Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Summary

Vi har utvecklat en ny och reproducerbar metod för att isolera primära kulturer av lungartären glatta muskelceller (PASMC) från möss så unga som P7, vilket möjliggör bättre studie av de signalvägar involverade i neonatal glatta muskelceller kontraktion och avslappning.

Abstract

Pulmonell hypertension är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos spädbarn. Historiskt sett har det funnits betydande studie av signalvägar involverade i vaskulär glatt muskulatur kontraktion i PASMC från foster får. Även fåren gör en utmärkt modell för begreppet pulmonell hypertension, de är mycket dyra och saknar fördelen av genmanipulation hittades i möss. Omvänt var oförmågan att isolera PASMC från möss en betydande begränsning av det systemet. Här har vi beskrivit isolering av primära kulturer av mus PASMC från P7, P14, och P21-möss med användning av en variant av den tidigare beskrivna tekniken enligt Marshall et al. ²⁶ som tidigare användes för att isolera råtta PASMC. Dessa murina PASMC utgör ett nytt verktyg för att studera signalvägar under nyföddhetsperioden. Kortfattat, en uppslamning av 0,5% (vikt / volym) agaros + 0,5% järnpartiklar i M199 media infunderas i pulmonella vaskulära bädden via den högra ventrikeln (RV). Denjärnpartiklarna är 0,2 mikrometer i diameter och kan inte passera genom lungkapillärt sängen. Således är de järn loger i de små lungartärerna (PA). Lungorna är uppblåsta med agaros, bort och identifieras. De järn-kärlen dras ned med en magnet. Efter kollagenas (80 U / ml) behandling och ytterligare dissociation, kärlen tas i en vävnadsodlingsskål i M199-medium innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS), och antibiotika (M199 komplett medium) för att tillåta cellmigration på odlingsskålen . Denna initiala platta av celler är en 50-50 blandning av fibroblaster och PASMC. Således är samma rullgardinsmeny procedur upprepas flera gånger för att uppnå en mer ren PASMC befolkning och ta bort eventuella järn. Glatta muskelceller identitet bekräftas genom immunfärgning för glatt muskulatur myosin och desmin.

Introduction

Pulmonell hypertension är normalt under intrauterin liv sedan moderkakan verkar som en signifikant organ för gasutbyte och endast 10% av hjärtminutvolymen cirkuleras genom lungkärlen. In utero, pulmonary trycken liknar systemiska tryck på grund av förhöjd pulmonell vaskulär resistens . Som dräktigheten fortskrider, det finns snabba tillväxten av den lilla PA i lungorna, förbereda fostret för den dramatiska ökningen av pulmonell blodflöde som inträffar vid födseln ^1. När den normala perinatal övergången misslyckas i kortsiktiga och fullgångna spädbarn, är resultatet persistent pulmonell hypertension hos den nyfödde (PPHN). PPHN är ett kliniskt syndrom som orsakas av många olika underliggande sjukdomar. Men alla dessa spädbarn har gemensamma patofysiologiska funktioner såsom förhöjd pulmonell vaskulär resistens, hypoxemi, och höger-till-vänster shuntning av blodflödet över långlivade foster anslutningar såsom ductus arteriosus eller föramen ovale. PPHN drabbar 2-6 per 1000 levande födda och förmedlar en 8-10% risk för mortalitet samt betydande kortsiktiga och långsiktiga morbiditet ^2. Dessutom kan mycket låg födelsevikt prematurer utvecklar pulmonell hypertension som ett resultat av deras underliggande lungsjukdom. Den vanligaste bakomliggande lungsjukdom av för tidigt födda barn är bronkopulmonell dysplasi (BPD). Medan den totala risken för BPD korrelerar med gestationsålder och födelsevikt, är det fortfarande oklart varför en delmängd av dessa spädbarn utvecklar betydande pulmonell hypertension och hur man på lämpligt behandla dessa barn. Dåliga resultat, inklusive förlängda sjukhusvistelser och ökad dödlighet, är vanliga ^3-6.

