钙火花的评估在正常肌肉纤维

Summary

这里描述的是一种方法来直接测量钙火花的Ca ^{2 +}的基本单元从正常肌肉纤维肌质网释放。该方法利用渗透压应激介导的触发的Ca ^{2 +}释放在孤立的肌纤维兰尼碱受体。动力学和细胞内Ca ^{2 +}信号的稳态容量可以被用来评估在健康和疾病中的肌肉功能。

Abstract

维持内环境稳定的Ca ^{2 +}信号传导是一个基本的生理过程中的活细胞。 ^钙火花是^钙的基本单元⁺中显示为高度本地化由兰尼碱受体介导的^钙释放事件（碱受体）的Ca ^{2 +}对肌浆网（SR）膜释放渠道横纹肌纤维的信号。正确评估肌肉的^钙火花可以提供有关的健康和疾病横纹肌细胞内Ca ^{2 +}的处理性能信息。尽管Ca ^{2 +}的火花事件是常见于静息心肌细胞，它们很少在静息骨骼肌纤维观察到，因此有必要对方法来生成和分析在骨骼肌纤维产生火花。

这里详细是一个实验性协议，用于测量Ca ^{2 +}的火花在孤立的屈肌digitorm短（FDB）肌纤维取fluorescent Ca ^{2 +}的指示器和激光扫描共聚焦显微镜。在这种方法中，隔离的FDB纤维暴露到瞬时低渗应力之后返回到等渗生理溶液。在这些条件下，一个强大的Ca ^{2 +}火花响应被检测到相邻的年轻健康的FDB肌纤维的细胞膜膜。改变Ca ^{2 +}的响应火花在营养不良或老年骨骼肌纤维检测。这种方法最近已证实，膜分隔的信令涉及受体（IP ₃ R）肌醇之间的串扰（1,4,5） -三磷酸和碱受体贡献的Ca ^{2 +}火花激活骨骼肌。总之，使用渗透胁迫我们的研究引起Ca ^{2 +}的火花表明，该细胞内的反应反映了肌肉的信令机制，在生理和衰老/疾病状态，包括肌肉萎缩症的小鼠模型（mdx小鼠）或肌萎缩侧索硬化症（ALS模型）。

Introduction

细胞内游离Ca ^{2 +（}内[Ca ^{2 _+]} i的）是监管的兴奋细胞，如神经元，心肌，骨骼肌和平滑肌多种细胞功能（综述见Stutzmann和马特森^1）灵活的和重要的第二信使。调控的Ca ^{2 +}动员和串扰肌浆网（SR）和T型肾小管间（TT）膜是肌肉生理学的基本监管。此外，改变的Ca ^{2 +}信号已被证明是收缩功能障碍的各种肌肉疾病的潜在机制。

^钙火花的本地化基本的Ca ^{2 +}释放事件从肌浆网（SR）膜^（2）开放的兰尼碱受体（Ryanodine受体）通道的起源。在心肌，火花发生自发地通过由一个的Ca ^{2 +}诱导的Ca ^{2 +}勒开口的RyR2的信道的ASE（CICR）机制^3-5。在骨骼肌，RYR1是严格的TT膜^6,7电压传感器控制。因此，Ca ^{2 +}的火花被抑制，很少发现在正常肌肉纤维的静息状态。直到最近，需要细胞膜的膜通过各种化学或机械的“换肤”方法被打乱，以脱开的RYR1电压传感器的抑制和允许的Ca ^{2 +}引发骨骼肌^8,9被检测到的事件。一个方法之前描述的肌纤维由皂素洗涤剂¹⁰膜的透化需要。

