Summary
במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.
Abstract
עקב אירוע התמותה הגבוהה הביא על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיטות שתאפשר אחד כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מעורבים בזה הם שימושיים לטיפול. ישנן גם in vivo ו במבחנת שיטות זמינות למטרה זו. במודלי vivo יכולים לחקות פגיעת ראש בפועל כפי שהוא מתרחש במהלך TBI. עם זאת, בטכניקות vivo לא יכול להיות מנוצל ללימודים ברמת הפיסיולוגיה התא. לפיכך, בשיטות מבחנה הם יתרון נוסף למטרה זו מכיוון שהם מספקים גישה קלה יותר לתאים והסביבה תאית למניפולציה.
הפרוטוקול שלנו מציג במודל חוץ גופית של פציעת מתיחה באמצעות TBI בתאי אנדותל כלי הדם במוח. הוא מנצל את לחץ המופעל על התאים בתרבית בבארות גמישות תחתיות. הלחץ המופעל יכול בקלות להיות בשליטה ויכול לייצר פגיעה שנעה בין נמוך לחמורים. העכבריתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) שנוצרו במעבדה שלנו הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB) ובכך מתן יתרון למערכות אחרות המעסיקות בטכניקה דומה. בנוסף, בשל הפשטות של השיטה, משוכפלים להגדיר קופצים ניסיוני בקלות. לכן, מודל זה יכול לשמש בחקר המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בTBI בBBB.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. כ -10 מיליון בני אדם מושפעים מדי שנה על ידי שהופך אותו TBI בריאותי משמעותי והבעיה רפואית 1. בשל כך, שונים in vivo ו במודלים חוץ גופית של TBI כבר הוקם ופותח על מנת ללמוד מנגנוניה 2,3,4. הבנה טובה יותר של TBI יכולה לעזור לשפר את הטיפול בחולה ולהפחית את התמותה המשויכת, תחלואה, ועלות.
מודלים רבים לפגיעה מוחית אשר מנצלים גם in vivo ו במבחנת שיטות קיימים. במודלי vivo יכול לחקות את האירוע הממשי של פגיעת הראש. עם זאת, בשל מורכבותו של מצב vivo, נגישות לרקמות של עניין הופך להיות מוגבל 2. בהבנה את התגובה הפיזיולוגית של תאים בודדים, כתוצאה מפגיעה שנגרמה, חשוב שהתאים מבודדים מההשפעות המערכתיות אשרעלול לעכב או לשנות את תגובת 5 פרט. מסיבה זו, מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6.
במערכות מבחנה שמעסיקות את השימוש של עומס מכאני לתאים או רקמות כדי לקבוע שינויים הנגרמים על ידי שיטה כזו של פגיעה פותחו. לדוגמה, שיטה ללימוד ההשפעה של פגיעה מכאנית לתאים כבר נקבעה להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 7,8,9. במודל טראומת מבחנה שהוקם לחקר מכרסמים ותגובתיות astrocyte אנושי 10 הועסקה מכשיר שליטה בלחץ זהה למה שאנו משתמשים למודל שלנו. אותה השיטה יושמה כדי לגרום ניזק ע"י מתיחה בתאי עכבר מוח microvessel אנדותל (bEnd3) 11 ו נוירונים בקליפת המוח 12,13 וכן, endoth מוחיןתאי elial מחזירונים יילוד 14. מכשיר deforms התחתון של התרבות היטב וכך לייצר מתיחת פגיעה מכאנית 10. היא גורמת פגיעה על תאים בתרבית על ידי היישום של לחץ אוויר מעל לתאים. לחץ זה יכול להסיט את הקרום שעליו התאים גדלים, ובכך מותח את התאים. דרגות שונות של מתיחה (כלומר "נמוך," מתון ", או" חמור ") יכולות להיות מושגת על ידי קביעת משך דופק לחץ האוויר ועצמת בהתאם. שיטה זו של פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר בקורלציה עם פגיעה טראומטית בvivo 7. יתר על כן , שיטה זו של פציעה מאפשרת שליטה המדויקת של הסביבה תאית והוא יכול בקלות להיות מועתק.
