Summary
Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.
Abstract
Pulmoner hipertansiyon morbidite ve bebeklerde mortalite önemli bir nedenidir. Tarihsel olarak, fetal koyun PASMC vasküler düz kas kasılması yer alan sinyal yollarının önemli bir çalışma olmuştur. Koyun vadeli pulmoner hipertansiyon mükemmel bir model yaparken, çok pahalı ve farelerde bulunan genetik manipülasyon avantajı eksikliği. Tersine, fareler PASMC izole etmek yetersizlik, bu sistemin önemli bir sınırlama oldu. Burada Marshall et al daha önce anlatılan tekniğin bir varyasyonu kullanılarak P7, P14 ve P21 farelerden fare PASMC birincil kültürleri izole edilmesi tarif. 26 önceden sıçan PASMC izole etmek için kullanılır oldu. Bu fare PASMC yenidoğan döneminde sinyal yolları çalışmaları için yeni bir araç temsil eder. Kısaca,% 0.5 'lik bir çamur (ağ / hac) agaroz + M199 ortamı içinde% 0.5 demir partikülleri, sağ ventrikül (RV) ile pulmoner vasküler yatak içine aşılanmıştır.demir parçacıkları çapı 0.2 mcM ve pulmoner kapiller yatak geçemez. Böylece, küçük pulmoner arter (PA) demir zâviye. Akciğerler kaldırıldı ve ayrışmış agaroz, şişirilir. Demir içeren gemiler bir mıknatıs ile aşağı çekilir. Kolajenaz (80 U / ml) daha fazla işleme ve ayrışma sonra kaplar kültür kabı üzerine hücre göçü izin vermek için% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler (M199 tam kültür ortamı) ihtiva eden M199 ortamı içinde, bir doku kültürü kabı içine konur . Bu hücre ilk plaka fibroblastlar ve PASMC bir 50-50 karışımıdır. Bu nedenle, prosedür aşağı çekme bir daha saf PASMC nüfus elde etmek ve herhangi bir kalıntı demir kaldırmak için birden çok kez tekrarlanır. Düz kas hücre kimlik düz kas miyozin ve desmin için immün ile teyit edilir.
Introduction
Plasenta gaz değişimi en önemli organı olarak hizmet verir ve kalp debisi sadece% 10 pulmoner vasküler yatak dolaşıyor yana Pulmoner hipertansiyon intrauterin ömrü boyunca normaldir. Utero olarak, akciğer basıncı yüksek pulmoner vasküler direnç nedeniyle sistemik basınçları benzer . Gebelik ilerledikçe, akciğer içindeki küçük PA hızlı büyüme doğum 1 gerçekleşir pulmoner kan akımında dramatik artış için fetus hazırlanıyor vardır. Normal perinatal geçiş kısa vadeli ve tam süreli bebeklerde başarısız olduğunda, sonuç (PPHN) yenidoğanın persistan pulmoner hipertansiyon. PPHN çok farklı altta yatan patolojiler neden olduğu bir klinik sendromdur. Ancak, bu bebeklerin tüm bu duktus arteriozus veya için kalıcı fetal bağlantıları arasındaki bu yüksek pulmoner vasküler direnç, hipoksemi ve kan akımının sağdan sola şant gibi ortak patofizyolojik özellikleri paylaşmakovale amin. PPHN 1000 canlı doğumda 2-6 etkiler ve ölüm gibi önemli kısa vadeli ve uzun vadeli morbidite 2 bir% 8-10 risk taşır. Ayrıca, çok düşük doğum ağırlıklı prematüre bebeklerde altta yatan akciğer hastalığı sonucu pulmoner hipertansiyon gelişebilir. Prematüre bebeklerde en sık altta yatan akciğer hastalığı bronkopulmoner displazi (BPD) 'dir. BPD genel risk gebelik yaşı ve doğum ağırlığı ile ilişkilidir ise bu bebeklerin bir alt kümesi önemli pulmoner hipertansiyon ve nasıl uygun bu bebeklerin tedavisinde geliştirir neden, belirsizliğini koruyor. Uzun süreli hastanede kalış ve artan ölüm de dahil olmak üzere kötü sonuçlar, 3-6 yaygındır.