2003年，我们发现，无论是短暂的低渗应激或高渗应激可引起外周血Ca ^{2 +}的火花毗邻的完整肌肉纤维¹¹细胞膜的膜。这种方法已经被修改，以研究的Ca ^{2 +}的分子机制和调制12-16。在这里，我们勾勒出我们的实验方法对Ca ^{2 +}的火花正常肌肉感应，检测和分析的细节。我们还提出了可以用来量化个体的Ca ^{2 +}火花在骨骼肌， 如火花的频率和幅度（ΔF/F0，它反映的RyR通道的开放概率的元素的属性我们的定制火花分析程序和的Ca ^{2 +}的负荷对SR内）;达峰时间（上升时间）和持续时间（FDHM，充分停留时间的火花在半最大振幅），以及Ca ^{2 +}的火花的空间分布。此外，我们目前的证据表明链接改变的Ca ^{2 +}火花的各种病理生理状态的骨骼肌，如肌肉萎缩症和肌萎缩性侧索硬化症。

这种技术的优点涉及到测量的Ca ^{2 +}的相对undam的能力老化细胞，而不是剥离的肌肉纤维，使记录的Ca ^{2 +}火花在条件更接近生理，。此外，我们的定制设计方案提供与肌纤维火花的特性更精确的计算。

Protocol

1。设置渗透胁迫灌注系统

图1是钙的示意性协议火花评估在正常肌肉纤维。

1. 设置了一个三轴（XYZ）显微操作器能够定位含有至少两个通道的灌注系统的出口端部。此可以作出与一次性鲁尔注射器筒与附3 -路鲁尔 - 乐旋塞打开和/或关闭灌注液的流动。这些灌注通道应能够输送的溶液> 1毫升/分钟通过一个单一的灌注尖与>直径0.2mm的。
2. 加载两个通道灌注系统，一个与等渗台氏液和其他与低渗台氏液中。

2。从鼠标准备完好的单趾短屈肌（FDB）肌纤维

1. 从鼠标欧盟取出脚thanized以下使用对重解剖剪通过上面的踝关节的腿切NIH和IACUC准则。
2. 脚脚到一个夹层腔充满了最小的Ca ^{2 +}台氏液与跖面朝上。
3. 解剖FDB通过切割肌腱并轻轻上肌腱拉起到肌肉从周围组织中分离出来。
4. 通过切割所述远端肌腱在那里分支成各个单独的数字在肌肉的深层完成清扫。
5. 拿起通过其筋钳，以避免对肌肉纤维的额外伤害并放入胶原酶消化液的解冻等分管转移FDB肌肉预热至37°C。
6. 孵育在轨道摇床上于37℃下进行60-90分钟为160 rpm的转速含有FDB直立的管。此肌肉束解离协议需要通过实验来检查动物的不同菌株，特别是对那些病/突变体纤维易受膜损伤。
7. 转移消化FDB到管700微升等渗的Tyrode溶液并轻轻磨碎，通过一系列的通过用干净的刀片切割逐渐减小的直径200毫升微量移液器尖端拉伸肌肉数次，以释放纤维以除去提示200毫升微量。为了避免疾病特别弱的肌肉纤维损害，确保针尖正好大到足以使纤维束通过不沾。通过太小开口不要强行捆绑。
8. 积垢的FDB纤维轻轻拍打并重新悬浮FDB纤维在试管中，然后绘制出70毫升（总纤维的1/10）用切200毫升微量成含有1ml等渗的35毫米德尔塔TPG培养皿的中心台氏液，以降低整个盘子扩散。
9. 测定完整的单纤维在D的数量十岁上下用解剖显微镜。添加FDB纤维额外等分，得到3-4完整纤维的菜。
10. 存储额外的隔离肌纤维在4℃，并在6小时使用。

