Summary
インビトロで外傷性脳損傷モデルは、in vivo脳の変形が再現するために開発されている。延伸誘起損傷は星状細胞、神経細胞、グリア細胞、大動脈、脳内皮細胞のために用いられている。しかし、我々のシステムは、in vitro TBIモデルで確立するためにこちらの正当なモデルを構成する特性を持っている血液脳関門（BBB）モデルを使用しています。
Abstract
高い死亡事件が原因でどちらが優れ、それに関わる根本的なメカニズムは、治療に有用である理解することができるようになる方法は、外傷性脳損傷（TBI）によってもたらされる。 生体内で 、この目的のために利用可能なin vitro法の両方があります。それはTBI中に発生するようにin vivoモデルでは実際の頭部外傷を模倣することができます。しかし、in vivoでの技術で細胞生理学レベルでの研究のために悪用されることはない可能性があります。彼らは操作のための細胞や細胞外環境への容易なアクセスを提供するので、したがって、in vitro法では、この目的のために、より有利で ある。
我々のプロトコルは、脳微小血管内皮細胞におけるTBI用いストレッチ傷害のin vitroモデルにおいて提示する。これは、可撓性底ウェルで培養した細胞に加えられる圧力を利用する。加えられた圧力を容易に制御することができ、低速から重度の範囲であることが損傷を作り出すことができる。ネズミ我々の研究室で生成された脳微小血管内皮細胞（CEND）したがって、同様の手法を用いる他のシステムに利点を提供する血液脳関門（BBB）のために十分に相応しいモデルである。加えて、この方法の簡略化のために、実験的なセットアップが容易に複製される。したがって、このモデルはBBBでTBIに関与する細胞および分子機構を研究に用いることができる。
Introduction
外傷性脳損傷は（TBI）は、世界中の死亡の主要な原因の一つである。約1000万人がTBIそれ主要な保健医療問題1することで、毎年影響を受けます。これにより、in vivoおよび TBIのin vitroモデルは、その種々の機構2,3,4を研究するために設立され、開発されている。TBIのより良い理解は、患者の治療を改善し、関連する死亡率、罹患率およびコストを削減することができます。
in vivoおよびin vitro法の両方で利用する脳損傷のための多くのモデルが存在する。vivoモデルでは頭部外傷の実際のイベントを模倣することができます。しかし、 生体内の状況での複雑さに起因し、興味のある組織へのアクセシビリティが2に限定となります。与え傷害の結果として、個々の細胞の生理反応を理解する上で、細胞がその全身作用から隔離されていることが重要である個々の応答5を阻害したり、変更することがあります。細胞の機械的な環境は6精密に制御することができるので、このような理由から、外傷の細胞モデルは、動物モデル上の貴重な利点を提供する。
損傷のこのような方法によって誘導される変化を決定するために細胞または組織への機械的負荷の使用を用いるインビトロ系が開発されている。例えば、細胞への機械的損傷の影響を研究するための方法は、星状細胞、神経細胞、グリア細胞および大動脈内皮細胞7,8,9のために確立されている。 10、我々 は我々のモデルのために使用するものと同一の圧力制御装置を採用したげっ歯類とヒトのアストロサイトの反応性の研究のために確立されたin vitroでの外傷モデルである 。同様の方法は、マウスの脳微小血管内皮細胞（bEnd3）11と皮質ニューロンとして12,13と同様、脳endothでストレッチを通して怪我を誘発するために適用された生まれたばかりの子豚からelialセル14。デバイスはメカニカルストレッチ傷害10を生産するだけでなく、それによって文化の底部を変形させる。それは、細胞上の空気の加圧により培養細胞時に怪我を負わせる。この圧力は、それによって細胞を伸ばして、細胞が成長してその上に膜をそらすことができます。ストレッチ種々の程度は、（ " すなわち "低"、中等度"又は"重度）に応じて空気圧パルス持続時間と強度を設定することによって達成することができる。延伸誘起損傷するこの方法は、 インビボ17.78外傷と相関している。また、傷害のこの方法は、細胞外環境の正確な制御を可能にし、容易に再生することができる。
