Summary
세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.
Abstract
망막의 빛 감지 세포, 즉 광수용체의 손실로 인한 시력 장애 및 실명은 선진국에서 장애의 주된 이유를 나타냅니다. 세포 이식에 의한 퇴화 광수용체의 교체는 향후 임상 적용에서 가능한 치료 옵션을 나타낸다. 실제로, 최근 전임상 연구는 산후 4일째에 신생아 마우스 망막에서 분리된 미성숙광수용체가 침전 이식 후 성인 마우스 망막에 통합될 가능성이 있음을 입증했습니다. 기증자 세포는 내과성 양극성 세포에 근접하여 내부 및 외부 세그먼트, 외부 핵 층에 위치한 둥근 세포 체, 시냅스 말기를 포함한 성숙한 광수용체 형태를 생성하였다. 실제로, 최근 보고서는 기증자 광수용체가 기능적으로 숙주 마우스의 신경 회로에 통합한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 세포 교체 접근법의 향후 임상 적용을 위해, 선택의 세포의 정제 된 현탁액을 생성하고 눈에 적절한 통합을위한 올바른 위치에 배치해야합니다. 광수용체 전구체의 농축을 위해, 선별은 기증자 세포의 유전 기자 수정을 피하기 위하여 특정 세포 표면 항원에 기초해야 합니다. 여기서 우리는 자기 관련 세포 선별(MACS) -세포 표면 마커 CD73에 기초하여 광수용체 특이기자 마우스의 신생아 망막으로부터 분리된 이식 가능한 막대 광수용체 전구체의 농축을 보여준다. 항 CD73 항체를 함유한 배양은 마이크로 비드 컨쥬게이드 이차 항체에 이어 MACS에 의한 로드 광수용체 전구체의 농축을 약 90%까지 허용하였다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 GMP 표준에 더 쉽게 적용할 수 있으며 많은 양의 세포를 상대적인 짧은 기간에 정렬할 수 있다는 장점이 있습니다. 성인 야생형 마우스의 하수 공간에 농축된 세포 현탁액을 주입하면 분류되지 않은 세포 현탁액에 비해 3배 더 높은 통합률을 보였습니다.
Introduction
시력은 인간의 주요 감각 중 하나입니다. 이러한 감각과 실명의 장애는 선진국의 장애의 주된 이유 중 하나입니다. 시력 장애 또는 실명에 대한 주된 원인은 황반 변성, 망막 색소, 콘로드 이영양증 및 기타 조건에서 관찰될 수 있으므로 광수용체 세포 손실을 특징으로 하는 망막 변성입니다. 현재까지 잃어버린 시력을 복원하는 효과적인 치료법은 제공되지 않습니다. 2006년과 2008년에 는 서로 독립적으로, 영성 야생형 마우스망막1,2로막대 광수용체 전구체 세포를 성공적으로 이식하는 두 개의 상이한 실험실을 보고하였다. 따라서, 광수용체 전구체 세포 이식의 가능성을 발생시키고 또한 퇴화 된 망막으로, 퇴화 광수용체를 대체하고 시력을 회복시킨다. 실제로, 최근에는 이식된 광수용체 전구체세포가 제대로 발달된 외부 세그먼트3,시냅스 말단과 외부 핵층2-4에위치한 둥근 세포 체와 근접한 성숙한 야생형 광수용체의 형태학적 기준을 유도하고 있으며, 뿐만 아니라, 소각 회로 신경에 기능적으로 통합할 수 있는 능력도 입증되었다. 이 전략의 주요 원리 중 하나는 산후 4일 (PN 4, PN0은 출생의 날로 정의) 젊은 마우스 망막의 사용으로, 이식을위한 다른 세포 유형의 혼합물의 결과. 미래의 치료 응용 프로그램의 배경에, 이 혼합물은 광수용체 전구체 세포에 대해 정제되어야한다. CD73은 망막8-10에서젊은 광수용체에 대한 제1 세포 표면 마커로 기재되었다. 여기서, 우리는 이러한 세포 표면 마커에 기초하여 광수용체 전구체 세포 정화 방법을 시연하고 자기 관련 세포 선별(MACS) 기술을 사용한다. MACS는 빠른 정렬 시간과 GMP 조건에 대한 쉽게 조정으로 인해 형광 활성화 셀 정렬 기술에 비해 장점이 있을 수 있습니다. 우리는 성인 야생 형 망막에서 하수 공간으로 농축 된 인구를 이식 할 때 ~ 90 % 농축 및 최대 3 배 높은 통합 률을 입증 할 수 있습니다. 따라서 MACS 기반 광수용체 전구체 세포 농축 및 피망 이식은 망막 퇴성의 치료를 위한 재생 치료 전략의 개발을 위한 신뢰할 수 있고 유망한 기술이다.