3。荧凌晨4点染料荷载和Ca ^{2 +}成像（火花测量）

1. 转让500毫升等渗台氏液从菜FDB镀成纤维用10毫升荧光 - 凌晨4点股票（1毫米）的管道，混合，并添加回菜10毫米的最终荧光 - 凌晨4点浓度。可替换地，聚醚酸可用于增加染料装载效率。
2. 加载60分钟，在室温下在黑暗中。
3. 通过仔细地绘制出500毫升荧光4含AM-等渗台氏液从菜用一个完整无缺的200毫升塑料枪头洗纤维和更换新鲜台氏等渗溶液等体积。
4. 重复此过程3次以上。
5. 为了形象化线粒体功能，传输500毫升Isoto的NIC台氏液从菜FDB纤维成筒用5毫升TMRE股（1毫米），混合，并添加回菜50nm的终浓度。
6. 在室温下孵育10分钟。
7. 通过仔细地绘制出500毫升洗纤维TMRE含等渗台氏液从与未切割200mL的塑料枪头菜，换上新鲜台氏等渗溶液等体积。
8. 重复此过程3次以上。
9. 转让菜的共聚焦显微镜，并选择一个完整的纤维条纹清晰和平滑细胞膜的膜进行实验。
10. 用显微操作器的控制地定位灌注系统400-500微米的前端远离目标肌肉纤维和偏离中心。
11. 开始流动的等渗台氏液，以确保FDB纤维留在地方。
12. 从荧光4上午从40X油浸物镜记录荧光信号，并激发荧光 - 凌晨4点与氩激光（激发波长488 nm）和创纪录的发射信号（波长510-580纳米）。荧光信号的强度正比于细胞内Ca ^{2 +}浓度（[的Ca ^{2 +]} _i）的相对水平。
13. 通过改变胞外溶液中，以产生渗透胁迫对纤维的渗透压诱导的Ca ^{2 +}瞬变。最初灌注纤维等渗的Tyrode溶液（290毫渗透摩尔浓度）（60秒基线集合），然后用低渗的Tyrode溶液（170毫渗透摩尔浓度）为100秒，以诱导肿胀。灌注FDB纤维回用等渗台氏液。通常，只有一个渗透压休克被施加到一个单一的完整的纤维在一个增量TPG菜和火花事件最后10分钟进行数据采集。
14. 的Ca ^{2 +}的火花（ 图2），使用时间序列的xy二维图像与LPS 166（每秒行，和EA扫描速度的记录空间定位通道线的等渗（每次1 min条件包括512像素造成3.08秒/帧）），低渗应激（100秒）和后低渗应激（5分钟）。用于离线分析存储的信号来评估的Ca ^{2 +}火花下列实验完成的分布和频率。
15. 找到一道新菜新纤维并遵循相同的渗透休克协议诱发的Ca ^{2 +}瞬变。使用共焦线扫描（XT）模式（以长度为512个像素，2毫秒/行扫描的采样率与激光共聚焦扫描线直接置于下方肌膜膜记录的Ca ^{2 +}瞬变一分钟（ 即 30000线）（ 图3中 ）行扫描变更为不同的焦平面记录线扫描单个^钙火花的幅度和动力学分析的三个连续的系列（在1分钟间隔）。

4。数据分析

1. 收集了大​​量的XT线扫描轨迹来评估个体的Ca ^{2 +}火花参数的形态和动力学， 即振幅（F / F _0，其中F ₀是静止的Ca ^{2 +}荧光），上升时间，时间到了高峰，持续时间（FDHM ，充分停留时间的一半大小），并且所记录的火花的空间宽度（FWHM，半幅度全宽）。这些参数代表兰尼的Ca ^{2 +}通道，如^钙离子通量（振幅）的基本门控特性，和RyRs的（持续时间）的门控动力学。
2. 以将其用图像处理语言的IDL（交互式数据语言）创建的，如前面^11,16中记载的自定义开发的，半自动的算法分析的数字图像数据。由于Ca ^{2 +}的独特的动力学释放的^钙离子通过渗透胁迫诱导的FDB纤维火花的情况下，最好是结合钙的手动和自动功能^{2 +}引发的事件识别和处理这些自定义生成的图像分析程序^11。该算法是非常有用的，当它需要手动识别的ROI（感兴趣区域）的一些肌肉疾病模型。一旦投资回报率的定义，算法可以自动导出，然后可以导出到Excel文件中的上述火花参数。可选地，公共可获得的图像处理软件， 如 SparkMaster在ImageJ的，可以用来定义^钙火花的动力学性质和它们在骨骼肌¹⁷的空间分布。

