Summary
La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.
Abstract
La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) - enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.
Introduction
La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tiges dans des rétines adultes de souris de type sauvage1,2. Ainsi, surgissant la possibilité de transplantation de cellules de précurseur de photorécepteur également dans une rétine dégénérée, pour remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment, que de telles cellules précurseurs photoréceptrices transplantées suscitent des critères morphologiques de photorécepteurs matures de type sauvage, tels que des segments externes correctement développés3, desbornes synaptiques à proximité immédiate de cellules bipolaires endogènes et d’un corps cellulaire rond situé dans la couche nucléaire externe2-4,ainsi que la capacité à s’intégrer fonctionnellement dans les circuits neuronaux de l’hôte5-7. L’un des grands principes de cette stratégie est l’utilisation des rétines de jeunes souris du jour postnatal 4 (PN 4, PN0 est défini comme le jour de la naissance), ce qui entraîne un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d’une future application thérapeutique, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs de photorécepteurs. CD73 a été décrit comme le premier marqueur de surface cellulaire spécifique pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine8-10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteurs basée sur ce marqueur de surface cellulaire et avec l’utilisation de la technique de tri cellulaire magnétique associé (MACS). Macs pourrait avoir des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire fluorescent-activé, en raison des temps de tri rapides et de l’ajustement plus facile aux conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement d’environ 90% et un taux d’intégration jusqu’à 3 fois plus élevé lors de la transplantation de la population enrichie dans l’espace sous-rétinien chez les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l’enrichissement de cellules précurseurs de photorécepteurs à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne sont des techniques fiables et prometteuses pour le développement d’une stratégie thérapeutique régénératrice pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.
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Protocol
Énoncé sur l’utilisation éthique et les soins des animaux :
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les lois de l’Union européenne et allemandes (Tierschutzgesetz) et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la TU Dresde et de la Landesdirektion Dresden (numéro d’approbation : 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Avant de commencer la dissociation des cellules et le tri des cellules
- Étiqueter trois tubes réactionnaires de 15 ml avec : Wash (W), Fraction positive (+) et Fraction négative (-).
2. Dissociation de la rétine
- Décapitez les chiots PN 4 à l’aide d’un ciseau.
- Rincer la tête des petits peu de temps après avec de l’éthanol à 70 % et les laver dans du PBS.
- Transférer la tête à HBSS froid et énucléer l’œil (répétez cette étape pour toutes les têtes). Pour énucléer, ouvrez les paupières et fixez l’œil avec une pince incurvée au niveau de la région du nerf optique. Ensuite, tirez l’œil soigneusement hors de l’orbite.
- Après avoir énucléé tous les yeux, isolez la rétine: introduisez un ciseau fermé dans le nerf optique et ouvrez les lames. Peal le RPE / chorid out. Retirez les lentilles et les vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince incurvée.
- Transférer les rétines isolées dans un tube réactionnel de 1,5 ml contenant la solution de papaïne (fournie par le kit de dissociation de la papaïne).
- Incuber les rétines dans la solution de papaïne pendant 30-60 min dans un bain-marie ou un shaker (400 rpm) à 37 °C.
- Pendant que les rétines couvent dans la solution de papaïne, pipetter 1 ml de solution d’ovomucoïde dans un tube réactionnel de 15 ml (étiquette « 1 »).
- Ajouter 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solution d’ovomucoïde (fournie par le kit) + 520 μl d’EBSS dans un tube de réaction de 15 ml (étiquette « 2 »).
- Après incubation de la papaïne, transférer la solution de papaïne contenant les rétines partiellement digérées dans le tube réactionnel « 2 ».
- À l’aide d’une pipette polie au feu, effectuez une dissociation mécanique (10x de haut en bas).
- Pipetter la suspension à cellule unique au tube de réaction « 1 ». Essayez de générer 2 couches en superposant doucement la suspension cellulaire sur la solution ovomucoïde.
- Centrifuger pendant 5 min à 300 x g (environ 1 300 tr/min).
- Jetez le surnageant et ressuscitez les cellules dans 500 μl de tampon MACS.
3. Tri des cellules à l’aide du tri des cellules associées magnétiques (MACS)
- Ajouter x μl d’anticorps anti-CD73 pour le rat aux 500 μl afin d’atteindre une concentration finale de 10 μg/ml.
- Incuber 5 min sur la glace.
- Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 10 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à une vitesse de 300 x g.
- Retirez le surnageant.
- Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 480 μl et ajouter 120 μl de microbilles d’IgG anti-rat de chèvre.
- Incuber 15 min sur la glace; ne pas agiter, secouer ou mélanger.
- Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 5 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à 300 x g.
- Lorsque le tube de réaction est centrifugé:
- Ajustez une colonne LS dans le support magnétique.
- Placez le filtre de préséparation au-dessus de la colonne LS.
- Hydrater le filtre de préséparation et la colonne LS avec un tampon MACS de 3 ml et recueillir le tampon MACS dans le tube de lavage (W).
- Retirez le surnageant.
- Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 500 μl.
- Chargez la suspension cellulaire de 500 μl dans le filtre, puis ajoutez 1 ml de tampon MACS au filtre et collectez la fraction négative dans le tube de réaction de fraction négative (-).
- Ensuite, ajoutez 3 x 3 ml de tampon MACS à la colonne pour laver les cellules qui ne sont pas liées à la colonne
- Une fois que ces 9 ml sont à travers la colonne LS, retirez la colonne du support magnétique et installez-la sur le dessus du tube de réaction de fraction positive (+).
- Chargez rapidement 5 ml de tampon MACS dans la colonne LS et placez le piston dans la colonne LS et appuyez dessus jusqu’à ce que la mémoire tampon entière soit à travers la colonne.
- Centrifuger le tube réactionnel contenant la fraction positive pendant 5 min à 300 x g.
- Retirer le surnageant, le ressusciter dans 500 μl de tampon MACS et le maintenir à 4 °C.
- Comptez la quantité totale de cellules à l’aide d’un dispositif de comptage de cellules commun.
- Préparer une suspension cellulaire à partir de la fraction triée positive contenant 2 x 105 cellules/μl dans un tampon MACS et la maintenir à 4 °C
4. Transplantation de cellules précurseurs de photorécepteurs triées par MAC dans la rétine de la souris
- Assurez-vous d’avoir toutes les solutions suivantes prêtes : 1 ml de PBS ou d’HBSS stérile, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml stérile désioniséH2O,aliquotes des fractions de suspension cellulaire à 4 °C.
- Anesthésier la souris adulte(c.-à-d. âgée de 2 à 4 mois) avec une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médetomidine (0,01 mg/10 g de poids corporel), de kétamine (0,75 mg/10 g de poids corporel). Ensuite, faites une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) pour soulager la douleur.
- Dilater les pupilles avec une goutte de phényléphrine 2,5%-Tropicamide 0,5%.
- Fixez la souris dans le support de tête de souris et placez-la au microscope stéréoscopique.
- Appliquez une goutte de gel visidique pour éviter le dessèchement de l’œil.
- Faire un petit trou à la frontière entre la sclérotique et la cornée (respectivement ora serrata)à l’aide d’une aiguille stérile de 30 G 1/2.
- Coupez une glissière de couverture commune en petits morceaux (environ 5 mm x 5 mm) à l’aide d’un stylo diamant, placez l’une de ces pièces sur le dessus de la cornée, permettant une visualisation directe de la rétine.
- Rincer la seringue microlitres préstérisée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.
- Chargez la seringue microlitre avec 1 μl de suspension cellulaire, dirigez l’aiguille tangentiellement à travers la conjonctive et la sclérotique et placez-la sous contrôle visuel dans la moitié nasale de la rétine.
- Percer doucement un trou dans la rétine jusqu’à atteindre l’espace sous-rétinien, injecter la suspension cellulaire dans l’espace sous-rétinien.
- Observez le décollement bulleux de la rétine, qui doit être uniforme, couvrant environ 1/4 de l’espace rétinien sans aucun saignement.
- Retirez doucement la seringue, le trou rétinien scelle automatiquement.
- Rincer la seringue microlitre plusieurs fois avec de l’eau désionisée.
- Relâchez la souris du porte-tête.
- Réveillez la souris en injectant du chlorhydrate d’atipamozole pour inverser l’effet chlorhydrate de médétomidine.
- Placez la souris pour le temps de réveil dans une chambre sombre et chaude (environ 25 °C).
- Les 2 prochains jours après la transplantation, la buprénorphine (0,05 mg/kg de poids corporel) doit être administrée par injection sous-cutanée le matin et l’après-midi pour soulager la douleur.
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Representative Results
Afin d’évaluer la capacité des photorécepteurs de tige à s’intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de rapporteur de souris a été utilisée, dans laquelle GFP est entraîné par la fermeture à glissière de leucine de la rétine neurale (Nrl, Nrl-GFP) promoteur11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs de tige commençant son expression à E12.5 tout au long de l’âge adulte, permettant un étiquetage spécifique des cellules photoréceptrices de tige de donneur.