同様のアプローチがbEnd3を含む他の多くの脳細胞タイプに使用されてきたが、我々のモデルは、マウス脳微小血管内皮細胞の使用（CEND）が生成させるという点で有利である我々の研究室である。この細胞株は、血液脳関門（BBB）を十分に相応しいモデルである。BBBモデルとして用いるin vitro細胞培養物において、それらの透磁率画面として機能するのを可能にする特性を有するべきである。 インビトロ細胞モデルの BBB透過性の予測因子であるための一つの重要な基準は、それが生理的に現実的なセル構造15を有しているべきであるということである。 bEnd3細胞は、培養16で独特の紡錘のような扁平な形態を表示するにもかかわらず、彼らはむしろフィブリンゲル17の正規管状構造より嚢胞のような空洞を形成することにより、それらはin vitroで不規則な形態形成挙動を示す。さらに、細胞は胚及び新生マウスに注入したとき、彼らはなく、新生児および若年マウスにおける胚性マウスに致死急速に増殖する腫瘍を誘導した。従って、正常な内皮細胞増殖、遊走、および分化を支配するつまたは複数のプロセスが変更またはeliminatされていることが示唆されているこの細胞株18編一方、内皮細胞およびBBBマーカー発現、生体および傍細胞磁束測定の形態学、免疫細胞化学的評価は、我々のBBBモデルCENDが実際BBB 19の適切なモデルであることを示している。
in vivoでの脳内皮は2,000-5,000Ωcmの2に至るまでの経内皮電気抵抗（TEER）と非常にタイトな透過性によって特徴付けられる。細胞の医薬品、傍細胞厳密さと堅さに脳の微小血管のバリア性の研究のために考慮されるべきである。細胞は50〜100Ω·cmで2 20に至るまでTEERを呈するように、ほとんどの脳毛細血管内皮細胞（BCEC）では、これは保存されません。不死化脳内皮細胞ラインbEnd3は大きくない15 2Ωcmで60以上のTEER値を生成する。含む培地でCEND細胞のコントラスト分化に血清ディスプレイを削減300-500Ωcmで2 19,21に至るまでTEER値。
現在までに、培養された脳血管内皮細胞の伸張傷害のin vitroモデルで不足している。したがって、こちらのモデルとして培養脳血管内皮細胞という行為を用いたストレッチ傷害を通じて外傷のin vitroモデルにおいて有用であることが証明されるかもしれない。このプロトコルでは、脳細胞、BBBの特に脳微小血管内皮細胞は、TBIの間に受け取った実際の影響を模倣することができるin vitroモデル提示。このモデルの主な利点は、細胞ならびに細胞外環境に適用される損傷の量を容易に実験的なセットアップを容易に再現性を可能にする正確な方法で制御することができることである。
Protocol
1。ウェルプレートに内皮細胞の播種
- コンフルエンスに達するまで、週二回（DMEM、10％FCS、50 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミンを含む）培地を変え、T75培養フラスコにマウス脳微小血管内皮細胞（CEND）養う。 （;フェルスターら 、2005年21,19。脳微小血管内皮細胞の生成と不死化のために、Burek ら 、2012を参照してください）。
- リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 PBSを削除し、2ミリリットル暖かいトリプシン-EDTA溶液で細胞をトリプシン処理。
- 細胞層が分散するまで5分間または37℃で細胞をインキュベートする。
- 細胞内に8ミリリットルの培地を追加します。細胞を分離するためにフラスコを数回タップします。
- フラスコから完全に剥離を確実にするために、顕微鏡下で細胞を表示します。
- 上下切り離さ細胞と培地をピペット。渦巻細胞suspensiを混合するフラスコ上。