Representative Results

早期的研究表明，瞬态低渗胁迫引起的周围的Ca ^{2 +}火花相邻的完整的肌肉纤维的肌膜膜^11。 图1示出的完整单肌纤维具有光滑肌膜膜和特征明确的条纹图像， 图2示出了典型的Ca ^{2 +}火花（如XY图像）由瞬态（100秒）与低渗的解决方案，从膨胀年轻，健康小鼠的FDB肌肉纤维治疗引起的。由于肌纤维收缩回原来的体积，强大的Ca ^{2 +}的火花响应将直接下肌纤维的肌膜。这些XY图像被用来计算点火频率和绘制此响应的衰减曲线。 图3显示了火花分析这种模式下产生的典型的线扫描（XT）。共焦扫描线位于正下方的细胞膜的膜（ 图3A）。时间序列的火花事件被捕获和指定的ROI（感兴趣区域）可能会与我们的自定义开发的，半自动的“火花填充”方案（ 图3B）来识别。 图3C示出振幅的典型火花拟合分析和给出的Ca ^{2 +}的火花动力学。的Ca ^{2 +}的激发强度的计算方法的Fluo-4AM信号的幅度变化（ΔF / F _0，其中F是峰值的Fluo-4的强度和F ₀是静止的Fluo-4的强度火花产生之前）。火花的持续时间是由FDHM（一半大小的全部持续时间）和上升时间以及到峰值，也可以计算出的时间来表示。一个典型的3D（三维）表示可从指定的感兴趣区域进行显示的Ca ^{2 +}强度的变化（ 图3D），图4说明的Ca ^{2 +}火花图像线扫描来自不同生理和病理状态的骨骼肌纤维。线扫描（XT）系列的Ca ^{2 +}来源于健康的，年轻的（3个月）的野生型肌（ 图4A）和老年（22个月），肌肉（ 图4B）火花。需要注意的是发生在老年人的肌肉纤维的降低的信号。这位年轻的MDX肌纤维显示强劲的^钙火花 （ 图4C）。图5显示的Ca ^{2 +}从趾长伸肌从野生型（EDL）肌纤维（ 图5A）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）火花（XY图像）病，运动神经元病具有特征性肌萎缩和受损的线粒体（ 图5B）。的Ca ^{2 +}的强度是由显示荧光4的信号（绿色，左侧面板）和线粒体呼吸状态显示由TMRE信号（红，右图）。注意，t他受损的线粒体（失去TMRE信号）窝藏，强大的Ca ^{2 +}的火花。

图1。钙的示意图协议火花评估正常肌肉纤维。钙的示意图协议火花评估正常肌肉纤维。这说明逐步程序，以获取完整的FDB肌肉纤维进行分析和设定了灌注系统的诱导胁迫对纤维。 点击这里查看大图 。

图2。代表^钙火花 （XY图像）的FDB骨骼肌肉纤维的情节，中间跟踪显示时间线和相应的XY图像（上图）在协议顺序渗透压的变化。左上面板 - 光纤用等渗台氏溶液处理;顶部中间面板 - 光纤与泰洛低渗溶液处理;和右上面板 - 光纤回到治疗用等渗台氏液。与XY成像观察到的火花发作的典型直方图显示在底部。 点击这里查看大图 。