Tarihsel olarak, sağlıklı hayvanlardan alınan koyun veya domuz fetal PASMC fetal PASMC doğumdan sonra normal pulmoner vasküler geçiş dahil sinyal yollarının incelemek için kullanılmıştır. Bunlar, tipik olarak, bir beşinci nesli direnç PA izole edilirn koyun ya da herhangi bir spontan solunum 7-9 önce teslim ve ötenazi domuz fetus. Ayrıca, bazı araştırmacılar izole ve biraz büyük gelen PASMC kullanılan ve kendiliğinden 3 gün, 2 hafta ve 4 hafta 10-12 kuzu ve domuz nefes var. Daha yakın zamanda, bazı grupları başarıyla izole edilmiş ve hastalık durumunun 13-17 yolaklarının sinyalizasyon bozuklukların incelemek PPHN Kuzuların izole PASMC faydalanmaktadır. Bu hücreler sinyal yolları normal ve hastalıklı kısa vadeli ve dönem pulmoner vasküler hem de çok önemli olan incelemek için değerli bir araç olduğu görüldü. Ancak, pulmoner hipertansiyon ile prematüre bebeklerde etkiledi sinyal yolları hakkında fikir vermeyin. Ne de hastalığın fare modellerinde görülen genetik manipülasyon olanakları izin veriyoruz.
Sıçan ve fare modelleri uzun modeli BPB için kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda modeli pulmoner hy için kullanılmaktadırBPD 18-22 kaynaklanan pertension. Yenidoğan sıçan onların büyük boyutu nedeniyle çalışmak için cazip, ama onlar da genetik modifikasyon için potansiyel eksikliği muzdarip. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar kapsamlı yenidoğan farelerde bütün hayvan fizyolojisi ile ilgili özel gen hedefleri etkilerini araştırmak için, ama kimse daha önce başarılı bir şekilde bu küçük fareler PASMC izole bugüne kadar kullanılmıştır. PASMC izole ederek, daha fazla bilgi yolları çevresel uyaranlara ve / veya pulmoner arter düz kas özellikle genetik modifikasyon yanıt olarak nasıl değiştiğini hakkında elde edilebilir. Ayrıca, canlı PASMC kalsiyum ve reaktif oksijen türleri 23-25 gibi önemli sinyal molekülleri hızlı değişiklikleri incelemek için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Son zamanlarda Marshall et al, tekniğin bir varyasyonu kullanılarak erişkin farelerden elde edilen PASMC başarılı bir şekilde izole edilmesi tarif. 26 sıçan PASMC 23,25,26 izole etmek için kullanılabilir. Şimdi bir adapte olmasınd 7-21 gün yaş küçük fareler (P7, P14, ve P21) için bu tekniği uzatıldı. Bu yeni PASMC izolasyon tekniği için birincil sınırlama bu deneyler için yeterli hücre elde etmek için birden fazla farenin gerektirir ve hücrelerin, birincil düz kas hücrelerinin karakteristik olan, çok yavaş bir şekilde bu olmasıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, biz yenidoğan fare PASMC izole etmek için bu tekniği pulmoner hipertansiyon gelişiminde rol oynadığı ve bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir önemli sinyal yollarının gelişmiş soruşturma için izin inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu bu protokolü onayladı.
1. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Day One
- 100 ml (nihai konsantrasyon =% 20) ısı ile deaktive edilmiş FBS ve 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 400 ml M199 - Komple M199 ortamı hazırlayın.
- 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 500 ml M199 - serum serbest M199 ortamı hazırlayın.
- Mix 0.05 g agaroz artı 10 ml steril, serum serbest M199 medya 0.05 g demir parçacıkları - PA Agaroz hazırlayın.
- 10 ml steril, serumsuz M199 ortamı içinde karıştırın, 0.1 g agarozun - Akciğer agaroz hazırlayın.
- Steril filtre Bu karışım daha sonra 80 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda, steril, serum içermeyen ortam ile karışır M199 kolajenaz ve - kollajenaz hazırlayın. Fare ötenazi önce vaktinden tüm donanımları kurmak.
- Fare ötenazi hemen önce kaynamaya PA agaroz ve akciğer agaroz ayarlayın.