Historiskt sett har ovin fetal PASMC eller svin fetal PASMC från friska djur som använts för att studera de signaleringsvägar involverade i det normala pulmonella vaskulära övergång efter födseln. Dessa är vanligen isolerade från femte generationens motstånd PA av enn får eller svin fostret som levereras och avlivas innan någon spontan andning ^7-9. Dessutom har vissa forskare isoleras och utnyttjas PASMC från något äldre och spontanandning lamm och smågrisar vid 3 dagar, 2 veckor och 4 veckor ^10-12. På senare tid har vissa grupper isoleras framgångsrikt och utnyttjade PASMC isolerad från lamm med PPHN att undersöka derangements i signalvägar i sjukdomstillståndet ^13-17. Dessa celler har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att undersöka vilka signalvägar är avgörande i både normala och sjuka kort sikt och sikt lungkärlsväggarnas muskulatur. Däremot ger de inte insikt i de signalvägar påverkas hos prematura barn med pulmonell hypertension. Inte heller tillåter möjligheterna för genetisk manipulation sett i musmodeller av sjukdomen.

Råtta och mus modeller har länge använts för att modellera BPD och mer nyligen används för att modellera pulmonell hypertension uppstått genom BPD ^18-22. Neonatala råttor är lockande att arbeta med på grund av sin större storlek, men de också lider av brist på möjligheter till genetisk modifiering. Genetiskt modifierade djur har i stor utsträckning använts för att undersöka effekterna av specifika genen mål på hela djuret fysiologi hos neonatala möss, men hittills ingen tidigare har framgångsrikt isolerat PASMC från dessa små möss. Genom att isolera PASMC, kan ökad information erhållas om hur vägar förändras som svar på stimuli från omgivningen och / eller genetisk modifiering specifikt i lungartären glatt muskulatur. Dessutom kan leva PASMC avbildas i realtid för att undersöka snabba förändringar i viktiga signalmolekyler såsom kalcium och reaktiva syreradikaler ^23-25. Vi beskrev nyligen den framgångsrika isoleringen av PASMC från vuxna möss med användning av en variant av tekniken med Marshall et al. ²⁶ används för att isolera råtta PASMC ^23,25,26. Vi har nu anpassat ennd utvidgades denna teknik till små möss 7-21 dagars ålder (P7, P14, och P21). Den primära begränsningen till denna nya PASMC isoleringsteknik är att den kräver flera möss för att generera tillräckligt med celler för experiment och att cellerna växer mycket långsamt, som är karaktäristisk för primära glatta muskelceller. Trots dessa begränsningar anser vi denna teknik för att isolera neonatal mus PASMC kommer att möjliggöra förbättrad undersökning av viktiga signalvägar involverade i utvecklingen av pulmonell hypertension och representerar betydande framsteg på detta område.

Protocol

Institutional Animal Care och användning kommittén vid Northwestern University godkänt detta protokoll.