图3。代表的Ca ^{2 +}水疗中心 RKS（行扫描XT图像）和Spark飞度分析（ 一 ）共聚焦线扫描（红色虚线）放在右侧下方肌纤维的细胞膜膜;（B）渗透胁迫诱发离散Ca ^{2 +}的火花被作为行扫描（XT）模式。 （C）火花分析与火花拟合算法来演示的Ca ^{2 +}强度（ΔF / F _0），它正比于SR的Ca ^{2 +}释放通量和反应动力学（持续时间，表示为FDHM）。 （D）的荧光4线扫描图像显示了渗透胁迫诱发的火花在时空模式及其强度的三维图。 点击这里查看大图 。

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图4。代表^钙火花的肌肉生理和病理状态响应渗透胁迫（A）线的Ca ^{2 +}从年轻衍生火花扫描（XT图像）（3个月）健康FDB肌纤维;（B）从火花岁（ 22个月）FDB肌纤维和（C）火花从年轻（3个月）营养不良mdx小鼠的FDB肌肉。 点击这里查看大图 。

图5。代表^钙火花 （XY图像）从FDB肌肉响应渗透胁迫（A 2 +火花从野生型FDB肌肉（XY图像）和（B）的Ca ^{2 +}从ALS肌肉火花。 FDB肌纤维同时标记的Fluo-4 AM（ ^钙离子，绿信号，左小图）和TMRE（线粒体，在右侧面板的红色信号）。图片前后渗透压变化表明瞬变。 点击这里查看大图 。

Discussion

评估在正常肌肉的Ca ^{2 +}的火花此方法对于肌肉的生理和疾病研究的有用工具。我们发现，在Ca ^{2 +}的火花响应被改变在不同条件，包括肌营养不良症^11，老化_^18，19，以及在肌萎缩性侧索硬化症^20。我们最近的研究还发现IP ₃受体和RyR的代表，有助于钙在骨骼肌肉纤维^{21 2火花}激活的关键组成部分之间的功能耦合。其他几个研究小组也采用了这种技术，探讨功能性活动和肌肉营养不良¹²基因救援策略的有效性，并链接Ca ^{2 +}的激发信号来改变氧化还原应激在某些疾病状态^13,22。通过渗透胁迫膜变形，以减轻DHPR对兰尼对应的镇压的事实尖吻鲈很好地与DHPR-RYR在调节^钙火花鉴别骨骼肌²³物理相互作用（耦合）的重要作用，因此这些发现进一步牵连^钙火花作为重要的生理活动。这种技术的进一步扩展应用一些生理剂或抑制剂调节Ca ^{2 +}的火花将提供对Ca ^{2 +}在细胞信号²⁴洞察力的信息。

我们的实验中最关键的步骤是Ca ^{2 +}的染料装货前分离和鉴定显微镜下完整的肌纤维。在这个协议的一个关键步骤是胶原酶消化时间和温度的改变这些条件中的纤维隔离可能使细胞膜的损害。一种光纤必须牢固地附着在三角洲TPG菜肴底部，并与特性平直，棒状外观，大小70-100显示完整形态_6，米（长）和8-18微米（横直径），均匀的条纹图案和平滑肌纤维膜的膜是有用的Ca ^{2 +}火花的测量。在数据收集之前的局限性的改善正在测量在几个焦平面每根纤维内以捕获可能的^钙火花的最准确的读数。虽然我们使用一个自定义的派生“星火适合”算法来分析火花频率，动态和特点，类似的方案适用于公共领域，用于分析火花参数等特点，在ImageJ的^{17“SparkMaster”。}轻微的修改，这个方法可以让更好的可视化的Ca ^{2 +}火花在其他类型的组织，要渗透应激反应介导的触发的Ca ^{2 +}的兰尼碱受体的释放。

局部和全局的Ca ^{2 +}成人骨骼肌纤维的信号可视化是一个非常有用的工具FOř肌肉生理学和心血管疾病的研究。扩展这种方法用于检测^钙火花在骨骼肌与人类疾病的研究和实施的强有力的分子生物学方法（如基因过表达或基因沉默）不同的动物模型应该产生对Ca ^{2 +}的调节浩瀚资讯在人类健康和疾病的信令。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation