Summary
सेल प्रत्यारोपण फोटोरिसेप्टर हानि की विशेषता रेटिना अध: पतन के उपचार के लिए एक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। यहां हम प्रत्यारोपण योग्य फोटोरिसेप्टर्स के संवर्धन और वयस्क चूहों में उनके सबरेटिनल ग्राफ्टिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
रेटिना की प्रकाश-संवेदन कोशिकाओं के नुकसान के कारण दृष्टि हानि और अंधापन, यानी फोटोरिसेप्टर्स, औद्योगिक देशों में विकलांगता के मुख्य कारण का प्रतिनिधित्व करता है। सेल प्रत्यारोपण द्वारा विकृत फोटोरिसेप्टर का प्रतिस्थापन भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों में एक संभावित उपचार विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। दरअसल, हाल ही में प्रीक्लीनिकल अध्ययनों से पता चला है कि प्रसवोत्तर दिन 4 में नवजात माउस रेटिना से अलग अपरिपक्व फोटोरिसेप्टर्स, सबरेटिनल प्रत्यारोपण के बाद वयस्क माउस रेटिना में एकीकृत करने की क्षमता है । दाता कोशिकाओं ने आंतरिक और बाहरी खंडों, बाहरी परमाणु परत पर स्थित एक गोल सेल शरीर, और एंडोजेनस बाइपोलर कोशिकाओं के करीब निकटता में सिनैप्टिक टर्मिनलों सहित एक परिपक्व फोटोरिसेप्टर आकृति विज्ञान उत्पन्न किया। दरअसल, हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि दाता फोटोरिसेप्टर कार्यात्मक रूप से मेजबान चूहों के तंत्रिका सर्किटरी में एकीकृत होते हैं। इस तरह के सेल प्रतिस्थापन दृष्टिकोण के भविष्य के नैदानिक आवेदन के लिए, पसंद की कोशिकाओं के शुद्ध निलंबन उत्पन्न किया जाना है और आंख में उचित एकीकरण के लिए सही स्थिति में रखा जाना है। फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों के संवर्धन के लिए, दाता कोशिकाओं के आनुवंशिक रिपोर्टर संशोधन से बचने के लिए छंटाई विशिष्ट कोशिका सतह एंटीजन पर आधारित होनी चाहिए। यहां हम चुंबकीय-संबद्ध सेल छंटाई (एमएएक्स) दिखाते हैं - कोशिका सतह मार्कर सीडी 73 के आधार पर फोटोरिसेप्टर-विशिष्ट रिपोर्टर चूहों के नवजात रेटिना से अलग प्रत्यारोपण योग्य रॉड फोटोरिसेप्टर अग्रदूत का संवर्धन। एंटी-सीडी 73 एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन माइक्रो-मनका संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद एमएक्स द्वारा रॉड फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों के संवर्धन को लगभग 90% तक की अनुमति दी गई। प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में, एमएएक्स को यह लाभ है कि इसे जीएमपी मानकों पर लागू करना आसान हो सकता है और उच्च मात्रा में कोशिकाओं को सापेक्ष कम समय अवधि में हल किया जा सकता है। वयस्क जंगली प्रकार के चूहों के सबरेटिनल अंतरिक्ष में समृद्ध सेल निलंबन के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप अनसॉर्टेड सेल निलंबन की तुलना में 3 गुना उच्च एकीकरण दर हुई।
Introduction
दृष्टि मनुष्यों की प्रमुख इंद्रियों में से एक है। इस भावना और अंधापन की हानि औद्योगिक देशों में विकलांगता के लिए मुख्य कारणों में से एक हैं । दृष्टि हानि या अंधापन का प्रमुख कारण रेटिना अध: पतन है, जो फोटोरिसेप्टर सेल हानि की विशेषता है, क्योंकि इसे मैकुलर डिजनरेशन, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, शंकु-रॉड डिस्ट्रॉफी और अन्य स्थितियों में देखा जा सकता है। आज तक, खोई हुई दृष्टि को बहाल करने के लिए एक प्रभावी चिकित्सा उपलब्ध नहीं है। 