Pn 4 Nrl-GFP chiots ont été décapités et des yeux ont été enucleated. Les rétines ont ensuite été isolées et dissociées selon la méthode décrite ci-dessus. La suspension cellulaire résultante a ensuite été triée à l’aide de MACS à base de CD73(figures 1 et 2). Après le tri MAC, nous avons analysé l’enrichissement réalisé au cours de cette procédure.
Comme le montre la figure 3A,la suspension initiale des cellules (input) contenait 30,4% de cellules GFP-positives, c’est-à-dire. photorécepteurs de tige. Après MAC-tri basé sur CD73, on a observé un enrichissement de jusqu’à 86,9% dans la fraction de CD73-positive (CD73+) par cytometry d’écoulement. Dans la fraction CD73-négative (CD73-) seulement 9,9% de toutes les cellules ont été positivement détectées pour GFP (Figure 3A). L’enrichissement des cellules positives Nrl-GFP suivant macs à base de CD73 est en outre visualisé après placage in vitro (Figure 3B).
Après le tri MAC, les cellules donneuses de la fraction CD73 positive ont été filées vers le bas et remises en suspension à une concentration finale de 200 000 cellules/μl. Cette suspension cellulaire a ensuite été utilisée pour la transplantation dans l’espace sous-rétinien des rétines hôtes de type sauvage (Figure 4). Trois à quatre semaines suivant la transplantation, les rétines de centre serveur ont été fixées, isolées et sectionnés. Plusieurs cellules donneuses se sont intégrées dans la couche nucléaire externe des hôtes et ont acquis la morphologie de photorécepteurs matures avec localisation du corps cellulaire dans la couche nucléaire externe et formation de phéroules synaptiques et de segments internes(figure 5). Des photos détaillées ont été publiées auparavant par notre groupe3,8 montrant un résultat comparable aux cellules triées par FAC transplantées pour héberger des rétines par d’autres groupes4,6,10. Cohérent dans toutes ces études est, que les cellules transplantées restent au site d’injection, défini par la rétine hôte détachée bulleuse, et ne migrent pas loin. Certains s’intègrent dans la rétine hôte(c’est-à-dire la couche nucléaire externe), et d’autres restent dans l’espace sous-rétinien3. En outre, il a été démontré, que la distribution des cellules donneuses sur le site d’intégration dépend du type de modèle murin utilisé5. Aucun signe aigu de rejet de l’hôte/greffe n’a été détecté dans les transplantations entre les souris C57BL/6J.
Figure 1. Schéma global de transplantation sous-rétinienne de MACS purifié précurseurs de photorécepteur dans la rétine adulte de souris. Les cellules donneuses des petits PN 4 Nrl-GFP sont isolées, suivies d’un tri MAC à base de CD73 et transplantées dans l’espace sous-rétinien des rétines hôtes de souris. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.
Figure 2. Enrichissement des photorécepteurs transplantables par macs. La suspension cellulaire générée à partir de toutes les rétines PN4 collectées est incubée avec des anticorps anti-CD73 primaires de rat suivis d’un lavage et d’une incubation avec des anticorps anti-rats conjugués à des microbilles. Les anticorps non liés sont emportés. La suspension cellulaire est passée à travers une colonne LS qui est reliée à un support magnétique. Les cellules qui sont liées par des anticorps restent attachées à la colonne pendant que les cellules restantes sont éluées et collectées (fraction CD73-négative). Enfin, la colonne LS est retirée du support magnétique et les cellules restantes sont éluées et collectées (fraction CD73-positive). Cliquez ici pour voir le film complet.
Figure 3. Analyse de l’enrichissement positif de cellules de Nrl-GFP suivant le MAC-tri basé sur CD73. (A) Avant le tri, la population initiale des cellules de distributeur a contenu 30.4% de cellules positives de Nrl-GFP. Après le MAC-tri, un enrichissement des cellules GFP-positives a pu être détecté dans la fraction CD73+ (86,9%) tandis que la fraction de CD73- ne contenait que de faibles quantités de cellules GFP+ (9,9%). (B) Image représentative démontrant le résultat du tri MAC basé sur CD73 des cellules PN4 Nrl-GFP. 1 million de cellules de chaque fraction ont été plaquées sur des lamaux recouverts de laminine. Des cellules ont été fixées 4 heures après placage avec 4% PFA pendant la minute 10. Des cellules ont été souillées avec DAPI (4', 6 diamidino-2-phenylindole, 1:20.000). On a observé un enrichissement significatif des cellules GFP-positives dans la fraction de CD73+ une fois comparé à la fraction d’entrée ou à la fraction de CD73-. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.