- 、細胞懸濁液20μlを取り血球計数装置に入れ、細胞数を数える。
- ウェルに細胞密度と種子20,000細胞/ cm 2を決定します。
- 3ミリリットル/ウェルの総体積でアテロコラーゲンプレコート6ウェル柔軟底培養プレート（57.75センチメートル2）に細胞懸濁液を移す。各ウェルには、9.62センチメートル2の面積を持っています。
- 合流するまで、一週間37℃で細胞を成長させる。週2回培地を変更します。
2。ストレッチ誘発性傷害に先立ち細胞分化
- 分化培地（DMEM、1％血清最低限のウシ胎児血清（ssFCS）、50 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有する）を用いて細胞の培地を変える。
- 24時間37℃で細胞をインキュベートする。
3。内皮細胞のストレッチ誘発性傷害
- 細胞傷害コントローラデバイスをオンにします。
- 50ミリ秒までの遅延を設定します。
- 15 psiまでレギュレータ圧力を設定し、登録されたピーク圧力が安定するまで、トリガーを数回押してください。
- 所望の値にレギュレータ圧力を設定します。ストレッチ傷害の様々な程度を生成するためのガイドとして、表1を使用してください。
- トレイホルダーに6ウェル柔軟底培養プレート（57.75センチメートル2）を配置します。よくセレクタが正しいよくサイズ（ すなわち大ウェル）に設定されていることを確認します。
- しっかりと優に超えるアダプタのプラグを配置します。一方、トリガーを押している間は片手でしっかりにプラグを持ってください。
- 生成されたピーク圧力を記録します。
- すぐに時間の希望の長さを37℃のインキュベーターにバックプレートを置くか、または実験や評価を承継するため、直ちに使用。
4。色素取り込みアッセイによってストレッチ傷害の評価
- 細胞は、strだった直後染料溶液10μl：エッチングする（ステップ3.7）、細胞培養培地に細胞毒性マーカーとしての行為は（資機材の補足表をご覧ください）（ 注という染色生存能力の1 mg / mlの溶液を30μLを追加） 細胞培養培地の全ての溶液のために使用される 。
- 細胞に染料を添加すると、直ちに蛍光顕微鏡下で表示します。
5。乳酸脱水素酵素（LDH）リリースによってストレッチ傷害の評価
- 直ちに細胞（ステップ3.7）延伸後、井戸から細胞培養培地200μlのを削除します。あなたはLDH放出のあなたの調査に含めたいすべての時点損傷後のために同じことを行う（ つまり、例えば 30分、1時間、2時間、 など 。）
- 任意の細胞破片を除去するために5分間遠心の最高の設定で細胞培養培地を遠心分離。上清を除去し、後続のステップのためにこれを使用しています。
- 一度HAVEは、ステップ5.1を終えて、あなたは、調査LDHアッセイキット（資機材の補足表を参照してください）に含まれる溶解液を用いて細胞を溶解したい様々な時点で持っていると思います必要なサンプルをとっている。
- キットに付属の96ウェルプレートの各ウェルアッセイきっとに含まれるアッセイ培地100μlを入れて。
- アッセイキットに含まれている96ウェルプレートの二つの平行ウェルに無細胞の細胞培養培地100μlを入れて。
- 30分間37℃でプレートをインキュベートする。
- 492 nmの吸光度を読んでください。
Representative Results
私は、6ウェルフレキシブル底培養プレートをプレコートしたコラーゲン（57.75センチメートル2）上で培養した細胞は、細胞のストレッチャー装置を使用して、延伸損傷の様々な程度に供した。傷害に細胞を施した後、それらを細胞形態への伸張によって誘発される損傷の影響を顕微鏡下で調べた。これは、ストレッチの程度が大きいほど、セルの歪みの程度が大きいことも観察された細胞（ 図1）に適用したことが観察された。 図1Aに示すように、傷害に供されなかった対照細胞は、細胞膨潤や歪みの兆候ことなく、規則的な形状の血管内皮細胞（CEND）が表示されます。延伸時に怪我を適用した（ 図1B-D）、変形を光学顕微鏡下で観察することができる。 3.5-4.5 psiの間のピーク圧力で厳しく細胞を伸ばした後、CEND細胞は顕著ではないと、引っ込ん腫れや変形が登場できる間隙。加えて、延伸損傷の程度が増加染み生存の取り込み（100 nMの最終濃度）（ 図2）に増加した。生存能力は、使用される染色は、細胞の細胞膜の完全性が損なわれたときに透過になり、健康な細胞への透過性染料である。染料は、それ故に、対照細胞のほとんどから除外した延伸細胞（ 図2B-D）と比較して、細胞の少ない（ 図2A）染色した。その他の細胞がストレッチ傷害の増加度合いと緑蛍光を発し。