2006 और 2008 में दो अलग-अलग प्रयोगशालाओं ने बताया, एक दूसरे से स्वतंत्र, वयस्क जंगली प्रकार के चूहों रेटिनास1,2में रॉड फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं का एक सफल प्रत्यारोपण। इस प्रकार, विकृत फोटोरिसेप्टर को बदलने और दृष्टि बहाल करने के लिए, एक विकृत रेटिना में फोटोरिसेप्टर प्रीकरनेटर सेल प्रत्यारोपण की संभावना उत्पन्न हो रही है। दरअसल, यह हाल ही में प्रदर्शन किया गया है, कि इस तरह के प्रत्यारोपित फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं परिपक्व जंगली प्रकार फोटोरिसेप्टर्स के रूपात्मक मानदंडों, जैसे ठीक से विकसित बाहरीखंडों 3,एंडोजेनस द्विध्रुवी कोशिकाओं के करीब निकटता में सिनैप्टिक टर्मिनलों और बाहरी परमाणु परत2-4में स्थित एक गोल सेल शरीर, साथ ही मेजबान तंत्रिका सर्किटरी5-7में कार्यात्मक रूप से एकीकृत करने की क्षमता प्रकाश में लाना । इस रणनीति के मुख्य सिद्धांतों में से एक प्रसव के बाद के दिन का उपयोग है 4 (पीएन 4, पीएन0 को जन्म दिन के रूप में परिभाषित किया गया है) युवा चूहों रेटिना, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्यारोपण के लिए विभिन्न सेल प्रकारों का मिश्रण होता है। भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोग की पृष्ठभूमि पर, इस मिश्रण को फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए। CD73 रेटिना8-10में युवा फोटोरिसेप्टर्स के लिए विशिष्ट पहले सेल सतह मार्कर के रूप में वर्णित किया गया है । यहां, हम इस सेल सतह मार्कर के आधार पर और चुंबकीय से जुड़े सेल छंटाई (एमएसी) तकनीक के उपयोग के साथ एक फोटोरिसेप्टर सेल शुद्धिकरण विधि प्रदर्शित करते हैं। तेजी से छंटाई के समय और जीएमपी स्थितियों के लिए आसान समायोजन के कारण, एमएसी को फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटाई तकनीकों की तुलना में फायदे हो सकते हैं। हम वयस्क जंगली प्रकार रेटिना में सबरेटिनल अंतरिक्ष में समृद्ध आबादी को प्रत्यारोपित करते समय ~ 90% संवर्धन और 3 गुना उच्च एकीकरण दर प्रदर्शित कर सकते हैं। इस प्रकार, एमएसी-आधारित फोटोरिसेप्टर अग्रदूत सेल संवर्धन और सबरेटिनल प्रत्यारोपण, रेटिना अध: पतन के उपचार के लिए पुनर्योजी चिकित्सीय रणनीति के विकास के लिए विश्वसनीय और आशाजनक तकनीकें हैं।
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Protocol
नैतिक उपयोग और जानवरों के बयान की देखभाल:
सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय संघ और जर्मन कानूनों (Tierschutzgesetz) के साथ सख्त अनुसार किया गया और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान का पालन किया । सभी पशु प्रयोगों को टीयू ड्रेसडेन की पशु आचार समिति और लैंडेसडिरेसी ड्रेसडेन (अनुमोदन संख्या: 24D-9168.11-1/2008-33) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. सेल वियोजन और सेल छंटाई शुरू करने से पहले
- लेबल तीन 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों के साथ: धो (डब्ल्यू), सकारात्मक अंश (+) और नकारात्मक अंश (-) ।
2. रेटिना वियोजन
- कैंची का उपयोग कर पीएन 4 पिल्ले को काटना।
- पिल्ले के सिर को शीघ्र ही 70% इथेनॉल में कुल्ला करें और इसके बाद पीबीएस में धोने के बाद।
- सिर को ठंडे एचबीएसएस में स्थानांतरित करें और आंख को न्यूलेट करें (सभी सिरों के लिए इस कदम को दोहराएं)। परमाणु रखने के लिए, पलकों को खोलें और ऑप्टिक तंत्रिका क्षेत्र में घुमावदार संदंश के साथ आंख को स्थिर करें। फिर आंख को ध्यान से कक्षा से बाहर खींचें।
- सभी आंखों को न्यूक्लियर करने के बाद, रेटिना को अलग करें: ऑप्टिक तंत्रिका में एक बंद कैंची पेश करें और ब्लेड खोलें। पीपल आरपीई/कोयड आउट । घुमावदार संदंश का उपयोग करके लेंस और रक्त वाहिकाओं को हटा दें।
- पृथक रेटिना को 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पापीन समाधान (पैपिन डिससोओशन किट द्वारा प्रदान किया गया)।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर वाटर बाथ या शेकर (400 आरपीएम) में 30-60 मिनट के लिए पपिन घोल में रेटिना को इनक्यूबेट करें।
- जबकि रेटिना पापिन समाधान में इनक्यूबेट करते हैं, 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब (लेबल "1") के लिए 1 मिलीलीटर ओवोमुकोइड समाधान करते हैं।
- DNase I (10 मिलीग्राम/मिलीलीटर) + 60 माइक्रोन ओवोमुइड समाधान (किट द्वारा प्रदान) + 520 ईबीएसएस के 15 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब (लेबल "2") में जोड़ें।
- पैपिन इनक्यूबेशन के बाद, आंशिक रूप से पचाए गए रेटिना वाले पैपिन समाधान को प्रतिक्रिया ट्यूब "2" में स्थानांतरित करें।
- एक आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करना, यांत्रिक वियोजन (10x ऊपर और नीचे) प्रदर्शन करते हैं।
- प्रतिक्रिया ट्यूब "1" के लिए एकल सेल निलंबन को पिपेट करें। ओवोमुकाइड समाधान के शीर्ष पर सेल निलंबन को धीरे-धीरे लेयर करके 2 परतें उत्पन्न करने का प्रयास करें।
- 300 x ग्राम (लगभग 1,300 आरपीएम) पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को 500 माइक्रोन में एमएसी बफर को फिर से रीसस्ट करें।
3. चुंबकीय एसोसिएटेड सेल छंटाई (एमएएसएस) का उपयोग कर सेल छंटाई
- 10 μg/ml की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 500 माइक्रोन में एक्स माइक्रोन चूहा एंटी-सीडी 73 एंटीबॉडी जोड़ें।
- बर्फ पर 5 मिनट इनक्यूबेट।
- 15 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब को 10 मिलीलीटर को मैक्स बफर के साथ भरें और इसे 300 x ग्राम की गति से 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
- सुपरनिट निकालें।
- 480 माइक्रोन मैक बफर में गोली को फिर से रीसल करें और बकरी विरोधी चूहा आईजीजी माइक्रोमोतियों के 120 माइक्रोन जोड़ें।
- बर्फ पर 15 मिनट इनक्यूबेट; आंदोलन न करें, हिलाएं या मिलाएं।
- 15 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब को 5 मिलीलीटर को एमएएक्स बफर के साथ भरें और इसे 300 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
- जैसा कि प्रतिक्रिया ट्यूब को अपकेंद्री किया गया है:
- एक एलएस कॉलम को चुंबकीय स्टैंड में समायोजित करें।
- एलएस कॉलम के शीर्ष पर प्रीसेपरेशन फिल्टर रखें।
- प्रीसेपरेशन फिल्टर और एलएस कॉलम को 3 एमएल एमएसीएस बफर के साथ हाइड्रेट करें और वॉश (डब्ल्यू) ट्यूब में एमएसीएस बफर इकट्ठा करें।
- सुपरनिट निकालें।
- 500 माइक्रोन मैक बफर में गोली को फिर से रीसल्पेंड करें।
- फिल्टर करने के लिए 500 μl सेल निलंबन लोड, तो फिल्टर करने के लिए 1 मिलीलीटर MACS बफर जोड़ें और नकारात्मक अंश (-) प्रतिक्रिया ट्यूब में नकारात्मक अंश इकट्ठा।
- इसके बाद, कॉलम से बंधे कोशिकाओं को धोने के लिए कॉलम में 3 x 3 मिलीलीटर एमएएक्स बफर जोड़ें
- एक बार जब ये 9 मिलीलीटर एलएस कॉलम के माध्यम से होते हैं, तो कॉलम को चुंबकीय स्टैंड से हटा दें और इसे सकारात्मक अंश (+) प्रतिक्रिया ट्यूब के शीर्ष पर स्थापित करें।
- एलएस कॉलम में 5 मिलीलीटर एमएएक्स बफर को जल्दी से लोड करें और प्लंजर को एलएस कॉलम में रखें और इसे तब तक दबाएं जब तक कि पूरा बफर कॉलम के माध्यम से न हो जाए।
- 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सकारात्मक अंश युक्त प्रतिक्रिया ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
- सुपरनिटेंट निकालें, 500 माइक्रोन में रीसस्टल ऑफ एमएक बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एक सामान्य सेल गिनती डिवाइस का उपयोग कर कोशिकाओं की कुल राशि की गणना करें।
- एमएसी बफर में 2 x 105 कोशिकाओं/माइक्रोन युक्त सकारात्मक सॉर्ट किए गए अंश से सेल सस्पेंशन तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
4. माउस रेटिना में मैक-सॉर्टेप्टर प्रीकरसोर कोशिकाओं का प्रत्यारोपण