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Protocol
동물의 윤리적 사용 및 관리 성명서:
모든 동물 실험은 유럽 연합 및 독일 법률 (Tierschutzgesetz)에 따라 엄격하게 수행되었으며 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 모든 동물 실험은 TU 드레스덴과 Landesdirektion 드레스덴의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다 (승인 번호: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. 세포 절개 및 셀 정렬을 시작하기 전에
- 세 개의 15ml 반응 튜브라벨: 세척(W), 포지티브 분수(+) 및 음수분(-).
2. 망막 해리
- 가위를 사용하여 PN 4 새끼를 참수하십시오.
- 강아지의 머리를 70 % 에탄올로 헹구고 PBS에서 세척합니다.
- 머리를 차가운 HBSS로 옮기고 눈을 방출합니다 (모든 머리에 대해이 단계를 반복하십시오). 신경을 방출하려면 눈꺼풀을 열고 시신경 부위의 곡면으로 눈을 고정시합니다. 그런 다음 시야를 조심스럽게 궤도밖으로 끌어냅니다.
- 모든 눈을 방출 한 후 망막을 분리하십시오 : 닫힌 가위를 시신경에 도입하고 블레이드를 엽니 다. RPE /chorid 밖으로 peal. 구부러진 집게를 사용하여 렌즈와 혈관을 제거합니다.
- 분리된 망막을 파팡 용액을 함유하는 1.5 ml 반응 튜브로 옮김(파팡 해리 키트에 의해 제공).
- 37°C에서 수조 또는 셰이커(400rpm)에서 30-60분 동안 파팡 용액의 망막을 배양한다.
- 망막은 파팡 용액에 배양하는 동안, 15ml 반응 튜브 (라벨 "1")에 ovomucoid 용액의 파이펫 1 ml.
- DNase I (10 mg/ml) + ovomucoid 용액 60 μl (키트제공) + EBSS 520 μl을 15ml 반응 튜브 (라벨 "2")에 추가합니다.
- 파파인 인큐베이션 후, 부분적으로 소화된 망막을 포함하는 파팡 용액을 반응 튜브 "2"로 전달한다.
- 불을 연마한 파이펫을 사용하여 기계적 해리(10배 상하)를 수행합니다.
- 파이펫 반응 튜브 "1"에 단일 셀 서스펜션. 난소용액 위에 셀 서스펜션을 부드럽게 겹쳐서 2층을 생성해 보십시오.
- 300 x g (약 1,300 rpm)에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상체를 버리고 MACS 버퍼의 500 μl에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
3. 자기 연관된 세포 분류(MACS)를 사용하여 셀 정렬
- 10 μg/ml의 최종 농도를 달성하기 위해 X μl 쥐 항 CD73 항체를 500 μl에 첨가하십시오.
- 얼음에 5 분 인큐베이션.
- MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 10ml로 채우고 원심분리기는 300 x g의 속도로 5 분 동안 작성합니다.
- 상부체를 제거합니다.
- 480 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 염소 안티 쥐 IgG 마이크로 비드의 120 μl을 추가합니다.
- 얼음에 15 분 인큐베이션; 동요하지 마십시오, 흔들어 또는 혼합.
- MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 5ml로 채우고 원심분리기는 300 x g에서 5 분 동안 작성하십시오.
- 반응 튜브가 원심 분리됨에 따라:
- LS 컬럼을 마그네틱 스탠드에 조정합니다.
- LS 열 위에 사전 분리 필터를 놓습니다.
- 3ml MACS 버퍼로 프리분리 필터와 LS 컬럼을 수분화하고 MACS 버퍼를 세척(W) 튜브로 수집합니다.
- 상부체를 제거합니다.
- 500 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 500 μl 셀 서스펜션을 필터에 로드한 다음 필터에 1ml MACS 버퍼를 추가하고 음극분획(-) 반응 튜브에 음극기를 수집합니다.
- 그런 다음 컬럼에 3 x 3 ml의 MACS 버퍼를 추가하여 열에 바인딩되지 않은 셀을 씻어 내다
- 이 9ml가 LS 컬럼을 통과하면 자기 스탠드에서 컬럼을 제거하고 양극분수(+) 반응 튜브 위에 설치합니다.
- LS 열에 5 ml의 MACS 버퍼를 빠르게 로드하고 LS 열에 플런저를 넣고 전체 버퍼가 열을 통과할 때까지 아래로 누릅니다.
- 300 x g에서 5 분 동안 양성 분획을 포함하는 반응 튜브를 원심 분리합니다.
- 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 μl에서 다시 중단하고 4 °C에서 유지하십시오.
- 공통 셀 계수 장치를 사용하여 셀의 총 양을 계산합니다.
- MACS 버퍼에서 2 x 105 셀/μl을 포함하는 양극 분수에서 셀 서스펜션을 준비하고 4°C에서 보관하십시오.
4. 마우스 망막에 MAC 정렬 광수용체 전구체 세포의 이식
- 다음 의 모든 솔루션을 준비해야 합니다: 1ml 멸균 PBS 또는 HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml 멸균 제H2O, 4°C에서 셀 서스펜션 분획의 알리쿼트.
- 메데토미딘 염산염(0.01 mg/10g 체중), 케타민(0.75 mg/10g 체중)의 인트라피오네 주사로 성인마우스(즉, 2-4개월)를 마취한다. 그런 다음 통증 완화를 위해 Buprenorphine (0.05 mg/kg 체중)의 피하 주사를 수행하십시오.
- 페닐레프린 2.5%-트로피카미드 0.5% 하락으로 동공을 넓히게 한다.
- 마우스 헤드 홀더에 마우스를 고정하고 스테레오 현미경 아래에 배치합니다.
- 눈의 건조를 방지하기 위해 Visidic 젤 한 방울을 바르십시오.
- 바늘에 멸균 30 G 1/2를 사용하여 clera와 각막 (각각 오라 세라타)사이의 경계에 작은 구멍을 확인합니다.
- 다이아몬드 펜을 사용하여 일반적인 커버 슬라이드를 작은 (약 5mm x 5mm) 조각으로 자르고 각막 위에 이 조각 중 하나를 배치하여 망막의 직접 시각화를 허용합니다.
- 미리 살균 된 마이크로 리터 주사기를 탈화 된 물로 여러 번 플러시하십시오.
- 마이크로리터 주사기를 셀 서스펜션 1μl로 적재하고, 결막과 클era를 통해 직접 바늘을 접선으로 적재하고 망막의 비강 반의 비강에서 시각적 제어 하에 놓습니다.
- 망막에 구멍을 부드럽게 뚫고 침전 공간에 도달할 때까지 셀 서스펜션을 적재 공간에 주입합니다.
- 결막의 황소 분리를 관찰, 어떤 출혈없이 망막 공간의 약 1/4를 커버, 균일해야한다.
- 주사기를 부드럽게 인출하면 망막 구멍 씰이 자동으로 밀봉됩니다.
- 마이크로리터 주사기를 탈온화물로 여러 번 플러시합니다.
- 헤드 홀더에서 마우스를 놓습니다.
- 메데토미딘 염산염 효과의 반전을 위해 아티파노졸 염산염을 주입하여 마우스를 깨우는 다.
- 따뜻한 어두운 챔버 (약 25 °C)에서 일어나 시간을 위해 마우스를 놓습니다.
- 이식 후 다음 2일, 부프레노르핀(0.05 mg/kg의 체중)은 통증 완화를 위해 아침과 오후에 피하 주사에 의해 투여되어야 한다.
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Representative Results
마우스 망막에 통합하는 막대 광수용체의 능력을 평가하기 위해 마우스 리포터 라인이 사용되었으며, GFP는 신경망막 류신 지퍼(Nrl, Nrl-GFP)프로모터(11)에의해 구동된다. Nrl은 항봉 광수용체세포의 특정 라벨링을 허용하는 성인기 전반에 걸쳐 E12.5에서 발현을 시작하는 로드 광수용체의 초기 마커이다.
PN 4 Nrl-GFP 새끼는 참수되었고 눈이 에클레아트되었습니다. 망막은 그 때 위에서 기술한 방법을 사용하여 격리되고 해리되었다. 결과 셀 서스펜션은 CD73 기반 MACS(그림1 및 2)를사용하여 정렬하였다. MAC 정렬 후 이 절차 에서 달성된 농축을 분석했습니다.
도 3A에도시된 바와 같이, 초기 세포 현탁액(Input)은 30.4% GFP 양성 세포를 함유하고 있다. 막대 광수용체. CD73 기반 MAC 정렬에 이어, CD73 양성 분획(CD73+)에서 최대 86.9%의 농축이 유동 세포측정에 의해 관찰되었다. CD73-음극분획(CD73-)에서만 9.9%의 모든 세포만이 GFP(그림3A)에대해 긍정적으로 검출되었다. CD73 기반 MACS에 이어 Nrl-GFP 양성 세포의 농축은 시험관내 도금 후 추가적으로 시각화된다(그림3B).
MAC 정렬 후, CD73 양성 분획에 있는 기증자 세포는 아래로 분사되고 200,000세포/μl의 최종 농도로 재중단되었습니다. 이러한 세포 현탁액은 야생형 숙주 망막의 침전 공간으로의 이식에 더사용되었다(도 4). 이식 후 3~4주 후, 숙주 망막이 고정되고, 고립되고, 단면이 있었습니다. 여러 기증자 세포는 호스트의 외부 핵층에 통합하고 외부 핵층에서 세포체의 국소화와 시냅스 스페룰 및 내부 세그먼트의 형성을 통해 성숙한 광수용체의 형태를 획득하였다(도5). 상세한 사진은 우리의 그룹에 의해 이전에 간행되었습니다3,8 다른 그룹에 의해 망막을 호스트하기 위하여 이식된 FAC 정렬 세포와 비교가능한 결과를 보여주는4,6,10. 이러한 모든 연구에서 일관 된, 이식 된 세포 주입의 사이트에 유지, 황소 분리 된 숙주 망막에 의해 정의, 멀리 마이그레이션 하지 않습니다. 일부는 호스트 망막(즉, 외부 핵 층)에 통합하고 일부는 사수 공간3에남아 있습니다. 또한 통합 현장에서 기증자 세포의 분포는 사용되는 마우스 모델의 유형에 따라 달라지는 것으로나타났다. C57BL/6J 마우스 사이의 이식에서 급성 숙주/이식 거부 징후가 발견되지 않았다.
