Summary
Celletransplantasjon representerer en strategi for behandling av retinal degenerasjon preget av fotoreseptortap. Her beskriver vi en metode for berikelse av transplanterbare fotoreseptorer og deres subretinale podning til voksne mus.
Abstract
Synshemming og blindhet på grunn av tap av de lysfølsomme cellene i netthinnen, det vil si fotoreseptorer, representerer hovedårsaken til funksjonshemming i industrialiserte land. Utskifting av degenererte fotoreseptorer ved celletransplantasjon representerer et mulig behandlingsalternativ i fremtidige kliniske applikasjoner. Faktisk viste nyere prekliniske studier at umodne fotoreseptorer, isolert fra neonatal mus netthinnen på postnatal dag 4, har potensial til å integrere seg i voksenmus netthinnen etter subretinal transplantasjon. Donorceller genererte en moden fotoreseptormorfologi, inkludert indre og ytre segmenter, en rund cellekropp plassert på det ytre kjernefysiske laget, og synaptiske terminaler i nærheten av endogene bipolare celler. Faktisk viste nylige rapporter at donor fotoreseptorer funksjonelt integreres i nevrale kretser av vertsmus. For en fremtidig klinisk anvendelse av en slik celleerstatningstilnærming, må rensede suspensjoner av de valgte cellene genereres og plasseres i riktig posisjon for riktig integrasjon i øyet. For berikelse av fotoreseptorforløpere bør sortering være basert på spesifikke celleoverflateantigener for å unngå genetisk reportermodifisering av donorceller. Her viser vi magnetisk assosiert cellesortering (MACS) - berikelse av transplanterbare stang fotoreseptorforløpere isolert fra neonatal netthinnen til fotoreseptorspesifikke reportermus basert på celleoverflatemarkøren CD73. Inkubasjon med anti-CD73 antistoffer etterfulgt av mikro-perle konjugerte sekundære antistoffer tillot berikelse av stang fotoreseptor forløpere av MACS til ca. 90%. Sammenlignet med strømningscytometri har MACS fordelen at det kan brukes lettere på GMP-standarder, og at høye mengder celler kan sorteres i relativt korte tidsperioder. Injeksjon av berikede cellesuspensjoner i det subretinaale rommet til voksne villtype mus resulterte i en 3 ganger høyere integrasjonshastighet sammenlignet med usorterte cellesuspensjoner.
Introduction
Visjon er en av menneskets viktigste sanser. Svekkelse av denne sansen og blindheten er en av hovedårsakene til funksjonshemming i industrialiserte land. Den dominerende årsaken til synshemming eller blindhet er retinal degenerasjon, preget av fotoreseptorcelletap, da det kan observeres i makuladegenerasjon, retinitis pigmentosa, kegle-stang dystrofi og andre forhold. Til dags dato er en effektiv terapi for å gjenopprette tapt syn ikke tilgjengelig. I 2006 og 2008 rapporterte to forskjellige laboratorier, uavhengig av hverandre, en vellykket transplantasjon av stang fotoreseptor forløperceller til voksne villtype mus netthinner1,2. Dermed oppstår muligheten for fotoreseptor forløper celletransplantasjon også inn i en degenerert netthinne, for å erstatte degenererte fotoreseptorer og gjenopprette syn. Faktisk har det blitt demonstrert nylig, at slike transplanterte fotoreseptorforløperceller fremkaller morfologiske kriterier av modne ville fotoreseptorer, for eksempel riktig utviklede ytre segmenter3, synaptiske terminaler i nærheten av endogene bipolare celler og en rund cellekropp som ligger i det ytre kjernefysiske laget2-4, samt evnen til å integrere funksjonelt i verten nevrale kretser5-7. Et av hovedprinsippene i denne strategien er bruken av postnatal dag 4 (PN 4, PN0 er definert som fødselsdagen) unge mus netthinner, noe som resulterer i en blanding av forskjellige celletyper for transplantasjon. På bakgrunn av en fremtidig terapeutisk applikasjon må denne blandingen renses for fotoreseptorforløperceller. CD73 har blitt beskrevet som den første celleoverflatemarkøren som er spesifikk for unge fotoreseptorer i netthinnen8-10. Her demonstrerer vi en photoreceptor forløper cellerensingsmetode basert på denne celleoverflatemarkøren og ved bruk av den magnetiske tilknyttede cellesorteringsteknikken (MACS). MACS kan ha fordeler sammenlignet med fluorescerende aktiverte cellesorteringsteknikker, på grunn av raske sorteringstider og enklere justering av GMP-forhold. Vi kunne demonstrere en ~ 90% berikelse og en opptil 3 ganger høyere integrasjonsrate når vi transplanterer den berikede befolkningen til subretinalrommet i voksne villtype netthinner. Dermed er MACS-basert fotoreseptorforløper forløpercelleberikelse og subretinal transplantasjon pålitelig og lovende teknikker for utvikling av en regenerativ terapeutisk strategi for behandling av retinal degenerasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk bruk og pleie av dyrs uttalelse:
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til EU og tyske lover (Tierschutzgesetz) og fulgte ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Alle dyreforsøk ble godkjent av dyreetikkkomiteen i TU Dresden og Landesdirektion Dresden (godkjenningsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Før du starter celledissosiasjon og cellesortering
- Etikett tre 15 ml reaksjonsrør med: Vask (W), Positiv brøkdel (+) og Negativ brøkdel (-).
2. Retina dissosiasjon
- Decapitate PN 4 valper ved hjelp av en saks.
- Skyll valpens hode kort tid i 70% etanol etterfulgt av vask i PBS.
- Overfør hodet til kald HBSS og forføre øyet (gjenta dette trinnet for alle hodene). For å enucleate, åpne øyelokkene og fikse øyet med buede tang på synsnerveområdet. Trekk deretter øyet forsiktig ut av banen.
- Etter å ha forført alle øynene, isoler netthinnen: innfør en lukket saks i synsnerven og åpne bladene. Peal RPE/chorid ut. Fjern linsene og blodårene ved hjelp av buede tang.
- Overfør de isolerte netthinnene til et 1,5 ml reaksjonsrør som inneholder papainoppløsningen (levert av papain dissosiasjonssettet).
- Inkuber netthinnene i papainoppløsningen i 30-60 min i et vannbad eller shaker (400 rpm) ved 37 °C.
- Mens netthinner inkuberer i papainoppløsningen, pipette 1 ml ovomukoidoppløsning til et 15 ml reaksjonsrør (etikett "1").
- Tilsett 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl ovomucoid oppløsning (levert av settet) + 520 μl EBSS til et 15 ml reaksjonsrør (etikett "2").
- Etter papain inkubasjon, overfør papain-løsningen som inneholder de delvis fordøyde netthinnene til reaksjonsrøret "2".
- Bruk en brannpolert pipette til å utføre mekanisk dissosiasjon (10x opp og ned).
- Pipette enkeltcellefjæringen til reaksjonsrøret "1". Prøv å generere 2 lag ved å forsiktig legge celleopphenget på toppen av ovomukoidløsningen.
- Sentrifuge i 5 min ved 300 x g (ca. 1300 o/min).
- Kast supernatanten og resuspend cellene i 500 μl MACS-buffer.
3. Cellesortering ved hjelp av magnetisk tilknyttet cellesortering (MACS)
- Tilsett X μl rotte anti-CD73 antistoff til 500 μl for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml.
- Inkuber 5 min på is.
- Fyll 15 ml reaksjonsrør til 10 ml med MACS-buffer og sentrifuger det i 5 minutter med en hastighet på 300 x g.
- Fjern supernatanten.
- Resuspend pellet i 480 μl MACS buffer og tilsett 120 μl geit anti-rotte IgG mikrober.
- Inkuber 15 min på is; Ikke rør, rist eller bland den.
- Fyll 15 ml reaksjonsrør til 5 ml med MACS-buffer og sentrifuger det i 5 min ved 300 x g.
- Som reaksjonsrøret er sentrifugert:
- Juster en LS-kolonne i det magnetiske stativet.
- Plasser forutinnsettingsfilteret oppå LS-kolonnen.
- Hydrater fordatafilteret og LS-kolonnen med 3 ml MACS-buffer og samle MACS-bufferen i vaskerøret (W).
- Fjern supernatanten.
- Resuspend pellet i 500 μl MACS buffer.
- Last 500 μl cellefjæringen til filteret, tilsett deretter 1 ml MACS-buffer til filteret og samle den negative brøkdelen inn i det negative brøkdelsrøret (-).
- Deretter legger du til 3 x 3 ml MACS-buffer i kolonnen for å vaske av cellene som ikke er bundet til kolonnen
- Når disse 9 ml er gjennom LS-kolonnen, fjern kolonnen fra magnetstativet og installer den på toppen av det positive brøkdelsrøret (+).
- Last raskt inn 5 ml MACS-buffer i LS-kolonnen og sett stempelet i LS-kolonnen og trykk det ned til hele bufferen er gjennom kolonnen.
- Sentrifuger reaksjonsrøret som inneholder den positive fraksjonen i 5 min ved 300 x g.
- Fjern supernatanten, resuspend i 500 μl MACS-buffer og hold den ved 4 °C.