- Izofluran doz aşımı ile anestezi kavanoza fare Euthanize ve izofluran ile temas için fare yavru izin vermemek için dikkatli olun. En iyi hücre verimi hücrelerin ölümünden sonra dolaşımda oluşturan mikro pıhtılar önlemek için ölümden hemen sonra hasat zaman elde edilir.
- Anestezi kavanoz fareyi çıkarın, işletim kartına fare güvenli ve fare, aletler ve alkol ile eldiven sterilize edin.
- Bıçak ile neşter yükleyin ve boyun alt karın için fareyi insizyon.
- Farenizin sol tarafta karın açın, böbrek maruz ve fare böylece akciğerlerin küçük damarlarda pıhtı kaçınarak, asıl bulbus olfaktoryusları alındı sağlamak için renal arter kesti.
- En farenin sol tarafında kesmek için makas kullanınsternum toraks açmak için.
- Dikkatle her iki tarafta da diyafram kesilmiş ve tam göğüs boşluğu açmak için neşter kullanmak. Göğüs boşluğuna açık tutmak için forseps veya işaretçilerine kullanın.
- PA yönelik bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer (tüm kan pulmoner dolaşım dışına kızarmış) beyaz görünmesini kadar steril PBS ile RV / PA / akciğer serpmek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak PBS içinde yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu, küçük bir akciğer damarlarında pıhtı oluşumunu önlemek için ilk fışkırma için önemlidir.
- Dikkatlice trakea ve iplik bir dikiş altında ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın.
- Destek için trakea altındaki küçük forseps koyun ve trakea içine 24 G angiocatheter yerleştirin. IV yerleştirme gibi angiocatheter yerleştirin.
- Adım 1.16 olarak dişli dikiş ile trakea içine angiocatheter sabitleyin.
- Kaynar su dışında kaynar Pensilvanya agaroz alın ve iyice karıştırın için ters. Agaro soğutunSE buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına getirilir. Agaroz çözeltide kalır ama bu PA hücrelere zarar verir, böylece sıcak olmayacak gerekmektedir.
- Bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer gri görünür kadar PA agaroz ile RV / PA / akciğer serpmek. Agaroz karışımı demir parçacıklar akciğer gri renkli görünür hale getirecek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak, PA agaroz yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu demir solunum yollarına akmasına neden olabilir çok hızlı enjekte yavaş yavaş gitmek için de önemlidir.
- Kaynar su akciğer agaroz çıkarın ve iyice karıştırın için ters. Daha sonra buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına soğumaya agaroz. Agaroz çözeltide kalır ama bu da, akciğer hücrelerine zarar böylece sıcak olmayacak gerekmektedir.
- Akciğer agaroz hazırlamak ve trakea içinde 24 G angiocatheter için şırınga takın. Tam olarak akciğer şişirmek için trakea yoluyla agaroz demlenmeye. Akciğerler easie olacakr akciğer uygun şişirilmiş ise (daha sonra adımlara bakın) kıyma için.
- Kalp-akciğer blok çıkarın ve batığın bu agaroz (~ 5 dk) katılaşmaya buz PBS 25 ml içine. Cerrahi alan temizlemek için bu kez kullanın.
- Yenidoğan fareler için (P7-P21), en iyi PASMC verim hücrelerin tek bir grupta 2-3 yavrular bir araya geliyor. PASMC optimum hücre sağlık ve büyümesi için diğer hücreler ile temas halinde olması tercih ederler. Bir fare izolasyon başına kullanılırsa, o zaman hücreler, seyrek ve iyi büyümez. Birlikte hayvanlar, hasat ve soğuk kalp-akciğer blokları birleştirerek ve tüm kalp-akciğer blok hayvanlardan kaldırıldı kez daha sonra kıyma için taşıdığınızda.
- Bu noktadan itibaren kısırlık için hücre kültürü kaputu taşı.
- 10 cm doku kültürü çanak kapağı içine soğutulmuş akciğer yerleştirin ve dikkatli bir şekilde kalp, timus, trakea ve akciğer herhangi bir bağ dokusu çıkarın.
- 10 cm doku kültürü çanak alt karşı akciğerlerde hareketve yaklaşık 1 ml buz gibi soğuk steril PBS ilave edin.
- 2 neşter ile çok küçük parçalar (1-2 mm) içine akciğer kıyma.