למרות שגישה דומה הייתה בשימוש כבר הרבה סוגי תאים אחרים במוח כולל bEnd3, המודל שלנו הוא של יתרון בכך שהוא עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבריים (cEND) שנוצרובמעבדה שלנו. קו זה תא הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB). בתרביות תאים במבחנה המשמשות כמודלים BBB צריך להחזיק מאפיינים שיאפשר להם לשמש כמסך חדירות. קריטריון חשוב אחד במודל תאים במבחנה להיות מנבא של חדירות BBB הוא שזה צריך להחזיק ארכיטקטורת תא פיזיולוגית מציאותית 15. למרות bEnd3 תאים ייחודיים להציג ציר דמוי קשקש מורפולוגיה בתרבות 16, הם מפגינים התנהגות המוךפו"גנטי סדירה במבחנה שבו הם יוצרים חללים דמויי ציסטה ולא את המבנים צינורי הרגילים בפיברין ג'לי 17. יתר על כן, כאשר התאים הוזרקו לעכברים עובריים ואת הרך הנולד, הם מושרה במהירות צמיחה גידולים קטלניים לעכברים עובריים, אך לא בעכברי בני יומם וצעירים. הוא הציע ובכך שאחד או יותר מתהליכים המסדירים את צמיחה נורמלית, הגירה, ובידול האנדותל שונו או eliminatאד בקו תא זה 18. מצד השני, הערכה מורפולוגית, immunocytochemical של מדידות שטף האנדותל וביטוי סמן BBB, bioelectric, ולהוכיח כי paracellular BBB המודל cEND שלנו היא אכן מודל מתאים של BBB 19.
האנדותל מוח in vivo מאופיין בחדירות הדוקות ביותר עם התנגדות חשמלית טרנס אנדותל (TEER) נעה בין 2,000-5,000 Ωcm 2. ללימודים של נכסי מכשול microvasculature מוח לתרופות, יש לשקול מגבילי paracellular ואטימות של התאים. ברוב תאי אנדותל נימי במוח (BCEC), זה לא נשמר כTEER תערוכת התאים הנע 50-100 Ωcm 2 20. BEnd3 שורת תאי אנדותל המוח הונצח מייצר ערכי TEER של לא יותר מ -60 Ωcm 2 15. בניגוד התמיינות של תאי cEND עם מדיום המכיל סרום מופחת תצוגהערכים הנעים TEER 300-500 Ωcm 2 19,21.
עד כה, במודלים חוץ גופית של פגיעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית הם נדירים. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמשים כמודל של BBB עשוי להיות שימושית. בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה שיכול לחקות את ההשפעה בפועל שתאי מוח, תאי אנדותל כלי הדם במוח במיוחד של BBB, מקבלים במהלך TBI. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהסכום של פגיעה מוחל על התאים, כמו גם ניתן לשלוט בקלות בסביבה תאית באופן מדויק המאפשר שחזור קל של ניסיוני ההגדרה.
Protocol
1. זריעה של תאי האנדותל לתוך צלחות גם
- טפח את תאי אנדותל כלי הדם במוח עכבריים (cEND) בבקבוק התרבות T75, שינוי המדיום (DMEM המכיל 10% FCS, 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) פעמיים בשבוע, עד שיגיע למפגש. (לדור וההנצחה של תאי אנדותל כלי הדם במוח, אנא עיין Burek et al, 2012;. פורסטר ואח', 2005 21,19.).
- לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). הסר את PBS וtrypsinize את התאים עם פתרון טריפסין-EDTA חם 2 מ"ל.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד ששכבת התאים מפוזרת.
- הוסף 8 מיליליטר מדיום התרבות לתוך התאים. הקש בקבוק מספר פעמים לנתק את התאים.
- צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מוחלט מבקבוק.
- בינוני פיפטה עם תאים מנותקים למעלה ולמטה. מערבולת את הבקבוק כדי לערבב suspensi התאב.
- קח 20 μl של ההשעיה התא, הכניס לתוך hemocytometer ולספור את מספר התאים.
- לקבוע את צפיפות תאי זרע ו20,000 תאים / 2 ס"מ לתוך הבאר.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך collagen1 precoated תרבות צלחות 6 גם גמישה בעל תחתית (57.75 ס"מ 2) בהיקף כולל של 3 מ"ל / היטב. לכל אחד יש גם שטח של 9.62 ס"מ 2.
- לגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שמחוברות אחת. לשנות את התרבות בינוני פעמיים בשבוע.
2. התמיינות תאים לפני הפגיעה הנגרמת על מתיחה
- לשנות את התרבות בינונית של התאים עם מדיום התמיינות (DMEM המכיל 1% סרום-הפשיטו עגל בסרום עוברי (ssFCS), 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין).
