что носитель в 50 мл коническую трубку.
- На этот раз, возьмите СМИ супернатант (не аспирация), и отказаться от частиц железа гранул.
- Пластина клеток в 5 мл полной M199 средств массовой информации в 60-мм чашке иметь сливной клеток в течение нескольких дней. Кроме того, пластины клеток в 10 мл полной M199 СМИ в 10 см пластины, а PASMC займет примерно еще 1-2 недели для достижения слияния.
6. Легочная артерия Изоляция от новорожденных мышей - четырнадцатый день
- Измените СМИ свежей полной M199 СМИ, чтобы удалить остатки трипсина. Там будет тонким населения PASMC на блюдо культуры ткани (рис. 1В).
7. Плановое медицинское обслуживание
- Измените СМИ свежей полной M199 СМИ приблизительно в 2 раза в неделю.
- При разделении этих клетках, примерно 10 мин в инкубаторе в фильме трипсина (0,25-0,5 мл) требуется для клеток снимите пластину. Использованием пленки позволяет replating трипсина из PASMC, не прекращая раскручивать клеток. Если слишком много используют трипсин, то должны быть PASMC центрифугировали выйти из-под трипсин, или клетки не будут readhere к пластине. Иногда, после спиннинг вниз клетки, трудно получить PASMC ресуспендировали в полной M199 СМИ.
- При наблюдениях, изолированных PASMC вести себя как клетки гладких мышц надежно в течение 4-5 проходов, но изолированных клеток будет пятно для гладкомышечных клеток маркеры до канала 7. Подсчитайте первые объединенные 60 мм или 10 см пластины на День тринадцатый как проход 2 (покрытие после первого воздействия трипсина).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время и после изоляции, PASMC рассматриваются как с помощью светового микроскопа и иммуногистохимическое маркеры гладких мышечных клеток. С помощью светового микроскопа в начале протокола, PASMC видны мигрирующие на блюдо культуры ткани небольших железосодержащих сосудов (рис. 1А). После объединения пластины один через три дня на тринадцать, то частицы железа больше не рассматриваются как те были вытащены на заключительном этапе объединения. Вместо этого население PASMC видно на блюдо культуры ткани (рис. 1В).
На основе иммунное, начальное клетки, которые мигрируют от железосодержащего сосудов примерно 50% фибробластов и 50% PASMC (данные не показаны). Поскольку фибробласты имеют существенное преимущество роста, фибробласты, со временем перерастают PASMC на тарелку нулю. По этой причине пластина нулевой отбрасывается как только есть ясно изолированы PASMC на последующих пластин. После объединения, населениеиз PASMC составляет> 90% PASMC, которые окрашены положительным как для α-миозина гладких мышц и десмин (рис. 2). Когда отображаеются 20x, несколько веретенообразных клеток видны совместимой с гладкой мышечной клетки фенотипа (рис. 2А). Когда отображаемого при большем увеличении (40х), ламеллоподий переднего края отдельных клеток визуализируются как они мигрируют и расти по отношению к другим гладкомышечных клеток на блюдо (фиг. 2В).
Фосфодиэстеразы 5 (ФДЭ-5) выражается PASMC и гидролизует цГМФ, являющийся ключевым медиатором сосудистого тонуса, в неактивные GMP. Снижение PDE5 играет критическую роль в нормальном легочных сосудов переход после рождения. В крупных животных моделях, ФДЭ5 является регулируемой развитием всей беременности, и ее экспрессию и активность резко падает после рождения 27. Для того, чтобы подтвердить, что эти изолированные PASMC сохраняют фенотип в соответствии с их стадии развития, мы рассмотрели ФДЭ-5 ЭНЦYME активность в мышиных PASMC изолированы от Р7, Р14, Р21 и мыши, а также взрослых мышей. Мы видим, самые высокие уровни активности ФДЭ-5 в PASMC изолированы от P7 мышей. Эти уровни падают в PASMC изолированы от P14 и P21 мышей. Самые низкие уровни активности ФДЭ-5, отмечены в PASMC изолированы от взрослых мышей (рис. 3).
Рисунок 1. Новорожденных PASMC визуализированы с помощью световой микроскопии. PASMC визуализируются с помощью светового микроскопа на 20X.) На третий день протокола, веретенообразные PASMC можно увидеть мигрирующих из черного железа, заполненные небольшим PA на блюдо культуры ткани. B) На четырнадцатый день после объединения, население PASMC можно увидеть на блюдо культуры ткани.
Рисунок 2. Новорожденных PASMC Stain положительно для гладкомышечных маркеров. PASMC высевали на коллаген обработанных покровные стекла, фиксировали в 4%-ном формалине и проницаемыми с 0,2% Triton-X, как описано выше 7,23.) PASMC от Р7, Р14 и Р21 мышей окрашивали анти-десмин (разведение 1:200) или анти-гладких мышц миозин (разведение 1:2000) в 5% BSA, а затем родамин-красный анти-кролик вторичный при разведении 1:200. Флуоресценция визуализированы с эпифлуоресцентной микроскопом при 20X. B) PASMC от P14, P21 и мышей окрашивали анти-миозина гладких мышц или десмин как и выше, и флуоресценции визуализировали, как указано выше при 40-кратном.