그림 1. MACS의 감하 이식의 전반적인 계획은 성인 마우스 망막으로 전구체를 정제. PN 4 Nrl-GFP 새끼에서 기증자 세포는 CD73 기지를 둔 MAC 분류에 선행되고 마우스 호스트 망막의 하수 공간으로 이식됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. MACS에 의해 이식 가능한 광수용체의 농축. 수집된 모든 PN4 망막에서 생성된 세포 현탁액은 1차 쥐 항 CD73 항체로 배양한 다음 마이크로비드와 결합된 항쥐 항체를 통해 세척 및 배양을 한다. 무한항 항체는 씻겨 나아낸다. 셀 서스펜션은 자기 스탠드와 연결된 LS 컬럼을 통과합니다. 항체에 의해 결합되는 세포는 나머지 세포가 용출되고 집합되는 동안 열에 붙어 있습니다 (CD73 음성 분획). 마지막으로 LS-컬럼은 자기 스탠드에서 제거되고 나머지 셀은 용출되고 수집됩니다(CD73 양성 분획). 전체 영화를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. CD73 기반 MAC 정렬 에 따른 Nrl-GFP 양성 세포 농축 분석. (A)선별하기 전에, 기증자 세포의 초기 인구는 Nrl-GFP 양성 세포의 30.4%를 포함하였다. MAC 정렬 후 CD73+ 분획(86.9%)에서 GFP 양성 세포의 농축을 감지할 수 있습니다. CD73-분획은 소량의 GFP+ 셀(9.9%)만 포함했다. (B)PN4 Nrl-GFP 셀의 CD73 기반 MAC 정렬의 결과를 보여주는 대표적인 이미지. 모든 분획에서 1백만 개의 세포가 라미닌 코팅 커버립에 도금되었습니다. 세포는 도금 후 4 시간 동안 10 분 동안 4 % PFA로 고정되었습니다. 세포는 DAPI (4',6-디아미드노-2-페닐린돌, 1:20,000)로 염색되었다. CD73+ 분획에서 GFP 양성 세포의 현저한 농축은 입력 분획 또는 CD73-분획과 비교할 때 관찰되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 부관 주사. 성인 마우스 망막으로 이식 과정의 회로도. 바늘은 오라 세라타의구멍을 통해 삽입되고, 렌즈를 만지지 않도록 하여 비리얼 공간을 탐색하고 시각 제어 하에 망막에 놓습니다. 부드러운 밀기로 바늘은 망막을 뚫고 하수 공간에 놓입니다. 결국, 세포 현탁액은 분리 과정을 평가하여 시각적 제어하에 신중하게 주입된다.
그림 5. 이식된 광수용체 세포의 통합. 통합 CD73 기반 MACS를 묘사한 대표적인 사진은 성인 마우스 망막으로 이식한 후 PN4 Nrl-GFP 세포를 분류하였다. 이식된 광수용체 전구체는 외부 핵층(ONL)에 올바르게 통합되어 성숙한 광수용체 형태를 생성한다.
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Discussion
광수용체 전구체 세포의 침전체 이식은 이러한 빛에 민감한 세포의 통합을 달성하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 나타내며, 이는상당수1,2에서숙주 망막으로 통합된다. 이것은 미래에 망막 퇴행성 질병의 처리를 위한 세포 치료의 설치를 허용할 지도 모릅니다6. 현재 PN 4 망막으로부터 분리된 세포의 기증자 인구는 다른 세포 유형의 혼합물이며, 이 세포는 감전 주사 후 광수용체 전구체 세포만 통합한다. CD73 기반 MAC 선별을 사용하여, 기증자 세포 현탁액 내의 광수용체의 비율은 분류되지 않은 세포 인구에 비해 야생형 숙주 망막에서 약 3배 더 높은 통합률을 허용하는 90%≈ 증가시킬 수있다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 빠른 선별 절차의 장점을 가지며 GMP 표준에 비교적 쉽게 적용할 수 있습니다. 이식 가능한 광수용체의 정제는 만능 줄기 세포로부터 의 체외 생성에 대한 최근의 장점에 비추어 특정 관심사이다12-14. 분화 된 만능 줄기 세포의 배양은 특정 선별 절차의 가용성을 세포 이식 요법에서 미래의 사용을위한 필수 전제 조건인 다양한 세포 유형으로 구성됩니다.