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
3. פגיעה הנגרמת על מתיחה של תאי האנדותל
- הפעל את התקן בקר פציעת התא.
- הגדר את העיכוב עד 50 אלפיות שנייה.
- הגדר את לחץ הרגולטור ל -15 PSI ולחץ על ההדק כמה פעמים, עד שלחץ השיא הרשום הופך להיות יציב.
- הגדר את לחץ הרגולטור לערך הרצוי. השתמש בטבלת מס '1 כמדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה.
- מניחים את צלחת התרבות גמישה בעל תחתית 6 היטב (57.75 ס"מ 2) למחזיק המגש. ודא כי הבורר גם מוגדר היטב בגודל הנכון (כלומר גם גדול).
- הנח את תקע מתאם חוזקה מעל הבאר. החזק את התקע בחוזקה למקומו ביד אחת ואילו השני דוחפת את היד על ההדק.
- רשום את שיא הלחץ שנוצר.
- מייד לשים את הצלחת בחזרה לתוך 37 ° C חממת האורך הרצוי של זמן או להשתמש באופן מיידי להצלחת ניסויים או הערכה.
4. הערכה של פגיעה למתוח על ידי assay ספיג דיי
- מייד לאחר שהתאים היו strחרוט (שלב 3.7), להוסיף 30 μl של פתרון 1 מ"ג / מ"ל של כדאיות כתם שפועל כסמן cytotoxicity (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד) למדיום הסלולרי התרבות (הערה: 10 μl של הפתרון לצבוע הוא לשמש עבור כל מ"ל של מדיום תרבות תאים).
- עם התוספת של הצבע לתאים, להציג באופן מיידי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
5. הערכה של פגיעה על ידי מתיחת קטט דהידרוגנאז (LDH) שחרור
- מייד לאחר מתיחת התאים (שלב 3.7), להסיר 200 μl של מדיום תרבית תאים מהבאר. לעשות את אותו הדבר עבור כל נקודת זמן שלאחר פציעה שאתה רוצה לכלול בחקירה של LDH שחרור שלך (כלומר, לדוגמה: 30 דקות, שעה 1, 2 שעות, וכו '.)
- צנטריפוגה תרבית תאים בינוניות בהגדרה הגבוהה ביותר של microcentrifuge במשך 5 דקות כדי להסיר כל פסולת תא. הסר את supernatant ולהשתמש בזה לשלבים שאחריו.
- ברגע שאתה hשד 'סיים שלב 5.1 ולקח את הדגימות הדרושות שאתה רוצה יש לי מהנקודות הזמן השונות שהיית רוצה לחקור, lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה הכלול בערכת LDH assay (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד).
- שים 100 μl של מדיום assay נכלל בassay kitto כל גם צלחת 96 בארות המסופקת בערכה.
- שים 100 μl של מדיום תרבית התאים ללא תא לשתי בארות מקבילות של צלחת 96-בארות כלולות בערכת assay.
- דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- קראו את הספיגה ב 492 ננומטר.
Representative Results
תאים בתרבית על קולגן אני precoated תרבות צלחות תחתיות 6 גם גמישות (57.75 ס"מ 2) נחשפו לדרגות שונות של פציעת מתיחה באמצעות המכשיר הסלולרי של האלונקה. לאחר חשיפת התאים לפגיעה, הם נבדקו תחת המיקרוסקופ לתופעות של פגיעה הנגרמת מתיחה למורפולוגיה של תאים. זה היה ציין כי מידה כמו גדולה יותר של קטע הייתה מוחלת על התאים במידה רבה יותר של עיוות תא גם יכולה להיבחן (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 1 א, תאי בקרה שלא היו נתונים לפגיעה מופיעים תאי אנדותל כלי דם במוח כצורה באופן קבוע (cEND) ללא כל אינדיקציה לנפיחות תא או עיוות. כאשר פציעת מתיחה יושמה (איורים 1 ב-D), עיוות יכולה להיבחן תחת מיקרוסקופ האור. לאחר מתיחת התאים קשה עם לחץ שיא בין 3.5-4.5 PSI, תאי cEND הופיעו חזר בו במידה ניכרת, נפוח ומעוות עם לא מרחבים אינטר מסוגלים. בנוסף, ספיגה של כדאיות כתם (ריכוז 100 ננומטר סופי) עלתה גם היא כמידת פגיעת מתיחה הוגדלה (איור 2). הכדאיות בשימוש הוא כתם צבע impermeant לתאים בריאים שהופך permeant כאשר שלמות קרום הפלזמה של תאים נפגעת. הצבע לא נכלל רוב תאי הבקרה, ולכן, רק מעטים מהתאים היו מוכתמים (איור 2 א), בהשוואה לתאים מתוחים (איורים 2 ב-D). יותר תאים fluoresced ירוקים עם מידה מוגברת של פגיעה במתיחה.