- Steril bir 5 ml serolojik pipet kapalı ucu kırın. Pipet steril 50 ml konik tüp içine akciğer bulamaç kıyılmış. Akciğer dokusunun tüm 50 ml konik tüp içine alır sigortalamak için plaka yıkamak için ek steril buz gibi soğuk PBS kullanın.
- Mıknatıs üzerine 50 ml konik tüp yerleştirin. Demir içeren doku mıknatıs yanında borunun yan taşımak için bekleyin. Akciğer dokusuna demir içeren geminin oranına bağlı olarak, gemilerin bazıları hala bu noktada yüzen olabilir. Bu gemilerin içeriyorsa belli olduğu için PBS yavaş ve dikkatli bir şekilde yüzen akciğer dokusu aspire etmemeye çalışıyor kapalı aspire.
- Tekrar aspire edilir akciğer dokusunun miktarını en aza indirmek için çalışıyor, 5 ml steril PBS ile akciğer pelet 3x yıkayın.
- 3 ml kollajenaz içinde akciğer pelet tekrar süspansiyon ve 60 mm doku kültürü çanak içine dökün. YapmaBu pipetle için çalışalım, akciğer parçaları da pipet iç sadık olacaktır.
- Boşaltma işleminin hemen sonrasında boru durulama ve hem de 60 mm doku kültürü çanağı içine dökmek için bu, fazladan bir 3 ml kullanın.
- 1 saat boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatör içine yerleştirin.
- Pipet doku + 5 ml şırınga bir 15 G künt iğne ile kollajenaz bulamaç yukarı ve aşağı tüm büyük akciğer parçaları bozulur kadar. Doku + kollajenaz çamur görünür doku parçaları ile bu noktada bulutlu olacak.
- Yeni bir steril 50 ml konik tüp içine dökün ve mıknatıs eklemek.
- Dokunun tüm toplanan edilmiş olmasını sağlamak için tam M199 ortamın yaklaşık 5 ml doku kültürü bulaşık yıkama, ve konik bir tüp içine bu dökün.
- Kollajenaz + medya süpernatant kapalı aspire. Bu süre çok az yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında olacaktır.
- 5 ml tam Med ile yıkayınız3x ia. Bu kollajenaz inaktive etmek için gereklidir.
- Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
- 35 mm doku kültürü çanak içine süspanse pelet dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları olacaktır.
- Gecede doku kültürü inkübatör doku kültürü çanak (plaka sıfır etiketli) yerleştirin. Plaka sıfır üzerine kapalı geçirmek için ilk hücreleri düz kas işaretleri için boyama dayalı yaklaşık% 50 fibroblast ve% 50 PASMC vardır. Bu plaka kaplama sıfır denir ve sonuçta sonraki zenginleştirme basamakları sonra atılır.
2. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - İkinci Gün
- Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka sıfırdan süpernatant medya dökün.
- Medya süpernatant aspire. Bu zaman hemen hemen hiç uçuşan cisimler olabilir ve kompakt bir demir-conta olacakadencilik pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
- 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
- Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
- 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu (Şekil 1A) plaka biri olacaktır.
- Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.
3. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Altı
- Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka birinden süpernatant medya dökün. Bu adımı birden çok kez tekrar damar duvarında ikamet düz kas hücrelerinin her bir hücre kültürü plaka üzerine kapalı geçirmek için bir fırsat olduğunu sigortalanır. Her plaka yani her adımda bir azalan dönüş daha az ve daha az hücre bağlı olacaktır vardır.
- Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
- 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
- Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
- 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka iki olacaktır.
- Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.
4. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Dokuz
- Doku kültürü çanak plaka iki temiz bir 50 ml konik bir tüp içine medya süpernatant dökün.
- Tekrar çember yükleme özelliği tam M199 medya ile plaka iki ve yerine geri doku kültürü içineinkübatör.
- Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
- 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
- Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
- 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka üç olacak.
- Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.
5. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Thirteen
- 1-3 plakaların medya kapalı aspire.
- Yavaşça sıcak, steril PBS ile hücreleri yıkayın.
- Hücrelerini trypsinize için her plakaya tripsin (~ 0.25-0.5 ml) tripsin ince bir tabaka ekleyin. Hücreler çok yapışık ve doku cultu içinde tripsin olması gerekirplaka çıkarmak için yaklaşık 10 dakika inkübatör yeniden.