Ett. Lungartären Isolering från neonatala möss - Dag ett

1. Förbered Komplett M199 media - Mix 400 ml M199 med 100 ml (slutlig koncentration = 20%) värmeinaktiverat FBS och 5 ml (slutlig koncentration = 1%) penicillin / streptomycin.
2. Förbered Serumfritt M199 Media - Mix 500 ml M199 med 5 ml (slutlig koncentration = 1%) penicillin / streptomycin.
3. Förbered PA Agarose - Mix 0,05 g agaros plus 0,05 g partiklar järn i 10 ml sterila, serum-fria M199 media.
4. Förbered Lung Agarose - Blanda 0,1 g agaros i 10 ml sterila, serum-fria M199 media.
5. Förbered Kollagenas - Blanda kollagenas i sterila, serumfria M199 media med en slutlig koncentration av 80 U / ml och därefter sterilfilter denna blandning. Ställ in all utrustning i förväg innan euthanizing musen.
6. Ställ PA agaros och lung agaros koka precis innan euthanizing musen.
7. Euthanize musen i narkos burk med isofluran överdos och vara noga med att inte låta musen valpen att komma i kontakt med isofluran. Den bästa cell utbyte erhålles när cellerna skördas omedelbart efter döden för att undvika mikro-blodproppar som bildas i cirkulationen efter döden.
8. Ta bort musen från narkos burken, fast musen till operativsystemet ombord, och sterilisera mus, instrument och handskar med alkohol.
9. Fyll på skalpell med bladet och incisionsfilm musen från halsen till den underlägsna buken.
10. Öppna buken på musen vänstra sida, exponera njuren, och skär njurartären att gör musen att exsanguinate och därmed undvika blodproppar i de små blodkärlen i lungorna.
11. Använd en sax för att klippa längs musens vänstra sidabröstbenet att öppna bröstkorgen.
12. Försiktigt använda skalpell för att skära membranet på båda sidor och fullständigt öppna brösthålan. Använd pincett eller stift för att hålla bröstkorgen öppen.
13. Stick RV med en 27 G ½ tums nålen riktad mot PA och BEGJUTA RV / PA / lungor med steril PBS tills lungorna ser vitt (allt blod spolas ut av den pulmonary cirkulationen). Detta tar cirka 3 till 5 ml PBS beroende på storleken av musen. Det är viktigt att spola först för att förhindra koagelbildning i de små lung fartyg.
14. Försiktigt använda trubbig dissektion för att exponera luftstrupen och tråd en sutur undertill.
15. Sätt de minsta pincett undertill luftstrupen för stöd och placera 24 G angiokateter i luftstrupen. Placera angiokateter som om att placera en IV.
16. Säkra angiokateter i luftstrupen med sutur träs i steg 1.16.
17. Ta kokande PA agaros ur kokande vatten, och invertera att blanda väl. Kyl Agarose till ungefär kroppstemperatur genom att snurra på is. Agarosen måste förbli i lösning men inte vara så varm att den kommer att skada cellerna i PA.
18. Stick RV med en 27 G ½ tums nål och BEGJUTA RV / PA / lungor med PA agaros tills lungorna ser grå. Järnpartiklarna i agaros blandningen gör lungorna verkar grå i färgen. Detta tar cirka 3 till 5 ml PA agaros beroende på storleken av musen. Det är också viktigt att gå långsamt som injicerar alltför snabbt kan orsaka järnet att läcka in i luftvägarna.
19. Ta lungan agaros ur kokande vatten och invertera att blanda väl. Sedan kyla agaros till ungefär kroppstemperatur genom att snurra på is. Agarosen måste förbli i lösning men inte vara så het att den kommer att skada cellerna i lungan.
20. Rita upp lungan agaros och fäst sprutan till 24 G angiokateter i luftstrupen. Infundera agarosen genom luftstrupen för att helt blåsa upp lungorna. Lungorna blir easier att mala (se senare steg) om lungorna är korrekt uppblåsta.
21. Avlägsna hjärt-lung blocket, och dränka in den i 25 ml iskall PBS för att solidifiera agaros (~ 5 min). Använd denna tid att städa upp det kirurgiska området.
22. För neonatala möss (P7-P21), kommer den bästa PASMC avkastningen från kombinera 2-3 ungar i en kull av celler. PASMC föredrar att vara i kontakt med andra celler för optimal cell hälsa och tillväxt. Om en mus används per isolering, då cellerna är mycket glesa och inte växa bra. Vid kombination djur, skörd och kyla hjärt-lung block tillsammans och sedan flytta till finhacka när alla hjärt-lung blocken har tagits bort från djuren.
23. Flytta till cellodling huven för sterilitet från denna punkt framåt.
24. Placera kylda lungor i locket på den 10 cm vävnadsodlingsskål och försiktigt bort hjärta, tymus, luftstrupe, och eventuell bindväv från lungorna.
25. Flytta lungorna till botten av den 10 cm vävnadsodlingsskåloch tillsätt ca 1 ml iskall steril PBS.
26. Mal lungorna i mycket små bitar (1-2 mm) med två skalpeller.
27. Bryt av spetsen av en steril 5 ml serologisk pipett. Pipettera malet lung slam i sterila 50 ml koniska rör. Använd extra steril iskall PBS för att tvätta plattan för att säkerställa att all lungvävnad kommer in i 50 ml koniska rör.
28. Placera 50 ml koniskt rör på magneten. Vänta på järn-innehållande vävnad för att flytta till sidan av röret intill magneten. Beroende på förhållandet mellan järn-innehållande kärl till lungvävnad kan vissa av de fartyg fortfarande vara flytande vid denna punkt. Sug bort PBS sakta och försiktigt försöker att inte aspirera flytande lungvävnad eftersom det är oklart om den innehåller fartyg.
29. Tvätta lungan pelleten 3x med 5 ml steril PBS, återigen försöker minimera mängden lungvävnad som sugs.
30. Resuspendera lungan pelleten i 3 ml kollagenas och häll i 60 mm vävnadsodlingsskål. Gör inteFörsök att pipettera detta, lungan bitar fastnar på insidan av din pipett.
31. Använd ytterligare 3 ml för att skölja röret efter hälla, och häll detta i 60 mm vävnadsodling skålen också.
32. Placera i 37 ° C vävnadskultur inkubator under 1 timme.
33. Pipettera vävnad + tills kollagenas slam upp och ner med en 15 G trubbig nål på en 5 ml spruta alla stora lung bitar störs. Vävnaden + kollagenas slurry blir grumlig på denna punkt utan synliga vävnad bitar.
34. Häll i en ny steril 50 ml koniska rör och fäst till magneten.
35. Tvätta skålen vävnadsodling med ca 5 ml av kompletta M199 media för att försäkra att alla av vävnaden har samlats in, och detta hälls i den koniska röret.
36. Sug bort kollagenaset + media supernatanten. Denna gång kommer det att finnas mycket få floaters, och en kompakt järn-innehållande pellets kommer att vara på den sida av koniska röret intill magneten.
37. Tvätta med 5 ml komplett Medbl.a. 3x. Detta krävs för att inaktivera kollagenas.
38. Tillsätt 3 ml av kompletta medium, och blanda upp och ner ett par gånger för att suspendera den järnhaltiga pellet.
39. Häll den suspenderade pelleten i en 35 mm vävnadsodling skålen. Med hjälp av ett mikroskop, kommer det att finnas små fartyg fragment flyter runt med järnpartiklar som finns i kärllumen.
40. Placera skålen vävnadsodling (märkt platta noll) i vävnadsodlingsinkubator natten. De första cellerna att migrera ut på plattan noll är ungefär 50% fibroblaster och 50% PASMC, baserat på färgning för glatt muskulatur markörer. Denna platta kallas pläterade noll och slutligen kastas efter de efterföljande anrikning stegen.