傷害の生化学的マーカーとして、乳酸脱水素酵素（LDH）の放出酵素はまた、製造業者の指示に従って調べた。 図は、増加するセルストレッチ損傷が増加LDH放出を引き起こした3に示す。
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図1。正常対負傷細胞の光学顕微鏡検査（A）通常延伸コンフルエント細胞単層はistightly満員と伸長。細胞は、それらが少ないコンパクトな表示され1.8-2.0ψ（ すなわち低伸張）のピーク圧力パルスを印加することによって延伸されたとき、スペースが矢印（B）で示される。細胞が適度に2.5-3.0ピーク圧力パルスが負傷したときに、それらのいくつかは、（C）膨潤して変形現れた。細胞は、矢印（D）で示される3.5〜4.5 psiの、重度のストレッチで撤回になる。 100X倍率は。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。フルーアescence正常対傷ついた細胞の顕微鏡検査損傷後の生存性染色2時間で処理した細胞：コントロール延伸セルBD：延伸細胞（B -低、C - D、中等度-重度）。。。。 100X倍率は。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。ストレッチ傷害後の上清中に乳酸脱水素酵素（LDH）酵素放出。培養培地に放出されたLDHの延伸によって誘発される傷害の後様々な時間間隔で測定した。 LDHは、全解除可能LDH（メディアプラス細胞におけるLDH）のパーセントとして表した。値は±SEMである。毎回ポイントのnは、0時間Vを除いて、5ですALUEは、n = 3の厳しいストレッチを行った。低域と適度なストレッチを行った細胞からのLDH放出は未延伸のコントロールとは、互いに有意差は認められなかった。ひどく伸びた細胞は1時間に適度に伸ばしサンプルを除く、すべての他のサンプルと比較してLDHが有意に多い量を発表した。 （P <0.05、一つの要因ANOVA、ホルム-シダック法）。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
表1。ストレッチ傷害の様々な程度を生成するためのガイド。
| レギュレータ圧力 | ピーク圧力 | 損傷の程度 |
|---|---|---|
| 15 PSI | 1.2-1.5 PSI | <低 |
| 20-25 PSI | 1.8-2.0 PSI | ロー |
| 30-35 PSI | 2.5-3.0 PSI | 適度 |
| 40-50 PSI | 3.5-4.5 PSI | 厳しい |
| 60 PSI | 4.8から6.0 PSI | >重度 |
Discussion
星状細胞、神経細胞、グリア細胞および大動脈内皮細胞8、9、22のためのin vitroでの機械的損傷の影響が研究されているおよび方法が確立されている。それでも、培養脳内皮細胞における延伸損傷のin vitroモデルにおいて知られてない今日まで、ただし、存在しない。細胞の機械的な環境は6精密に制御することができるので、外傷の細胞モデルは、動物モデル上の貴重な利点を提供する。したがって、培養内皮脳細胞を用いたストレッチ損傷を介し外傷のin vitroモデルにおいて 、そのような提案プロトコルプレゼントが有用になるかもしれないものと血液脳関門（BBB）モデルとして作用する。