- Herhangi bir kalıntı demir partikülleri çekmek için mıknatıs bağlı bir 50 ml konik tüp içinde 5 ml tam ortama plakalar Hasat hücreleri.
- Tam ortam ilave 0.5 mL 'si ile plakaların her yıkayın ve 50 ml konik tüp, medya ekleyin.
- Bu kez, medya süpernatant (aspire yok) almak ve demir parçacık pelet atın.
- Plaka 60 mm tabak içinde 5 ml tam M199 medya hücreleri birkaç gün içinde konfluent hücreler olması. Alternatif olarak, plaka 10 ml tam M199 10 cm plaka medya ve PASMC hücrelerin izdiham ulaşmak için yaklaşık bir 1-2 hafta sürer.
6. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Ondört
- Herhangi bir kalıntı tripsin kaldırmak için taze tam M199 medya için ortam değiştirin. Doku kültürü çanak (Şekil 1B) üzerinde PASMC ince bir nüfus olacak.
7. Rutin Bakım
- Taze tam M199 medya için ortam değiştirin yaklaşık haftada 2x.
- Bu hücreler, tripsin bir film inkübatör yaklaşık 10 dakika (0.25-0.5 ml) bir plaka çıkarmak için hücrelerin bölünme gerekli olduğunda. Tripsin filmi kullanarak hücrelerin aşağı sıkma yapmadan PASMC bir replating sağlar. Çok fazla tripsin kullanılırsa, o zaman PASMC tripsin üzerinden dönmeye santrifüj gerekir, veya hücre plakasına readhere olmayacaktır. Bazen, hücreleri aşağı iplik sonra, tam M199 medya içine yeniden süspanse PASMC almak zordur.
- Gözlemler, izole edilmiş PASMC 4-5 geçişleri için güvenilir düz kas hücreleri gibi davranırlar, ama düz kas hücre geçişi 7 kadar işaretleme kalemler için izole hücreleri leke olacaktır. Geçit 2 (tripsin ilk maruz kaldıktan sonra kaplama) olarak günde on üç ilk toplanmış 60 mm ya da 10 cm plaka sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Izolasyon sırasında ve sonrasında, PASMC ışık mikroskobunda ve düz kas hücre belirteçleri için immün her iki incelenir. Erken protokolde ışık mikroskobu ile, PASMC gemiler (Şekil 1A) içeren küçük demir doku kültürü çanak üzerine göç görülür. Gün on üç on plakalar üç ile bir havuzu sonra, daha sonra demir parçacıkları bu son havuzu adımda çıkardı edilmiş olarak artık değerlendirildiğini biliyoruz. Bunun yerine, PASMC nüfusu doku kültürü çanak (Şekil 1B) görülür.
Immün göre, demir-ihtiva eden geçiş damarlarından ilk hücrelerin yaklaşık en az% 50 ve en az% 50 fibroblast PASMC (veriler gösterilmemiştir). Fibroblastlar önemli bir büyüme avantajı olduğundan, fibroblast zaman büyümek içinde plaka sıfır PASMC olacak. Takip eden plakalar üzerine net bir şekilde izole PASMC orada bir kez Bu nedenle, plaka sıfır atılır. Sonra havuzu, nüfusunPASMC bir α-düz kas miyozin ve desmin (Şekil 2) için pozitif leke>% 90 PASMC olduğunu. 20X görüntülü, birden fazla iğ şekilli bir düz kas hücreleri, hücre fenotipinde (Şekil 2A) ile tutarlı görülür. Bu göç ve çanak (Şekil 2B) diğer düz kas hücreleri doğru büyüdükçe daha yüksek büyütme (40X) görüntülü zaman, tek hücre önde gelen kenarının lamellopodia görüntülenmiştir.