2. Lungartären Isolering från neonatala möss - dag två

1. Häll media supernatanten från plattan noll i en ren 50 ml koniska rör.
2. Sug bort media supernatanten. Denna gång kommer det att finnas nästan inga grumlingar, och en kompakt järn-containing pelleten kommer att bildas på sidan av den koniska röret intill magneten.
3. Tvätta med 5 ml komplett medium 3x.
4. Tillsätt 3 ml av kompletta medium, och blanda upp och ner ett par gånger för att suspendera den järnhaltiga pellet.
5. Häll i en 35 mm vävnadsodling skålen. Med hjälp av ett mikroskop, är små fartyg fragment flyter runt med järn partiklar som funnits i fartyget lumen sett. Detta kommer att vara platta en (Figur 1A).
6. Placera skålen vävnadsodling i vävnadsodlingsinkubator.

Tre. Lungartären Isolering från neonatala möss - Dag sex

1. Häll media supernatanten från plattan en till en ren 50 ml koniska rör. Upprepa detta steg flera gånger försäkrar att alla glatta muskelceller bosatta i kärlväggen har möjlighet att migrera bort på en cellkultur platta. Det finns en avtagande avkastning med varje steg, dvs varje platta kommer att ha färre och färre celler följa.
2. Sug bort media supernatanten. Denna gång kommer det att finnas nästan inga grumlingar, och en kompakt järn-innehållande pellets bildas på sidan av den koniska röret intill magneten.
3. Tvätta med 5 ml komplett medium 3x.
4. Tillsätt 3 ml av kompletta medium, och blanda upp och ner ett par gånger för att suspendera den järnhaltiga pellet.
5. Häll i en 35 mm vävnadsodling skålen. Med hjälp av ett mikroskop, är små fartyg fragment flyter runt med järn partiklar som funnits i fartyget lumen sett. Detta kommer att vara platta två.
6. Placera skålen vävnadsodling i vävnadsodlingsinkubator.