Рисунок 3. Фосфодиэстеразы 5 (ФДЭ-5) активность являетсяРегулируемой развитием в PASMC. PASMC собирали на общий белок и анализировали на PDE5 ферментативной активности, как описано ранее с использованием коммерчески доступного колориметрический фосфодиэстеразы циклического нуклеотида набора для анализа 7. Каждый образец читать ± силденафила (100 нм). Разница между пмоль цГМФ гидролизованный на мг общего белка в минуту ± силденафила представляет PDE5 конкретных цГМФ-гидролитической активности. N = 4 для P7 PASMC, N = 10 для P14 PASMC, N = 4 для P21 PASMC и N = 8 для взрослых PASMC. * Р <0,05 по сравнению с P7 PASMC, # р <0,05 по сравнению с P14 PASMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описываем впервые изоляции PASMC от мышей на Р7, Р14 и Р21. Для того чтобы достичь этого, суспензии агарозы и 0,2 мкМ частиц железа переплетаются через RV в ПА. Из-за небольшого размера частиц железа, они не могут пройти через легочную капиллярную и, таким образом, хранение в небольшом PA. Легкие раздуваются, удалены и диссоциированных. Железосодержащих судах тянутся из раствора с помощью магнита. В конечном счете, сосуды помещали в чашку для культуры ткани и клетки мигрируют от сосудов и на культуральный планшет. Начальное пластина клеток представляет собой смесь из фибробластов и PASMC и выпадающее процедура повторяется несколько раз, чтобы получить обогащенный PASMC населения. При длительном воздействии на высоком уровне, существует теоретический риск того, что остаточного железа может влиять на окислительно-восстановительный баланс в изолированных клетках. Таким образом, внимание уделяется в последнем шаге, чтобы удалить остатки железадо объединения и распространения клеток. Иммуноокрашивание для α-миозина гладких мышц и десмин делается, чтобы подтвердить, что население обогащенный> 90% PASMC. Эти клетки имеют ферментативной активности ФДЭ-5, в соответствии с сосудистых гладких мышечных клеток фенотип. Интересно, что активность фермента ФДЭ-5 отличается PASMC изолированы от мышей разного возраста, предполагая продолжение развития регулирования в PASMC после выделения.
Хотя этот метод является интеллектуально очень проста, распространенной проблемой является низкий выход PASMC. Там может быть несколько причин этой проблемы, даже если 2-3 мышей объединяются в пул. Во-первых, лучший выход клеток достигается, если процедуры выделения инициируется сразу после мыши уступает изофлурана передозировки. Как только произошла смерть, микро-сгустков форму всему сосудистому руслу. Эти сгустки в легочных сосудах помешает частиц железа от попадания в, как многие малые ПА, тем самым де-ростом доходности. Кроме того, жизнеспособность изолированных PASMC становится больше беспокоят больше мышь мертва до изоляции. Абсолютное ключевым шагом, который влияет PASMC выход железа инфузии. Если легкие не заметно серые после инфузии железа, возможные причины: 1) железо будет ретроградным в правое предсердие и печени, 2) имеется отверстие или разрыв в RV, или 3) Есть микро-сгустков в малом круге кровообращения где-то предотвращения хорошие вливания железа. Наконец, мы заметили, что PASMC выделенных из различных генетически модифицированных штаммов мыши обнаруживают поразительно отличаются темпы роста в культуре после выделения. Таким образом, при попытке первой этой техники, лучше всего использовать штамм дикого типа мышей.
Очевидно, что загрязнение вызывает озабоченность любое время одним изолирует клетки из целого животного. Все инструменты стерилизуются и протирают спиртом до процедуры, а затем один раз сердце-легкие блока удаляется, др.л последующие шаги выполняются в капот культуры ткани с стерильной техники. Используя эти меры вместе с антибиотиком средах, содержащих практически исключило любые загрязнения.
С выделением любых первичных клеточных линий, есть опасения о том, как долго ячейка сохранит свой фенотип в культуре. Баранина FPASMC изолированы от контроля и PPHN ягнят сохранить свои гладкие мышцы фенотипа на 8 и 5 проходах 7,14. Для мышь PASMC, клетки начинают терять сигнальных реакций на канал 5 и гладкомышечных маркеров на канал 7 (данные не показаны). Это подчеркивает один из недостатков этого метода. Несколько мышей, необходимых для достижения небольшого количества клеток, и время от изоляции к достаточное количество клеток для экспериментов длину; 2-4 недель в зависимости от количества клеток необходимо. Наконец, когда клетки выделяют, надо только три прохода, чтобы работать с ними, прежде чем они теряют клетки гладкой мышцы сигнализацииответы. Одним из потенциальных области для усовершенствования должно было бы разработать метод, посредством которого эти клетки могут быть заморожены и успешно восстановлены из жидкого азота. Это позволит лаборатории регулярно делают клетки и заморозить как мыши доступны, а затем следователи могли таять и использовать клетки для экспериментов по мере необходимости.
Несмотря на техническую задачу выполнения изоляции и длительный срок для изоляции, эти PASMC представляют собой новый и ценный инструмент для изучения путей передачи сигналов в развивающихся мышиной легочной сосудистой сети. Мы считаем, что эту технику, чтобы изолировать новорожденных PASMC мыши позволит расширенные исследования ключевых сигнальных путей, участвующих в развитии легочной гипертензии, что приведет к более глубокому пониманию патогенеза заболевания и позволяют разработку новых методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH HL109478 (КФН). Авторы признают и благодарят Джина Ким Тейлор и Джоан за помощь в выделении и сохранении PASMC в культуре.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