Fosfodiesteraz 5 (PDE5) inaktif GMP içine PASMC ve hidroliz cGMP, vasküler sesi önemli bir aracı, olarak ifade edilir. PDE5 doğum sonrası normal pulmoner vasküler geçişte önemli bir rol oynar azaltın. Büyük hayvan modellerinde, PDE5 gelişimsel gebelik boyunca düzenlenir, ve ifade ve faaliyet doğumdan 27 sonra önemli ölçüde düşer. Bu izole PASMC gelişim aşamasında olan bir fenotip tutarlı korumak onaylamak için, biz PDE5 enz incelendiFare PASMC içinde yme aktivitesi P7, P14, P21 ve fareler, hem de yetişkin farelerden izole edilmiştir. Biz, P7 farelerden izole PASMC PDE5 aktivitesi en yüksek düzeyde bkz. Bu seviyeler P14 ve P21 fareler izole PASMC düşüş. PDE5 etkinliğinden en düşük düzeyde yetişkin farenin (Şekil 3) izole PASMC belirtilmiştir.
Şekil 1. Yenidoğan PASMC Işık Mikroskopi ile Visualized. PASMC 20X bir ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. Protokol günde üç A), iğ şeklinde PASMC doku kültürü çanak üzerine siyah demir-dolu küçük PA göç görülebilir. B) havuzu gün sonra on dört günü, PASMC nüfusu doku kültürü çanak görülebilir.
Şekil 2. Yenidoğan PASMC Düz Kas İşaretleri için Olumlu Leke. PASMC% 4 formaldehit sabit, kolajen ile tedavi edilen cam lamelleri üzerine kaplama, ve daha önce 7,23 açıklandığı gibi% 0.2 Triton-X ile permeabilize edildi. A) PASMC P7, P14 gelen ve P21 farelerin anti-desmin (1:200 seyreltme) ya da bir 1:200 dilüsyon rodamin kırmızı anti-tavşan ikincil ardından% 5 BSA, anti-düz kas miyozin (1:2,000 seyreltme) ile boyandı. Floresan B) P14 gelen PASMC ve P21 fareler yukarıdaki gibi anti-düz kas miyozin veya desmin ile boyandı. 20X bir Epifloresans mikroskop ile görüntülendi ve floresan yukarıda 40X de görüntülendi.
Şekil 3,. Fosfodiesteraz 5 (PDE5) AktivitesiGelişimsel. PASMC Ayarlı PASMC toplam protein için hasat edildi ve daha önce ticari olarak temin edilebilen bir nükleotid kolorimetrik siklik fosfodiesteraz tahlil kiti 7 ile tarif edildiği gibi PDE5 aktivitesi için enzimatik tahlil. Her bir numune ± sildenafil (100 nm) okundu. Dakika başına mg toplam proteini başına pmol cGMP hidroliz ± sildenafilin arasındaki fark PDE5 özgü cGMP hidrolitik aktivitesi gösterir. K = 4 P7 PASMC için, n = 10 P14 PASMC için, N = 4 yetişkin PASMC için P21 PASMC, ve n = 8. * P <0.05 P7 PASMC, # p <0.05 karşı P14 PASMC karşı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, ilk kez P7, P14, ve P21 de farelerden alınan PASMC en izolasyonu için tarif. Bunu gerçekleştirmek için, agaroz ve 0.2 uM demir zerrelerin bir bulamacı PA içine RV ile infüze edilir. Demir parçacıkları küçük boyutu nedeniyle, pulmoner kapiller yatak geçemez ve böylece küçük PA yatırılır. Akciğerler, şişirilmiş kaldırılır ve ayrışmış vardır. Demir içeren gemilerin bir mıknatıs kullanarak çözüm çıkardı vardır. Sonuçta, gemilerin bir doku kültürü çanak içine kaplama ve hücreler damarlarından göç ve kültür plaka üzerine vardır. Hücrelerin ilk plaka fibroblastlar ve PASMC bir karışımıdır, ve prosedür aşağı çekme zenginleştirilmiş bir PASMC nüfus türetmek için birden çok kez tekrarlanır. Yüksek seviyelerde uzun süreli maruz kalma ile, artık demir izole hücre içinde redoks dengesini etkileyebilecek bir teorik riski vardır. Bu nedenle, kalan bütün demir çıkarmak için son adımda halledilirönce hücre havuzu ve propaganda için. Α-düz kas miyozin ve desmin için immün zenginleştirilmiş nüfusunun>% 90 PASMC olduğunu onaylamak için yapılır. Bu hücreler, vasküler düz kas hücresi fenotipi ile tutarlı, PDE5 enzimatik aktiviteye sahiptir. İlginç bir şekilde, PDE5 enzim aktivitesi izolasyon sonra PASMC içinde devam gelişimsel düzenleme düşündüren, farklı yaşlardaki fareler izole PASMC farklıdır.