4. Lungartären Isolering från neonatala möss - Day Nine

1. Häll media supernatanten från vävnadsodlingsskål plattan två in i en ren 50 ml koniska rör.
2. Refeed plattan två med komplett M199 media, och platsen tillbaka till vävnadsodlinginkubator.
3. Sug bort media supernatanten. Denna gång kommer det att finnas nästan inga grumlingar, och en kompakt järn-innehållande pellets bildas på sidan av den koniska röret intill magneten.
4. Tvätta med 5 ml komplett medium 3x.
5. Tillsätt 3 ml av kompletta medium och blanda upp och ner ett par gånger för att suspendera den järnhaltiga pellet.
6. Häll i en 35 mm vävnadsodling skålen. Med hjälp av ett mikroskop, är små fartyg fragment flyter runt med järn partiklar som funnits i fartyget lumen sett. Detta kommer att vara platta tre.
7. Placera skålen vävnadsodling i vävnadsodlingsinkubator.

Fem. Lungartären Isolering från neonatala möss - Dag Tretton

1. Aspirera media off av plattor 1-3.
2. Försiktigt tvätta cellerna med varm, steril PBS.
3. Lägg en tunn film av trypsin (~ 0,25-0,5 ml) trypsin till varje platta till trypsinize av celler. Celler är mycket vidhäftande och kommer att behöva vara i trypsin i vävnaden kulture inkubator för ungefär 10 minuter för att lyfta av plattan.
4. Harvest celler av plattorna i 5 ml komplett medium i ett 50 ml koniskt rör fäst magneten att dra ut eventuella kvarvarande jämpartiklar.
5. Tvätta varje platta med ytterligare 0,5 ml av kompletta medium och tillägga att media till 50 ml koniska rör.
6. Den här gången tar media supernatanten (inte aspirera), och kassera järnpartikel pelleten.
7. Plate cellerna i 5 ml komplett M199 media i en 60 mm skål att ha konfluenta celler i ett par dagar. Alternativt plattan cellerna i 10 ml komplett M199 media i en 10 cm platta, och PASMC tar ytterligare cirka 1-2 veckor att nå sammanflödet.

6. Lungartären Isolering från neonatala möss - Dag Fjorton

1. Byt till färskt komplett M199 media för att avlägsna eventuell kvarvarande trypsin. Det kommer att finnas en tunn population av PASMC på vävnadsodlingsskål (Figur 1B).

7. Rutinmässig skötsel

1. Byt till färskt komplett M199 medium 2x ungefär per vecka.
2. När dela dessa celler, cirka 10 min i inkubatorn i en film av trypsin (0,25-0,5 ml) som krävs för att cellerna ska lyfta av plattan. Använda trypsin filmen medger nicasiling av PASMC utan att sluta snurra cellerna. Om för mycket trypsin används, då PASMC måste centrifugeras för att snurra ut trypsin, eller cellerna kommer inte readhere till plattan. Ibland, efter centrifugering ned cellerna, är det svårt att få PASMC suspenderades i komplett M199 media.
3. I observationer, den isolerade PASMC beter sig som glatta muskelceller tillförlitligt för 4-5 passager, men de isolerade cellerna färgas för glatta muskelceller markörer upp till passagen 7. Räkna först poolade 60 mm eller 10 cm platta på dag tretton passage 2 (bordläggningen efter första exponering för trypsin).

Representative Results

Under och efter isolering, är PASMC granskas både av ljusmikroskop och genom immunfärgning för mjuka markörer muskelcell. Genom ljusmikroskop tidigt i protokollet, är PASMC ses migrera på vävnadsodlingsskål från lilla jäminnehållande fartyg (Figur 1A). Efter sammanslagning plattorna ett till tre om dagen tretton, då järnpartiklarna inte längre ses som de har dragits ut i det slutliga pooling steget. Istället är en population av PASMC sett på vävnadsodlingsskål (Figur 1B).