MACS 정화 절차에 따르면 몇 가지 점이 주목할 만하며 주요 방해 없이 워크플로우를 보장합니다. 정렬할 망막의 수가 많을수록 소화에 더 많은 시간이 필요합니다. 소화 후, 선별 절차 동안, 세포의 응집을 피해야한다. 이는 바람직하게는 이차 항체를 첨가하기 전과 그 잠복기 중에 발생한다. 이 경우 피펫으로 즉시 집계를 제거해야 합니다. MACS 음수 분획을 수집하는 동안 MACS 버퍼의 용출 하는 동안, 그것은 절대적으로 열에 3 ml 이상 추가 하지 않는 것이 절대적으로 필요. 3ml 이상의 버퍼가 추가되면 열에 대한 버퍼의 압력이 너무 높아집니다. 이것은 세포에 항체의 결합을 방해하고 정렬 효율성을 낮춥습니다. MACS 양성 분획을 수집하기 위해 자기 스탠드에서 열을 제거할 때 이 단계를 신속하게 수행해야 합니다. MACS 버퍼 5ml를 가능한 한 빨리 열에 추가해야 합니다. 또한 전체 버퍼가 열을 통과할 때까지 플런지를 신속하게 넣고 눌러야 합니다. 적용된 압력에 대해 걱정할 필요가 없습니다. MACS 버퍼는 등소이며 다양할 수 있습니다. FACS 버퍼, 세포 배양 배지, PBS, EBSS 또는 HBSS를 사용할 수 있다. 버퍼의 멸균은 0.4 μm 필터 멤브레인을 통해 필터링하여 달성 될 수있다.
MACS에 의해 농축 후, 부관 공간에 기증자 세포의 성공적인 이식은 마음에 다음 점을 유지하여 달성 될 수있다. 광수용체 세포는 치료 전 생체에 매우 민감한 것처럼 보이기 때문에 필요한 것보다 4 °C 이상 유지하는 것이 바람직하지 않습니다. 가능한 한 빨리 이식을 진행합니다. 안구에 주입 바늘을 삽입할 때, 상대적으로 날카로운 금속 바늘이 렌즈를 손상시킬 수 있으므로 렌즈에 닿지 않는 것이 중요합니다. 망막의 침투인 영하 공간으로 가는 마지막 단계는 매우 중요합니다. 육수 공간에 도달하는지 여부를 시각적으로 관찰할 수 없기 때문에 오른쪽 밀기 압력 및 조직 저항에 대한 느낌을 개발하는 것이 중요하다. 테스트하려면 바늘 머리를 올바르게 배치하면 작은 부피를 적용 할 수 있으며 바늘 머리에 망막의 분리를 주의 깊게 관찰해야합니다. 출혈없이 둥글고, 투성 분리가 형성되면, 위치가 정확하고 용액의 나머지 부분을 신중하게 적용 할 수 있습니다. 주사 하는 동안, 바늘 조직에 추가 손상을 피하기 위해 그것의 위치에 남아 있어야 합니다. 주사 바늘에 의해 생성 된 망막 구멍은 바늘이 천천히 후퇴하는 경우 그 자체로 밀봉됩니다. 전체 절차는 동물의 추가 스트레스와 손상을 피하기 위해 가능한 최소한의 시간에서 수행해야합니다. 이식 하는 동안, 세포 현탁액 덩어리 와 마이크로 리터 주사기를 차단 하는 경향이. 이 경우 멸균 PBS 또는 HBSS를 사용하여 세포 현탁액의 희석이 제안됩니다. 이 문제를 극복하는 또 다른 가능성은 세포 현탁액에 DNAse I의 1 μl을 추가하고 살아있는 세포를 함께 접착하는 경향이있는 죽은 세포에서 DNA 덩어리를 용해시키는 것입니다.