Figure 4. Injection sous-rétinienne. Dessin schématique du processus de transplantation dans la rétine de souris adulte. L’aiguille est insérée à travers un trou dans l’ora serrata, navigué à travers l’espace vitréal en évitant de toucher le cristallin et placé à la rétine sous contrôle visuel. En poussant doucement, l’aiguille est perforée à travers la rétine et placée dans l’espace sous-rétinien. Finalement, la suspension cellulaire est injectée soigneusement sous contrôle visuel en évaluant le processus de détachement.
Figure 5. Intégration de cellules photoréceptrices transplantées. Image représentative représentant des MACS intégrés à base de CD73 triés des cellules PN4 Nrl-GFP après la transplantation dans la rétine adulte de souris. Les précurseurs de photorécepteurs transplantés s’intègrent correctement dans la couche nucléaire externe (ONL) et génèrent une morphologie de photorécepteur mature.
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Discussion
La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à partir de laquelle seules les cellules précurseurs du photorécepteur s’intègrent après injection sous-rétinienne. En utilisant le tri MAC à base de CD73, la proportion de photorécepteurs dans la suspension de cellules donneuses peut être augmentée à ≈ 90%, ce qui permet un taux d’intégration environ 3 fois plus élevé dans les rétines hôtes de type sauvage par rapport à la population cellulaire non triée8. Par rapport à la cytométrie de flux, MACS a l’avantage d’une procédure de tri rapide et qu’il peut être relativement facile à appliquer aux normes GMP. La purification des photorécepteurs transplantables présente un intérêt particulier à la lumière des avantages récents pour la génération in vitro de photorécepteurs à partir de cellules souches pluripotentes12-14. Les cultures de cellules souches pluripotentes différenciées sont composées de divers types de cellules, ce qui fait de la disponibilité de procédures de tri spécifiques une condition préalable essentielle à leur utilisation future dans les thérapies de transplantation cellulaire.
Selon la procédure de purification MACS, plusieurs points sont à noter, assurant un flux de travail sans perturbations majeures. Plus le nombre de rétines à trier est élevé, plus il faut de temps pour les digérer. Après la digestion, pendant la procédure de tri, l’agrégation des cellules doit être évitée. Cela se produit de préférence avant l’addition de l’anticorps secondaire et lors de son incubation. Dans ce cas, l’agrégat doit être retiré immédiatement avec une pipette. Lors de l’élution du tampon MACS lors de la collecte de la fraction négative MACS, il est absolument nécessaire de ne pas ajouter plus de 3 ml à la colonne. La pression du tampon sur la colonne sera trop élevée si plus de tampon que 3 ml est ajouté. Cela perturbera la liaison de l’anticorps aux cellules et diminuera l’efficacité du tri. Lorsque vous retirez la colonne du support magnétique pour commencer à collecter la fraction positive MACS, cette étape doit être effectuée rapidement. Les 5 ml de mémoire tampon MACS doivent être ajoutés à la colonne aussi rapidement que possible. En outre, le plongeon doit être placé et pressé rapidement jusqu’à ce que la mémoire tampon entière soit à travers la colonne. Il n’est pas nécessaire de s’inquiéter de la pression appliquée. La mémoire tampon MACS est isotonique et peut être modifiée. Il est possible d’utiliser le tampon FACS, le milieu de culture cellulaire, le PBS, l’EBSS ou le HBSS. La stérilité du tampon peut être obtenue en filtrant à travers une membrane filtrante de 0,4 μm.
Après enrichissement par MACS, une transplantation réussie des cellules de distributeur à l’espace sous-rétinien peut être réalisée en gardant les points suivants à l’esprit. Les cellules photoréceptrices semblant très sensibles au traitement ex vivo, il n’est pas conseillé de les maintenir à 4°C plus longtemps que nécessaire. Procéder à la transplantation aussi vite que possible. Lors de l’insertion de l’aiguille d’injection dans le globe oculaire, il est important d’éviter de toucher le cristallin, car l’aiguille métallique relativement pointue pourrait endommager le cristallin, ce qui entraînerait l’induction d’uvéite induite par l’objectif. La dernière étape sur le chemin de l’espace sous-rétinien, la pénétration de la rétine, est cruciale. Puisqu’il ne peut pas observer visuellement si l’espace sous-rétinien est atteint, il est important de développer un sentiment pour la pression de poussée droite et la résistance des tissus. Pour tester, si la tête de l’aiguille est placée correctement, un petit volume pourrait être appliqué et le détachement de la rétine à la tête de l’aiguille doit être soigneusement observé. Si un détachement rond et bulleux sans saignement se forme, la position est correcte et le reste de la solution peut être appliqué avec soin. Pendant l’injection, l’aiguille doit rester dans sa position pour éviter d’autres dommages au tissu. Le trou rétinien créé par l’aiguille d’injection se referme par lui-même si l’aiguille est rétractée lentement. L’ensemble de la procédure doit être effectuée dans le minimum de temps possible pour éviter tout stress et dommage supplémentaire à l’animal. Pendant la transplantation, la suspension cellulaire a tendance à amaser et à bloquer la seringue microlitre. Si cela se produit, une dilution de la suspension cellulaire à l’aide de PBS stérile ou HBSS est suggérée. Une autre possibilité de surmonter ce problème est d’ajouter 1 μl de DNAse I à la suspension cellulaire, pour dissoudre les amas d’ADN des cellules mortes, qui ont tendance à coller les cellules vivantes ensemble.