Utifrån immunfärgning, de första celler som migrerar utanför järn-kärlen är cirka 50% fibroblaster och 50% PASMC (data visas ej). Eftersom fibroblaster har en betydande tillväxt fördel, fibroblaster kommer med tiden växa över den PASMC på plattan noll. Av denna anledning är plattan noll kasseras när det är klart isolerade PASMC på de efterföljande plattorna. Efter sammanslagning, befolkningenav PASMC är> 90% PASMC som färgas positivt för både α-glatt muskulatur myosin och desmin (figur 2). När avbildas vid 20X, finns flera spindel-formade celler sett överensstämmer med en glatt muskelcell fenotyp (Figur 2A). När avbildas vid högre förstoring (40X), den lamellopodia i framkanten av enskilda celler visualiseras när de flyttar och växer mot andra glatta muskelceller på skålen (Figur 2B).

Fosfodiesteras 5 (PDE5) uttrycks i PASMC och hydrolyserar cGMP, en viktig förmedlare av vaskulär tonus, till inaktiva GMP. Minskning av PDE5 spelar en kritisk roll i det normala pulmonella vaskulära övergång efter födseln. I stora djurmodeller, är PDE5 regleras utvecklingsmässigt över dräktigheten, och dess uttryck och aktivitet faller dramatiskt efter födseln ^27. För att bekräfta att dessa isolerade PASMC behålla en fenotyp överensstämmer med deras utvecklingsstadium, undersökte vi PDE5 enzYME aktivitet i mus PASMC isolerat från P7, P14, och P21-möss, liksom möss vuxna. Vi ser de högsta nivåerna av PDE5 aktivitet i PASMC isolerad från P7 möss. Dessa nivåer falla i PASMC isolerats från P14 och P21 möss. De lägsta nivåerna av PDE5-aktivitet noteras i PASMC isolerats från vuxna möss (figur 3).

Figur 1. Neonatal PASMC visualiseras i ljusmikroskop. Visualiseras med hjälp av ett ljusmikroskop vid 20X PASMC. A) På dag tre av protokollet, kan spolformad PASMC ses migrera från svart järn-fyllda små PA på vävnadsodlingsskål. B) På dag fjorton efter sammanslagning, kan en population av PASMC ses på vävnadsodlingsskål.

Figur 2. Neonatal PASMC Stain Positivt för glatt muskulatur Markörer. PASMC ströks ut på kollagen-behandlade täckglas, fixerades i 4% formaldehyd och permeabiliserades med 0,2% Triton-X såsom tidigare beskrivits ^7,23. A) PASMC från P7, P14, och P21 möss färgades med anti-desmin (1:200 utspädning) eller anti-glatt muskulatur myosin (1:2000 spädning) i 5% BSA, följt av rodamin-röd anti-kanin sekundärt vid en 1:200 spädning. Fluorescens visualiserades med epifluorescensmikroskop vid 20X. B) PASMC från P14, och P21 möss färgades med anti-glatt muskulatur myosin eller desmin som ovan och fluorescens visualiserades enligt ovan vid 40X.

Figur 3. Fosfodiesteras 5 (PDE5) Aktiviteten ärUtvecklingsmässigt reglerad i PASMC. PASMC skördades för totalt protein och analyserades för PDE5 enzymatisk aktivitet som tidigare beskrivits med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kolorimetrisk cyklisk nukleotidfosfodiesteras assay kit ^7. Varje prov avlästes ± sildenafil (100 nM). Skillnaden mellan den pmol cGMP hydrolyserad per mg totalt protein per minut ± sildenafil representerar den PDE5-specifika cGMP-hydrolytisk aktivitet. N = 4 för P7 PASMC, n = 10 för P14 PASMC, n = 4 för P21 PASMC och n = 8 för vuxen PASMC. * P <0,05 jämfört med P7 PASMC, ^# p <0,05 jämfört med P14 PASMC.