이 프로토콜은 세포의 자기 정렬로 제한됩니다. 따라서 셀은 정렬 라운드당 하나의 마커에 대해서만 정렬될 수 있습니다. 세포가 서로 다른 마커(생리학적 특성뿐만 아니라 다른 세포 표면 마커포함)를 사용하여 정렬될 수 있는 유동 세포측정에 비해, 이것은 이 기술의 주요 단점이다. 짧은 시간 창에서 다른 마커에 대한 정렬이 필요할 때마다 흐름 세포측정이 더 나은 솔루션일 수 있습니다. 또한, 형질적으로 표현된 GFP 또는 다른 생명세포 마커와 같은 세포의 형광 성질을 분류하는 것은 이 기술로는 불가능하다. 그것은 현재 자기 구슬로 컨쥬게이징 될 수있는 세포 표면 항체의 사용에 제한됩니다. 그럼에도 불구하고 이 기술은 사용되는 기술 장비에 따라 확장될 수 있습니다.
밀테니 바이오텍은 현재 자기 세포 선별 도구의 유일한 공급자이기 때문에 현재까지 사용할 수있는 대안이 없습니다. 세포 해리의 경우, 파팡(예: 트립신)보다 다른효소가 사용될 수 있었다. 참고로, 우리 실험실은 우리 손에 가장 부드러운 해리 효소인 것처럼 보이기 때문에 papain로 최상의 결과를 달성했습니다. 파충 소화의 시간 창 (30-60 분)은 변수입니다. 이 시기에 는 실험실에서 최적의 소화를 달성했습니다. 사용 되는 샘플 크기, 샘플 품질 및 효소에 따라 더 짧거나 더 긴 잠복 시간이 필요할 수 있습니다. 개별 테스트가 제안됩니다.
단일 단계 MACS가 유동 세포측정만큼 높은 순도 수준에 도달하지 못한다는 점을 감안할 때,이 기술의 가능한 추가 응용 프로그램은 원치 않는 잠재적 인 유해 세포의 부정적인 정렬 일 수 있습니다. 거기에서, 주어진 셀 표면 마커에 대한 셀 분획 양성하지만 관심의 되지 않는 것은 밖으로 정렬될 수 있고, 이해의 분수는 통해 흐름에서 격리된 관심의 분수를 남겨 둡니다. 이것은 양수 분류 단계 후에 선행또는 후에 행해질 수 있고 그들의 잠재적인 종양발생 리스크를 가진 만능 줄기 세포 배양에서 피더 층 세포 또는 미분화 세포 같이 원치 않는 세포의 제거뿐만 아니라 다른 세포 표면 마커를 사용하여 세포의 추가 차별을 허용합니다. 따라서 MACS는 고량의 배양 된 세포의 정화를 위한 부드럽고 빠르며 간단한 치료를 나타내기 때문에 향후 치료 응용 분야에서 ES 또는 iPS 세포 배양으로부터 광수용체의 정화에 적합할 수 있습니다. MACS는 정렬 단계, 즉 역학, 유체 및 절차가 유동 세포측정에 비해 감소되기 때문에 GMP 조건에 쉽게 적용될 수 있습니다. MACS는 이미 혈액이나 골수에서 세포의 농축을 위한 임상 시험에서 일상적으로 사용된다는 점은 주목할 만합니다. 흥미롭게도, MACS는 적합한 세포 표면 마커가 존재하지 않을 때, 후속 자기 세포 선별단계(15)에대해 세포를 "유능한"으로 만들기 위해 표면 마커를 유전적으로 도입함으로써 세포에도 적용될 수 있다.
요약하자면, MACS는 이식 연구를 위한 세포 표면 마커를 사용하여 광수용체 전구체 세포를 풍부하게 하는 신뢰할 수 있고 빠른 도구를 나타냅니다. 또한 GMP 조건을 필요로 하는 향후 임상 적용을 위한 쉽게 사용할 수 있는 방법입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 Nrl-GFP 마우스를 제공 아난드 스와롭, 기술 지원을위한 요헨 하스, 동물 축산에 대한 신디 뵈메와 에멜리 레스만을 제공 감사드립니다.
이 작품은 도이치 포충스게마인샤프트(DFG): FZT 111 - 재생 치료 드레스덴 센터, CRTD 종자 보조금 프로그램, SFB 655 및 프로레티나 e.V. 재단, DIGS-BB 대학원 프로그램 드레스덴, 그리고 Fundação 파라 시엔시아 e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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