- निम्नलिखित समाधानों के सभी तैयार होना सुनिश्चित करें: 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस या एचबीएसएस, 10 माइक्रोन डीएनसी आई, 1-2 मिलीलीटर बाँझ deionized H2O, सेल निलंबन अंशों के aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- एमेडेओमिडीन हाइड्रोक्लोराइड (0.01 मिलीग्राम/10 ग्राम शरीर के वजन), केटामाइन (0.75 मिलीग्राम/10 ग्राम शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ वयस्क माउस (यानी 2-4 महीने पुराना) एनेस्थेटाइज करें। फिर दर्द से राहत के लिए बुप्रेनोरफिन (0.05 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) का एक चमड़े का इंजेक्शन करें।
- फेनिलेफ्रिन 2.5% -ट्रॉपिड 0.5% की गिरावट के साथ डिलेट विद्यार्थियों।
- माउस हेड होल्डर में माउस को ठीक करें और स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत रखें।
- आंखों के सूखने से रोकने के लिए विसिडिक जेल की एक बूंद लगाएं।
- सुई में एक बाँझ 30 जी 1/2 का उपयोग कर स्क्लेरा और कॉर्निया (क्रमशः ओरा सेराटा)के बीच सीमा पर एक छोटा सा छेद बनाओ ।
- हीरे की कलम का उपयोग करके छोटे (लगभग 5 मिमी x 5 मिमी) टुकड़ों में एक आम कवर स्लाइड काटें, इन टुकड़ों में से एक को कॉर्निया के शीर्ष पर रखें, जिससे रेटिना का प्रत्यक्ष दृश्य हो।
- पूर्वतलीकृत माइक्रोलीटर सिरिंज को कई बार डिएरियन पानी के साथ फ्लश करें।
- माइक्रोलिटर सिरिंज को सेल सस्पेंशन के 1 माइक्रोल के साथ लोड करें, कंजक्टिवा और स्क्लेरा के माध्यम से सीधे सुई को स्पर्शात्मक रूप से लें और रेटिना के नाक के आधे हिस्से में दृश्य नियंत्रण में रखें।
- सबरेटिनल स्पेस तक पहुंचने तक रेटिना में धीरे-धीरे एक छेद पंच करें, सेल सस्पेंशन को सबरेटिनल स्पेस में इंजेक्ट करें।
- रेटिना की बुलस टुकड़ी का निरीक्षण करें, जो एक समान होना चाहिए, बिना किसी रक्तस्राव के रेटिना अंतरिक्ष के लगभग 1/4 को कवर करना।
- सिरिंज को धीरे-धीरे वापस लें, रेटिना होल सील स्वचालित रूप से।
- माइक्रोलिटर सिरिंज को कई बार डिवोनाइज्ड वॉटर से फ्लश करें।
- हेड होल्डर से माउस छोड़ें।
- मेडेटिमोइडी हाइड्रोक्लोराइड प्रभाव के उलट के लिए एटीपामोजोल हाइड्रोक्लोराइड इंजेक्शन द्वारा माउस को जागो।
- गर्म अंधेरे कक्ष (लगभग 25 डिग्री सेल्सियस) में जागने के समय के लिए माउस रखें।
- प्रत्यारोपण के अगले 2 दिन बाद, बुप्रेनोरफिन (शरीर के वजन का 0.05 मिलीग्राम/किलो) दर्द से राहत के लिए सुबह और दोपहर में चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाना चाहिए।
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Representative Results
माउस रेटिना में एकीकृत करने के लिए रॉड फोटोरिसेप्टर्स की क्षमता का आकलन करने के लिए, एक माउस रिपोर्टर लाइन का उपयोग किया गया था, जिसमें जीएफपी तंत्रिका रेटिना ल्यूसिन जिपर (एनआरएल, एनआरएल-जीएफपी) प्रमोटर11से प्रेरित है। एनआरएल वयस्कता के दौरान E12.5 पर अपनी अभिव्यक्ति शुरू करने वाले रॉड फोटोरिसेप्टर्स का सबसे पुराना मार्कर है, जिससे दाता रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की एक विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति है।
पीएन 4 एनआरएल-जीएफपी पिल्ले को हटा दिया गया और आंखों को परमाणु घोषित कर दिया गया । रेटिना तो अलग और ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर अलग और अलग किया गया । परिणामस्वरूप सेल निलंबन तो CD73 आधारित MACS(आंकड़े 1 और 2)का उपयोग कर हल किया गया था । मैक छंटाई के बाद, हमने इस प्रक्रिया के दौरान प्राप्त संवर्धन का विश्लेषण किया।
जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, प्रारंभिक सेल निलंबन (इनपुट) में 30.4% जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं थीं, यानी। रॉड फोटोरिसेप्टर। CD73-आधारित मैक-छंटाई के बाद, सीडी 73-पॉजिटिव अंश (सीडी 73 +) में 86.9% तक का संवर्धन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा देखा गया था। CD73-नकारात्मक अंश (CD73-) में सभी कोशिकाओं का केवल 9.9% जीएफपी(चित्रा 3 ए)के लिए सकारात्मक रूप से पता लगाया गया था। CD73-आधारित एमएएक्स के बाद एनआरएल-जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के संवर्धन को अतिरिक्त रूप से इन विट्रो (चित्रा 3B)में चढ़ाना के बाद कल्पना की जाती है।