כסמן ביוכימי של פגיעה, שחרורו של קטט דהידרוגנאז (LDH) אנזים נבחן גם על פי הוראות יצרן. איור 3 מראה כי פציעת מתיחת תא הגדלת נגרמה שחרור הגדלת LDH.
928/50928fig1.jpg "width =" 500px "/>
איור 1. בחינת אור מיקרוסקופית של תאים נורמלים לעומת פצועים. () monolayer תא מחוברות unstretched רגילה ארזה istightly והמוארכת. כאשר תאים נמתחו על ידי יישום לחץ דופק שיא של 1.8-2.0 PSI (מתיחה נמוכה, כלומר) הם מופיעים פחות קומפקטי, מרחבים מסומנים על ידי חצים (ב '). כאשר התאים שנפצעו באורח בינוני עם דופק שיא לחץ 2.5-3.0, חלקם הופיעו נפוח ומעוות (C). התאים הופכים חזרו עם מתיחה חמורה של 3.5-4.5 psi, כפי שצוין על ידי חץ (ד '). ההגדלה 100x. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. פלואורידבדיקה מיקרוסקופית של escence תאים נורמלים לעומת תאים פגועים טופלו 2hr כתם כדאיות לאחר פציעה: תאי בקרת unstretched BD: תאים מתוחים (B - נמוך, C - מתון, D - חמור).... ההגדלה 100x. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. שחרור חומצת החלב דהידרוגנז LDH () אנזים לsupernatant לאחר פציעת מתיחה. LDH משתחררים למדיום התרבות נמדד במרווחי זמן שונים לאחר פגיעה הנגרמת מתיחה. LDH בא לידי ביטוי כאחוז מסך releasable LDH LDH (בתקשורת בתוספת תאים). ערכים הם ± SEM. N עבור כל נקודת זמן הוא 5, פרט ל0 HR Value נתון למתיחה חמורה כאשר n = 3. שחרור LDH מהתאים שהיו נתונים למתיחה נמוכה ובינונית לא היה שונה באופן משמעותי מזו של פקדי unstretched ואחד מהשני. תאים שנמתחו קשות שחררו כמות גדולה יותר באופן משמעותי של LDH בהשוואה לכל דוגמאות אחרות, למעט המדגם נמתח במתינות בשעה 1. (P <0.05, גורם אחד ניתוח שונה, שיטה הולם-Sidak). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
טבלת מס '1. מדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה.
| לחץ רגולטור | לחץ שיא | מידת הפגיעה |
|---|---|---|
| 15 psi | 1.2-1.5 PSI | <נמוך |
| 20-25 psi | 1.8-2.0 PSI | נמוך |
| 30-35 psi | 2.5-3.0 PSI | למתן |
| 40-50 psi | 3.5-4.5 PSI | חמור |
| 60 psi | 4.8-6.0 PSI | > חמור |
Discussion
את ההשפעות של פגיעה מכאנית במבחנה נחקרו ושיטות הוקמו במשך האסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 8, 9, 22. יש, עם זאת, נכון להיום עדיין לא ידוע במודל במבחנה של פציעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית. מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמש כמודל של מחסום דם המוח (BBB), כגון מה מתנות הפרוטוקול שלנו עשויות להיות שימושית.
פרוטוקול זה עושה שימוש בתאי cEND, מודל שהוקם BBB במעבדה שלנו. מאז התמוטטות BBB לעתים קרובות תועדה בחולי TBI וTBI קשור לעתים קרובות לשיבוש BBB אשר עלול לגרום להיווצרות בצקת 23, 24, שיטת prèsented כאן עשויים דווקא לשמש בביצוע מחקרי BBB ביחס לTBI.