このプロトコルはCEND細胞の使用、私たちの研究室で確立されたBBBのモデルになります。 BBBの内訳は、しばしばTBI患者で文書化され、TBIはしばしば浮腫形成23、24になることがBBBの混乱にリンクされているので、このメソッドはPRESここで取得済み具体的にTBIに関連BBB試験の実施に用いることができる。
このモデルでは、セルに適用されるどのくらいストレッチ損傷の程度の世話をすることが重要である。できるだけ多くの細胞がどのような場合には負傷しているように、かつ適用される圧力のどんな量では、内皮細胞に影響を与えることが怪我の程度は他の細胞タイプからずっと大きく異なる。大動脈内皮細胞は星状細胞または混合グリア細胞9よりも損傷を伸ばすことがより耐性がある。他の細胞型と比較して、さらに、それらは損傷後のより迅速に修復する。したがって、脳内皮細胞、特にCEND細胞、伸張損傷の量が多いための損傷の高度を生成するために必要とされる。一つは、 表1に示す対応する圧力を印加することによって、所望の程度の損傷を達成することができる。 CENDセルの場合、しかし、深刻な怪我は、歪みに対する耐性のために好ましい。実施LDHアッセイは示した伸縮度が増加するなど、よりLDH、上清中に分泌される。対照的に、伸張損傷の少量を与えられた細胞は、細胞を制御する同様の量のLDHを生成した。プロトコルで述べたように、一媒体の量の増加または減少がウェルに印加されるピーク圧力の違いにつながる可能性があるため、適切な量の媒体が使用されていることを注意しなければならない。 45 psiの圧力が印加されるときに、空のウェルが3.8 psiでの平均値をレジスタたとえば、流体のウェルを含有する5ミリリットルの4.0 psiでの平均のピーク圧力を登録する。そのため、生成されるピーク圧力が所望の量に対応することを確実にするために十分にコントロールの上にトリガーを数回プッシュするのが最善です。
我々の実験では、生存、細胞膜の透過性への伸張の影響を決定するために使用される染色。我々が使用する柔軟な底培養プレートの光学系は、VIすることを可能にEW直接顕微鏡下で染色された細胞。しかし、一つは直接ストレッチ損傷後の免疫標識の研究を実施したい場合、困難が生じることがあります。まず、プレートのサイズ及び厚さは、いくつかの顕微鏡観察プラットフォームの問題を引き起こすことがある。第二に、井戸の可撓性膜の光学系は、表示をクリアするには支障があります。
上記の制限にもかかわらず、記載された手順は、BBBのインビトロでの機械的損傷のモデルとして使用することができる。外傷性脳損傷は（TBI）2すなわちコンポーネント、、虚血や外傷を伴う。虚血、低血圧や脳の結果として得られた重篤な血液の損失があった場合の例でTBI後の脳への酸素供給制限を膨潤させる二次的損傷として生じ得る。これは、傷害25の瞬間に開始の連続した病理学的プロセスを表す遅延、非機械損傷とみなされます。低酸素症の発生上げ装置重度の外傷性脳損傷は、一般的な26です。酸素グルコース欠乏（OGD）は、現在、in vitroでのモデルの虚血に使用されているメソッドです。このように、ストレッチの後に細胞に二次的な侮辱としてOGDに細胞をさらすことは虚血に続くTBIの発生率を模倣することができます。したがって、のin vitroモデルで私たちの現在を改善するためのTBIとできるだけ近く実際のTBIに、それは、生体内で発生するようなパターンを、将来的に我々はまた、ストレッチ傷害と組み合わせOGD採用する。
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この研究は、グラント契約番号HEALTH-F2-2009から241778に基づく付与数FO 315/4-下ドイツ学術振興（DFG、ドイツ研究協会）と欧州連合（EU）第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）によってサポートされていましたCF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
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