मैक-छंटाई के बाद, CD73-सकारात्मक अंश में दाता कोशिकाओं नीचे घूमती है और २००,००० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया/ इस सेल निलंबन का उपयोग जंगली प्रकार के मेजबान रेटिना(चित्रा 4)के उपरेटिनल अंतरिक्ष में प्रत्यारोपण के लिए किया गया था। प्रत्यारोपण के बाद तीन से चार सप्ताह, मेजबान रेटिना तय, अलग और sectioned थे । मेजबानों की बाहरी परमाणु परत में एकीकृत कई दाता कोशिकाओं ने बाहरी परमाणु परत में सेल शरीर के स्थानीयकरण और सिनैप्टिक गोलाकार और आंतरिक खंडों(चित्र 5)के गठन के साथ परिपक्व फोटोरिसेप्टर्स की आकृति विज्ञान का अधिग्रहण किया। विस्तृत चित्र हमारे समूह द्वारा पहले प्रकाशित किया गया है3,8 एफएसी के साथ तुलनीय परिणाम दिखा-हल कोशिकाओं को अन्य समूहों द्वारा रेटिना की मेजबानी के लिए प्रत्यारोपित4,6,10. इन सभी अध्ययनों में संगत है, कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं इंजेक्शन की साइट पर रहते हैं, बुलस अलग मेजबान रेटिना द्वारा परिभाषित है, और दूर प्रवास नहीं है । कुछ मेजबान रेटिना (यानी बाहरी परमाणु परत) में एकीकृतकरते हैं, और कुछ सबरेटिनल स्पेस3में रहते हैं। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया है, कि एकीकरण की साइट पर दाता कोशिकाओं का वितरण माउस मॉडल के प्रकार पर निर्भर करता है5इस्तेमाल किया । C57BL/6J चूहों के बीच प्रत्यारोपण में कोई तीव्र मेजबान/भ्रष्टाचार अस्वीकृति संकेत नहीं पाए गए ।
चित्रा 1. वयस्क माउस रेटिना में एमएसी शुद्ध फोटोरिसेप्टर अग्रदूत के उपरेटिनल प्रत्यारोपण की समग्र योजना। पीएन 4 एनआरएल-जीएफपी पिल्ले से दाता कोशिकाओं को अलग किया जाता है, इसके बाद सीडी 73-आधारित मैक-सॉर्टिंग और माउस होस्ट रेटिना के सबरेटिनल स्पेस में प्रत्यारोपित किया जाता है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2। एमएएसएस द्वारा प्रत्यारोपण योग्य फोटोरिसेप्टर्स का संवर्धन। सभी एकत्र PN4 रेटिना से उत्पन्न सेल निलंबन प्राथमिक चूहा विरोधी CD73 एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड है जिसके बाद एंटी-रैटल एंटीबॉडी के साथ धोने और इनक्यूबेशन के बाद माइक्रोमोतियों के साथ संयुग्मित विरोधी एंटीबॉडी के साथ। अनबाउंड एंटीबॉडी बह जाती हैं । सेल सस्पेंशन एक एलएस-कॉलम के माध्यम से पारित किया जाता है जो चुंबकीय स्टैंड से जुड़ा होता है। एंटीबॉडी से बंधे कोशिकाएं स्तंभ से जुड़ी रहती हैं जबकि शेष कोशिकाओं को eluted और एकत्र किया जाता है (CD73-नकारात्मक अंश)। अंत में, एलएस-कॉलम को चुंबकीय स्टैंड से हटा दिया जाता है और शेष कोशिकाओं को एकत्र किया जाता है (सीडी 73-सकारात्मक अंश)। पूरी फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3। CD73-आधारित मैक-छंटाई के बाद एनआरएल-जीएफपी सकारात्मक सेल संवर्धन का विश्लेषण। (क)छंटाई से पहले, दाता कोशिकाओं की प्रारंभिक आबादी में एनआरएल-जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं का 30.4% था। मैक-सॉर्टिंग के बाद, CD73 + अंश (86.9%) जबकि सीडी 73-अंश में जीएफपी + कोशिकाओं (9.9%) की केवल कम मात्रा थी। (ख)प्रतिनिधि छवि PN4 एनआरएल-जीएफपी कोशिकाओं की सीडी 73-आधारित मैक-छंटाई के परिणाम का प्रदर्शन । हर अंश से 1 मिलियन कोशिकाओं को लेमिनिन-लेपित कवरस्लिप पर चढ़ाया गया था। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ चढ़ाना के बाद 4 घंटे तय किया गया । कोशिकाओं को DAPI (4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल, 1:20,000) से सना हुआ था। इनपुट अंश या सीडी 73-अंश की तुलना में CD73 + अंश में GFP-सकारात्मक कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण संवर्धन देखा गया था। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4. सुब्रेटिनल इंजेक्शन। वयस्क माउस रेटिना में प्रत्यारोपण प्रक्रिया की योजनाबद्ध ड्राइंग। सुई ओरा सेरेटामें एक छेद के माध्यम से डाला जाता है, लेंस को छूने से बचने और दृश्य नियंत्रण के तहत रेटिना पर रखा द्वारा विट्रेल स्पेस के माध्यम से नेविगेट किया जाता है। कोमल धक्का देकर, सुई रेटिना के माध्यम से मुक्का मारा जाता है और सुब्रीतिनल अंतरिक्ष में रखा जाता है। अंततः, सेल निलंबन टुकड़ी प्रक्रिया का मूल्यांकन करके दृश्य नियंत्रण के तहत ध्यान से इंजेक्शन है ।
चित्रा 5। प्रत्यारोपित फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का एकीकरण। एकीकृत सीडी 73-आधारित एमएएक्स चित्र को दर्शाते हुए वयस्क माउस रेटिना में प्रत्यारोपण के बाद पीएन4 एनआरएल-जीएफपी कोशिकाओं को हल किया गया। प्रत्यारोपित फोटोरिसेप्टर अग्रदूत सही ढंग से बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) में एकीकृत करते हैं और परिपक्व फोटोरिसेप्टर आकृति विज्ञान उत्पन्न करते हैं।
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Discussion
फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं का सबरेटिनल प्रत्यारोपण महत्वपूर्ण संख्या1,2में मेजबान रेटिना में इन प्रकाश-संवेदनशील कोशिकाओं के एकीकरण को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इससेभविष्यमें रेटिना अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए सेल थेरेपी की स्थापना हो सकती है । कोशिकाओं की दाता आबादी, वर्तमान में पीएन 4 रेटिना से अलग, विभिन्न सेल प्रकारों का मिश्रण है, जिसमें से केवल फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाएं सबरेटिनल इंजेक्शन के बाद एकीकृत होती हैं। CD73-आधारित मैक-सॉर्टिंग का उपयोग करके, दाता सेल निलंबन के भीतर फोटोरिसेप्टर के अनुपात को 90% ≈ तक बढ़ाया जा सकता है जो अनसॉर्टेड सेल आबादी 8 की तुलना में जंगली-प्रकार के मेजबान रेटिना में लगभग3गुना उच्च एकीकरण दर की अनुमति देता है। प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में, एमएएक्स में तेजी से छंटाई प्रक्रिया का लाभ है और यह जीएमपी मानकों पर अपेक्षाकृत आसान हो सकता है। प्रत्यारोपण योग्य फोटोरिसेप्टर का शुद्धिकरण12-14से फोटोरिसेप्टर्स के इन विट्रो उत्पादन के लिए हाल के फायदों के प्रकाश में विशिष्ट रुचि है। विभेदित pluripotent स्टेम सेल की संस्कृतियों विविध सेल से बना रहे है प्रकार विशिष्ट छंटाई प्रक्रियाओं की उपलब्धता सेल प्रत्यारोपण चिकित्सा में अपने भविष्य के उपयोग के लिए एक आवश्यक शर्त बना रही है ।
एमएसी-शुद्धिकरण प्रक्रिया के अनुसार, कई बिंदु उल्लेखनीय हैं, बिना बड़ी गड़बड़ी के वर्कफ्लो सुनिश्चित करते हैं। रेटिना की संख्या जितनी अधिक होगी, उनके पाचन के लिए उतना ही समय चाहिए। पाचन के बाद, छंटाई प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं के एकत्रीकरण से बचना होगा। यह अधिमानतः माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा और इसके इनक्यूबेशन के दौरान होता है। इस मामले में, कुल को तुरंत एक पिपेट के साथ हटाया जाना चाहिए। एमएसी-नकारात्मक अंश एकत्र करते समय एमएसी बफर के उन्मूलन के दौरान, कॉलम में 3 मिलीलीटर से अधिक नहीं जोड़ना बिल्कुल आवश्यक है। यदि 3 मिलीलीटर से अधिक बफर जोड़ा जाता है तो कॉलम में बफर का दबाव बहुत अधिक होगा। यह कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी के बंधन को परेशान करेगा और छंटाई दक्षता को कम करता है। मैक-पॉजिटिव अंश को इकट्ठा करना शुरू करने के लिए मैग्नेटिक स्टैंड से कॉलम को हटाते समय, यह कदम जल्दी से किया जाना चाहिए । 