במודל זה, חשוב לטפל בכמה מעלות מפציעת מתיחה מוחלות על התאים. באותה מידה כמו התאים נפצעו בכל מקרה, ועם כל מה כמות הלחץ מוחל, מידת פגיעה שיכול להשפיע על תאי האנדותל שונה בהרבה מאוד מסוגי תאים אחרים. תאי האנדותל אבי העורקים הם עמידים יותר בפני פגיעה מלמתוח האסטרוציטים או תאי גלייה מעורבים 9. בנוסף, הם לתקן במהירות רבה יותר לאחר פציעה בהשוואה לסוגי התאים האחרים. לכן, לתאי מוח, תאי אנדותל במיוחד cEND, כמות גדולה יותר של פציעת מתיחה יש צורך לייצר רמה גבוהה של פציעה. אפשר להשיג את המידה הרצויה של פגיעה על ידי יישום הלחץ המקביל שצוין בטבלת 1. לתאי cEND, לעומת זאת, פגיעה קשה היא מועדפת בשל התנגדותם למתח. מבחני שנערכו הראו LDHשככל שהמידה של עליות מתיחה, יותר LDH מופרש לתוך הנוזל העליון. לעומת זאת, בתאים שקבלו כמות נמוכה של פציעת מתיחה הופקו LDH בסכום דומה כדי לשלוט בתאים. כפי שצוין בפרוטוקול, יש לדאוג שהכמות המתאימה של מדיום משמשת מאז עלייה או ירידה בכמות בינונית עלולה לגרום להבדלים בלחץ השיא להחיל את הבארות. לדוגמה, המכיל 5 מ"ל גם של נוזל רושם שיא בלחץ הממוצע של 4.0 PSI ואילו גם ריק רושם ממוצע של 3.8 PSI כאשר לחץ psi 45 מוחל. לכן, הדרך הטובה ביותר הוא לדחוף את ההדק מספר פעמים על שליטה גם על מנת להבטיח כי לחץ השיא שיופק מתאים לכמות הרצויה.
בניסויים שלנו השתמשנו כדאיות כתם כדי לקבוע את האפקט של מתיחה לחדירות של קרום התא. אופטיקה של צלחות התרבות גמישות התחתיות ששמשנו אותנו מאפשרת לנו VIEW התאים המוכתמים ישירות מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, כשרוצים לבצע מחקרי immunolabelling ישירות לאחר המתיחה פציעה, עלולים להתעורר קשיים. ראשית, בגודל ובעובי של הצלחת עלול להוות בעיה עם כמה פלטפורמות צפייה מיקרוסקופ. שנית, אופטיקה של הקרום גמיש של גם עשויה להיות מכשול כדי לנקות צפייה.
למרות המגבלות הנ"ל, לעומת זאת, הליך המתואר יכול לשמש כמודל לפגיעה מכאנית במבחנה של BBB. פגיעה מוחית טראומטית (TBI) כוללת שני רכיבים, כלומר, איסכמיה וטראומה. איסכמיה יכולה להתרחש כפגיעה משנית בעקבות TBI במקרים שבם יש אובדן דם חמור וכתוצאה מכך לחץ דם נמוך או כתוצאה מנפיחות במוח המגביל את אספקת חמצן למוח. זה נחשב נזק מושהה, nonmechanical מייצג תהליכים פתולוגיים ברציפות ביוזמת ברגע של פציעה 25. המופע של היפוקסיהפגיעה מוחית טראומטית חמורה חרו נפוצה 26. קיפוח גלוקוז חמצן (OGD) הוא השיטה כרגע בשימוש לאיסכמיה מודל במבחנה. לפיכך, חשיפת תאים לOGD כעלבון משנית לתאים לאחר מתיחה יכולה לחקות את השכיחות של TBI אחרי איסכמיה. לפיכך, כדי לשפר את המודל הנוכחי שלנו במבחנה של TBI ודפוס זה קרוב ככל האפשר לTBI בפועל כפי שהוא מתרחש in vivo, בעתיד אנחנו גם יעסיקו OGD בשילוב עם פציעת מתיחה.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG, גרמנית Research Foundation) תחת מספר מענק FO 315/4- ותכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופית (FP7/2007-2013) על פי הסכם גרנט מס בריאות F2-2009-241,778 ל CF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
- Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
- Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
- Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L.
- Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
- Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
- Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
- Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
- McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
- Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
- Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
- Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
- Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
- Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
- RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
- Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
- Rubin, L. L., Hall, D. E., et al.
- Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
- Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
- Werner, C., Engelhard, K.
- Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).
