La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.
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Article de méthode
Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) - enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.
Introduction
La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de....
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Protocole
Énoncé sur l’utilisation éthique et les soins des animaux :
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les lois de l’Union européenne et allemandes (Tierschutzgesetz) et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la TU Dresde et de la Landesdirektion Dresden (numéro d’approbation : 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Avant de commencer la dissociation des cellules et le tri des cellules
- Étiqueter trois tubes réactionnaires d....
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Résultats
Afin d’évaluer la capacité des photorécepteurs de tige à s’intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de rapporteur de souris a été utilisée, dans laquelle GFP est entraîné par la fermeture à glissière de leucine de la rétine neurale (Nrl, Nrl-GFP) promoteur11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs de tige commençant son expression à E12.5 tout au long de l’âge adulte, permettant un étiquetage spécifique des cellules photoréceptrices de tige de donneur.
Pn 4 Nrl-GFP ch.......
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Discussion
La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à partir de laquelle seules les cell.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système de dissociation de la papaïne | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | fourni DNase I n’est pas utilisé dans la méthode |
| Rat purifié Anti-souris CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Concentration stock 0,5 mg/ml |
| Chèvre Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Volume total de 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Utilisé pour compter le nombre total de cellules |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Utilisé pour la dissociation des rétines |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Utilisé pour compter le nombre total de cellules |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Kétamine 10 % | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phényléphrine 2,5 %-Tropicide 0,5 | Cliniques universitaires Dresde Pharmacie | ||
| Filtres de préséparation | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Colonnes | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Séparateur QuadroMACS | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Pipette Pasteur en verre poli au feu | Marque | 74777 20 | La pipette' Les pointes doivent être polies au feu et autoclavées. |
| MACS Porte-tubes 15 ml | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Chambre de comptage cellulaire | Carl Roth | T728.1 | |
| Tubes stériles de 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | peut être utilisé à la place de l’Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | peut | être utilisé à la place du Leica M651 MSD | |
| Stéréomicroscope inversé Olympus CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Hotte de culture cellulaire Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1,5 ml Tube à réaction | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Tube à réaction | Sarstedt | 72695 | |
| Centrifugeuse Eppendorf 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Support de tête de souris | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microlitre seringue 5 µ ; l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | livré sans aiguilles |
| Hamilton RN aiguille spéciale 34 G | Hamilton | 065-207434 | émoussée, longueur 12 mm |
| Vannas-Tü ; bingen Ciseaux à ressort - Lames de 5 mm Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Pince Dumont #7 - Titane Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
Références
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al.
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Réimpressions et autorisations