5 मिली लीटर मैक्स बफर को जितनी जल्दी हो सके कॉलम में जोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, डुबकी डाल दिया जाना चाहिए और जल्दी से दबाया जब तक पूरे बफर कॉलम के माध्यम से है । लागू दबाव के बारे में चिंता करना आवश्यक नहीं है। एमएस बफर आइसोटोनिक है और विविध किया जा सकता है। यह FACS बफर, सेल संस्कृति माध्यम, पीबीएस, EBSS, या HBSS का उपयोग करने के लिए संभव है। बफर की बंध्यता को 0.4 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करके प्राप्त किया जा सकता है।
एमएएसएस द्वारा संवर्धन के बाद, निम्नलिखित बिंदुओं को ध्यान में रखकर उपरेटिनल अंतरिक्ष में दाता कोशिकाओं का सफल प्रत्यारोपण प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं उपचार पूर्व वीवो के प्रति बहुत संवेदनशील लगती हैं, इसलिए उन्हें आवश्यकता से 4 डिग्री सेल्सियस अधिक समय तक रखना उचित नहीं है। जितनी जल्दी हो सके प्रत्यारोपण के लिए आगे बढ़ें। इंजेक्शन सुई को आंखों की पुतली में डालते समय, लेंस को छूने से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि अपेक्षाकृत तेज धातु सुई लेंस को नुकसान पहुंचा सकती है जिसके परिणामस्वरूप लेंस-प्रेरित यूवेइटिस शामिल हो सकता है। सबरेत अंतरिक्ष के रास्ते पर अंतिम कदम, रेटिना की पैठ, महत्वपूर्ण है। चूंकि यह नेत्रहीन नहीं माना जा सकता है कि क्या सबरेटिनल स्पेस तक पहुंच गया है, सही धक्का दबाव और ऊतक प्रतिरोध के लिए एक भावना विकसित करना महत्वपूर्ण है। परीक्षण करने के लिए, यदि सुई सिर को सही ढंग से रखा जाता है, तो एक छोटी मात्रा लागू की जा सकती है और सुई सिर पर रेटिना की टुकड़ी को ध्यान से देखा जाना चाहिए। यदि रक्तस्राव के बिना एक दौर, बुलस टुकड़ी बन रही है, तो स्थिति सही है और बाकी समाधान सावधानी से लागू किया जा सकता है। इंजेक्शन के दौरान, सुई को अपनी स्थिति में रहना चाहिए ताकि ऊतक को और अधिक नुकसान से बचा जा सके। इंजेक्शन सुई द्वारा बनाया गया रेटिना छेद धीरे-धीरे मुकर जाता है तो इंजेक्शन सुई द्वारा बनाया गया रेटिना छेद खुद से सील हो जाएगा। पूरी प्रक्रिया को आगे तनाव और जानवर को नुकसान से बचने के लिए संभव समय की न्यूनतम राशि में किया जाना चाहिए। प्रत्यारोपण के दौरान, सेल निलंबन झुरमुट और माइक्रोलिटर सिरिंज ब्लॉक करने के लिए जाता है । यदि ऐसा होता है, तो बाँझ पीबीएस या एचबीएसएस का उपयोग करके सेल निलंबन को कमजोर करने का सुझाव दिया जाता है। इस समस्या को दूर करने की एक और संभावना कोशिका निलंबन के लिए DNAse I के 1 माइक्रोन जोड़ना है, मृत कोशिकाओं से डीएनए झुरमुट को भंग करना, जो जीवित कोशिकाओं को एक साथ गोंद करते हैं।
यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं की चुंबकीय छंटाई तक ही सीमित है। इसलिए, कोशिकाओं को छंटाई दौर प्रति केवल एक मार्कर के लिए हल किया जा सकता है । प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में, जहां कोशिकाओं को एक ही समय में विभिन्न मार्कर (शारीरिक गुणों के साथ-साथ विभिन्न कोशिका सतह मार्कर सहित) का उपयोग करके हल किया जा सकता है, यह इस तकनीक का एक बड़ा नुकसान है। जब भी कम समय की खिड़की में विभिन्न मार्कर के लिए छंटाई की आवश्यकता होती है, तो प्रवाह साइटोमेट्री बेहतर समाधान हो सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट गुणों के लिए छंटाई, जैसे ट्रांसजेनिक रूप से व्यक्त जीएफपी या अन्य जीवन कोशिका मार्कर इस तकनीक के साथ संभव नहीं है। यह वर्तमान में कोशिका सतह एंटीबॉडी के उपयोग तक सीमित है जिसे चुंबकीय मोतियों के साथ संयोजित किया जा सकता है। फिर भी, इस तकनीक का उपयोग किए जाने वाले तकनीकी उपकरणों के आधार पर बढ़ाया जा सकता है।