Bu teknik entelektüel çok basit olsa da, ortak bir sorun PASMC düşük verim olduğunu. 2-3 fareler bir araya toplanmış bile, bu sorun için birden fazla nedeni olabilir. Fare izofluran doz aşımı yenik düşer, sonra izolasyon prosedürü hemen başlatılır İlk olarak, en iyi cep verim elde edilir. Vasküler yatak boyunca bir kez ölüm meydana geldi, mikro-pıhtıları formu. Pulmoner damar bu pıhtı böylece de, gibi birçok küçük PA girmesini demir parçacıkları engellerverim katlama. Ayrıca, izole PASMC canlılığı uzun fare önce izolasyon öldü büyük endişe olur. PASMC verimi etkiler mutlak önemli bir adım demir infüzyon olduğunu. Akciğer demir infüzyon sonra belirgin gri değilseniz, olası nedenleri şunlardır: 1) demir RV delinmesi ya da kopması yoktur, ya da 3) mikro-pıhtılaşması vardır) sağ atrium ve karaciğer, 2 içine retrograd gidiyor pulmoner dolaşım bir yerde iyi bir demir infüzyon önlenmesi. Son olarak, farelerin farklı genetik olarak değiştirilmiş suşları izole PASMC izole sonra kültüründe çarpıcı farklı büyüme oranları sergileyen fark etmişsinizdir. Bu nedenle, ilk olarak bu teknik, çalışırken, bu fareler, bir vahşi-tip suşu kullanmak en iyisidir.
Açıktır ki, kirlilik bir endişe bir bütün hayvan hücreleri izole herhangi bir zamandır. Tüm araçlar steril ve sildi alkol ile önceden işlem için, ve sonra bir kez kalp-akciğer blok al, kaldırılır edilirizleyen adımların L steril tekniği ile, bir doku kültürü kaputu yapılır. Antibiyotik içeren medya ile birlikte bu önlemler hemen her kirlenme ortadan kaldırdı.
Herhangi bir birincil hücre hattı izolasyonu ile, bir hücre kültürü kendi fenotip korumak ne kadar hakkında bir endişe var. Kontrolü ve PPHN kuzu izole Koyun FPASMC sırasıyla 7,14, 8 ve 5 pasajlar için kendi düz kas fenotip korumak. Fare PASMC için, hücreler geçit kanalı 5 ve 7 (veriler gösterilmemiştir) ile düz kas belirteçleri ile sinyal yanıtları kaybetmeye başlar. Bu, bu tekniğin sınırlamaları birine dikkat çekiyor. Birden fazla farenin hücrelerin küçük miktarlarda elde etmek için gerekli ve izolasyondan deneyler için yeterli hücrelere süresi uzun olur; 2-4 hafta gerekli hücre sayısına bağlı olarak değişebilir. Onlar sinyal kendi düz kas hücre kaybetmeden önce Son olarak, bir kez hücreleri izole, bir tek onlarla çalışmak için üç pasajlar vardırtepkilerine neden olur. Iyileştirilmesi için potansiyel bir alan bu hücreler dondurulmuş ve sıvı azot başarıyla kurtarılamaz olabilir sayede bir yöntem geliştirmek olacaktır. Bu fareler mevcuttur, ve sonra gerektiği gibi araştırmacılar deneyler için hücreleri çözülme ve faydalanabilirler gibi bir laboratuar düzenli yapmak ve hücreleri dondurmak için izin verecek.
Izolasyon için yalıtım ve uzun bir zaman çizelgesi yerine teknik sorun rağmen, bu PASMC gelişen kemirgen pulmoner damar sinyal yolaklarının çalışma için bir yeni ve çok değerli bir araç temsil eder. Biz yenidoğan fare PASMC izole etmek için bu teknik hastalık patogenezi daha iyi anlaşılmasına yol ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için sağlayacak pulmoner hipertansiyon, gelişiminde kilit rol oynayan sinyal yollarının gelişmiş soruşturma için izin inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH HL109478 (KNF) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar izole ve kültür PASMC korunmasında kabul ve yardım için Gina Kim ve Joann Taylor teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