Ce protocole est limité au tri magnétique des cellules. Par conséquent, les cellules peuvent être triées pour un seul marqueur par tour de tri. Par rapport à la cytométrie en flux, où les cellules pourraient être triées à l’aide de différents marqueurs (y compris les propriétés physiologiques ainsi que différents marqueurs de surface cellulaire) en même temps, c’est un inconvénient majeur de cette technique. Chaque fois que le tri pour différents marqueurs dans une fenêtre de temps courte est nécessaire, la cytométrie de flux pourrait être la meilleure solution. En outre, le tri des propriétés fluorescentes des cellules, comme la GFP exprimée transgéniquement ou d’autres marqueurs de cellules de vie n’est pas possible avec cette technique. Il est actuellement limité à l’utilisation d’anticorps de surface cellulaire qui peuvent être conjugués avec des billes magnétiques. Néanmoins, cette technique pourrait être mise à l’échelle en fonction de l’équipement technique utilisé.
Étant donné que Miltenyi Biotec est actuellement le seul fournisseur d’outils de tri de cellules magnétiques, il n’y a pas d’alternative disponible à ce jour. Pour la dissociation cellulaire, d’autres enzymes que la papaïne(c’est-à-dire la trypsine) pourraient être utilisées. Il convient de noter que notre laboratoire a obtenu les meilleurs résultats avec la papaïne, car cela semble être l’enzyme de dissociation la plus douce entre nos mains. La fenêtre de temps de la digestion des papaïnes (30-60 min) est variable. Dans cette fenêtre de temps, une digestion optimale a été réalisée dans notre laboratoire. Un temps d’incubation plus court ou plus long peut être nécessaire selon la taille de l’échantillon, la qualité de l’échantillon et l’enzyme utilisée. Des tests individuels sont suggérés.
Étant donné que le MACS en une seule étape n’atteint pas des niveaux de pureté aussi élevés que la cytométrie en flux, une application supplémentaire possible de cette technique pourrait être le tri négatif des cellules nocives indésirables et potentielles. Là, la fraction de cellule positive pour un marqueur de surface de cellule donné mais non d’intérêt peut être triée, laissant la fraction d’intérêt isolée dans le flux traversant. Cela pourrait être fait à l’avance ou après une étape de tri positive et permet la discrimination supplémentaire des cellules à l’aide de différents marqueurs de surface cellulaire ainsi que l’élimination des cellules indésirables, comme les cellules de la couche nourricière ou les cellules indifférenciées des cultures de cellules souches pluripotentes avec leur risque tumorogène potentiel. Par conséquent, macs pourrait convenir pour la purification des photorécepteurs des cultures cellulaires ES ou iPS dans des applications thérapeutiques futures possibles car il représente un traitement doux, rapide et simple pour la purification de grandes quantités de cellules cultivées. Les MACS pourraient être facilement appliqués aux conditions GMP puisque les détails des étapes de tri, c’est-à-dire la mécanique, les fluides et les procédures, sont réduits par rapport à la cytométrie de flux. Il est à noter, que MACS est déjà couramment utilisé dans les essais cliniques pour l’enrichissement des cellules du sang ou de la moelle osseuse. Fait intéressant, MACS peut même être appliqué sur les cellules lorsqu’aucun marqueur de surface cellulaire approprié n’est présent, en introduisant génétiquement un marqueur de surface pour rendre les cellules « compétentes » pour les étapes ultérieures de tri des cellules magnétiques15.
En résumé, macs représente un outil fiable et rapide pour enrichir les cellules précurseurs de photorécepteur utilisant des marqueurs de surface cellulaire pour des études de transplantation. De plus, il s’agit d’une méthode facilement employable pour les futures applications cliniques qui nécessitent des conditions de BPF.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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