चूंकि मिल्टेयी बायोटेक वर्तमान में चुंबकीय सेल छंटाई उपकरणों का एकमात्र प्रदाता है, इसलिए आज तक कोई विकल्प उपलब्ध नहीं है। सेल वियोजन के लिए, पापिन(यानी ट्राइप्सिन) की तुलना में अन्य एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें, हमारी प्रयोगशाला ने पापीन के साथ सबसे अच्छा परिणाम हासिल किया, क्योंकि यह हमारे हाथों में सबसे कोमल वियोजन एंजाइम लगता है। पापिन पाचन (30-60 मिनट) की समय खिड़की चर है। इस समय खिड़की में इष्टतम पाचन हमारी प्रयोगशाला में हासिल किया गया था। नमूना आकार, नमूना गुणवत्ता और एंजाइम के आधार पर कम या अधिक समय इनक्यूबेशन समय आवश्यक हो सकता है। व्यक्तिगत परीक्षण का सुझाव दिया जाता है।
यह देखते हुए कि एकल कदम MACS प्रवाह साइटोमेट्री के रूप में उच्च के रूप में शुद्धता के स्तर तक नहीं पहुंचता है, इस तकनीक का एक संभावित आगे आवेदन अवांछित और संभावित हानिकारक कोशिकाओं के नकारात्मक छंटाई हो सकता है । वहां, किसी दिए गए सेल सतह मार्कर के लिए सेल अंश सकारात्मक लेकिन ब्याज की नहीं को हल किया जा सकता है, जिससे प्रवाह में अलग-थलग ब्याज का अंश होता है। यह पहले से या एक सकारात्मक छंटाई कदम के बाद किया जा सकता है और विभिन्न कोशिका सतह मार्कर का उपयोग कर कोशिकाओं के आगे भेदभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अवांछित कोशिकाओं को हटाने की अनुमति देता है, फीडर परत कोशिकाओं या उनके संभावित ट्यूमरजेनिक जोखिम के साथ pluripotent स्टेम सेल संस्कृतियों से अविभेदित कोशिकाओं की तरह । इसलिए, एमएएक्स संभावित भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोगों में ईएस या आईपीएस सेल संस्कृतियों से फोटोरिसेप्टर के शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त हो सकता है क्योंकि यह सुसंस्कृत कोशिकाओं की उच्च मात्रा के शुद्धिकरण के लिए एक सौम्य, तेज और सरल उपचार का प्रतिनिधित्व करता है। एमएएक्स को आसानी से जीएमपी-शर्तों पर लागू किया जा सकता है क्योंकि छंटाई के चरणों के विवरण, यानी यांत्रिकी, तरल पदार्थ और प्रक्रियाएं प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में कम हो जाती हैं। यह उल्लेखनीय है, कि एमएक पहले से ही नियमित रूप से रक्त या अस्थि मज्जा से कोशिकाओं के संवर्धन के लिए नैदानिक परीक्षणों में प्रयोग किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एमएक को कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है जब कोई उपयुक्त कोशिका सतह मार्कर मौजूद नहीं होता है, आनुवंशिक रूप से बाद में चुंबकीय कोशिका छंटाई चरण15के लिए कोशिकाओं को "सक्षम" बनाने के लिए सतह मार्कर पेश करके।
संक्षेप में, एमएएक्स प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए सेल सतह मार्कर का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक विश्वसनीय और तेज उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अतिरिक्त, यह भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक आसानी से रोजगारपरक विधि है जिसके लिए जीएमपी-शर्तों की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
हम एनआरएल-जीएफपी चूहों, तकनीकी सहायता के लिए जोचेन हास, और पशुपालन के लिए सिंडी बोह्मे और एमली लेसमैन प्रदान करने के लिए आनंद स्वरूप का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
इस काम को ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमिन्सचैफ्ट (डीएफजी) द्वारा समर्थित किया गया था: एफजेडटी 111 - पुनर्योजी चिकित्सा ड्रेसडेन का केंद्र, सीआरटीडी सीड ग्रांट प्रोग्राम, एसएफबी 655, और प्रोरेटीना ई.वी. फाउंडेशन, DIGS-BB ग्रेजुएट प्रोग्राम ड्रेसडेन, और Fundação पैरा एक Ciência ई टेक्नोलोजिया (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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