Discussion

I detta manuskript, beskriver vi för första gången isolering av PASMC från möss vid P7, P14, och P21. För att åstadkomma detta, är en uppslamning av agaros och 0,2 pM partiklar järn infunderas genom RV in i PA. På grund av den lilla storleken av järnpartiklarna, kan de inte passera genom lungans kapillärbädd och således deponeras i den lilla PA. Lungorna är uppblåsta, bort och identifieras. De järninnehållande fartyg dras ur lösningen med hjälp av en magnet. I slutändan är de fartyg stryks i ett vävnadsodlingsskål, och cellerna migrerar av de fartyg och på kultur plattan. Den initiala platta av celler är en blandning av fibroblaster och PASMC, och draget ner proceduren upprepas flera gånger för att härleda en berikad PASMC befolkning. Med långvarig exponering vid höga nivåer, det finns en teoretisk risk för att kvarvarande järn kan påverka redox balansen inom de isolerade cellerna. Sålunda ser man i det sista steget för att avlägsna all resterande järnföre sammanslagning och sprida cellerna. Immunfärgning för α-glatt muskulatur myosin och desmin görs för att bekräfta att den berikade populationen är> 90% PASMC. Dessa celler har PDE5 enzymatisk aktivitet, i överensstämmelse med en vaskulär glatt muskelcell fenotyp. Intressant nog är den PDE5 enzymaktivitet annorlunda PASMC isolerats från möss i olika åldrar, vilket tyder på en fortsatt utvecklande reglering inom PASMC efter isolering.

Även om denna teknik är intellektuellt mycket enkel, är ett vanligt problem lågt utbyte av PASMC. Det kan finnas flera orsaker till detta problem, även om 2-3 möss slås samman. Först är det bästa cellutbytet uppnås om isoleringen inleds omedelbart efter musen dukar till isofluran överdos. När döden har inträffat, mikro-blodproppar bildas i hela kärlbädden. Dessa blodproppar i lungorna kärlsystemet förhindrar järnpartiklarna från att komma in så många små PA, varigenom deskrynklas avkastningen. Dessutom blir livskraft isolerade PASMC större oro längre musen är död före isolering. Den absoluta viktigaste steget som påverkar PASMC avkastningen är järnet infusionen. Om lungorna är inte märkbart grått efter järn infusion, möjliga orsaker är: 1) att järnet går bakåtsträvande i höger förmak och lever, 2) det finns hål eller reva i RV, eller 3) det finns mikro-proppar i lungkretsloppet någonstans förhindra god järn infusion. Slutligen har vi märkt att PASMC isolerats från olika genetiskt modifierade stammar av möss uppvisar påfallande olika tillväxttal i kultur efter isolering. Därför, när de först försöker denna teknik, är det bäst att använda en vildtyp stam av möss.

Självklart är förorening ett bekymmer som helst man isolera celler från ett helt djur. Alla instrument är steriliserade och torkas med alkohol före proceduren, och sedan en gång i hjärt-lung-blocket tas bort, all på de efterföljande stegen sker i en vävnadsodling huva med steril teknik. Med hjälp av dessa försiktighetsåtgärder tillsammans med antibiotika-innehållande media har praktiskt taget eliminerat all förorening.

Med isoleringen av någon primär cellinje, finns det en oro för hur länge en cell kommer att behålla sin fenotyp i kultur. Får FPASMC isolerad från kontroll och PPHN lamm behålla sin glatt muskulatur fenotyp för 8 och 5 passager, respektive ^7,14. För mus PASMC, cellerna börjar förlora signalering svar genom passagen 5 och glatta muskelceller markörer genom passage 7 (data ej visade). Detta belyser en av begränsningarna hos denna teknik. Flera möss krävs för att uppnå små mängder celler, och tiden från isolering till tillräckligt med celler för experiment är lång, 2-4 veckor beroende på antalet nödvändiga celler. Slutligen, när cellerna är isolerade, har man bara tre stycken som arbetar med dem innan de förlorar sin glatta muskelceller signaleringsvar. Ett potentiellt område för förbättring skulle vara att utveckla en metod där dessa celler kan frysas och återhämtade framgångsrikt från flytande kväve. Detta skulle möjliggöra ett labb att regelbundet göra och frysa celler som möss är tillgängliga, och sedan utredarna kunde tina och använda cellerna för experiment som behövs.

Trots den tekniska utmaningen att utföra isolering och lång tidslinje för isolering, dessa PASMC representerar ett nytt och ovärderligt verktyg för att studera signalvägar i utvecklingsländerna murina lungkärlsväggarnas muskulatur. Vi tror att denna teknik för att isolera neonatal mus PASMC kommer att möjliggöra förbättrad undersökning av viktiga signalvägar involverade i utvecklingen av pulmonell hypertension, vilket kommer att leda till bättre förståelse av sjukdomen patogenes och möjliggöra utveckling av nya behandlingar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.