- Telle den totale mengden celler ved hjelp av en felles celletellingsenhet.
- Forbered en celleoppheng fra den positive sorterte brøken som inneholder 2 x 105 celler / μl i MACS-buffer og hold ved 4 °C
4. Transplantasjon av MAC-sorterte fotoreseptorforløperceller i musretina
- Sørg for å ha alle følgende løsninger klare: 1 ml steril PBS eller HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steril deionisert H2O, aliquots av cellefjæringsfraksjonene ved 4 °C.
- Bedøv den voksne musen(dvs. 2-4 måneder gammel) med en intraperitoneal injeksjon av medetomidinhydroklorid (0,01 mg/10 g kroppsvekt), ketamin (0,75 mg/10 g kroppsvekt). Gjør deretter en subkutan injeksjon av Buprenorfin (0,05 mg/kg kroppsvekt) for smertelindring.
- Dilate elever med en dråpe Fenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fest musen i musehodeholderen og plasser den under stereomikroskopet.
- Påfør en dråpe visidisk gel for å forhindre tørking av øyet.
- Lag et lite hull ved grensen mellom sclera og hornhinnen (henholdsvis ora serrata) ved hjelp av en steril 30 G 1/2 i nål.
- Klipp et felles deksel glir inn i små (ca. 5 mm x 5 mm) stykker ved hjelp av en diamantpenn, plasser en av disse stykkene på toppen av hornhinnen, slik at direkte visualisering av netthinnen.
- Skyll den presteriliserte mikrolitersprøyten flere ganger med deionisert vann.
- Last mikroliter sprøyten med 1 μl celle suspensjon, direkte nål tangentielt gjennom konjunktiv og sclera og plasser under visuell kontroll i nesehalvdelen av netthinnen.
- Slå forsiktig et hull i netthinnen til du når subretinalrommet, injiser celleopphenget i subretinalrommet.
- Vær oppmerksom på bullous løsrivelse av netthinnen, som skal være ensartet, dekker ca 1/4 av netthinnen plass uten blødning.
- Trekk sprøyten forsiktig ut, netthinnehullet forsegles automatisk.
- Skyll mikrolitersprøyten flere ganger med deionisert vann.
- Slipp musen fra hodeholderen.
- Våkn opp musen ved å injisere atipamozolehydroklorid for reversering av medetomidinhydroklorideffekten.
- Plasser musen for vekketid i varmt mørkt kammer (ca. 25 °C).
- De neste 2 dagene etter transplantasjonen skal Buprenorfin (0,05 mg/kg kroppsvekt) administreres ved subkutan injeksjon om morgenen og om ettermiddagen for smertelindring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere stangfotoreseptorenes evne til å integrere seg i musetina, ble det brukt en musereporterlinje, der GFP drives av den nevrale netthinnen leucinglidelåsen (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl er den tidligste markøren av stang fotoreseptorer som starter sitt uttrykk på E12.5 gjennom voksen alder, slik at en bestemt merking av donorstang fotoreseptorceller.
PN 4 Nrl-GFP valper ble halshugget og øynene ble utdannet. Netthinner ble deretter isolert og dissosiert ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor. Den resulterende cellesuspensjonen ble deretter sortert ved hjelp av CD73-basert MACS (figur 1 og 2). Etter MAC-sortering analyserte vi berikelsen som ble oppnådd under denne prosedyren.
Som vist i figur 3Ainneholdt den første cellesuspensjonen (Input) 30,4 % GFP-positive celler, dvs. stang fotoreseptorer. Etter CD73-basert MAC-sortering ble en berikelse på opptil 86,9 % i CD73-positiv brøk (CD73+) observert ved strømningscytometri. I CD73-negativ brøk (CD73-) ble bare 9,9 % av alle celler oppdaget positivt for GFP (figur 3A). Berikelsen av Nrl-GFP positive celler etter CD73-basert MACS visualiseres i tillegg etter plating in vitro (Figur 3B).
Etter MAC-sortering ble donorceller i CD73-positiv brøkdel spunnet ned og resuspendert til en endelig konsentrasjon på 200.000 celler / μl. Denne cellefjæringen ble videre brukt til transplantasjon i det subretinaale rommet til villtype verts netthinner (figur 4). Tre til fire uker etter transplantasjon ble verts netthinnene fikset, isolert og seksjonert. Flere donorceller integrert i vertenes ytre kjernefysiske lag og kjøpte morfologien til modne fotoreseptorer med lokalisering av cellekroppen i det ytre kjernefysiske laget og dannelse av synaptiske sfærer og indre segmenter (Figur 5). Detaljerte bilder har blitt publisert før av vår gruppe3,8 viser et resultat som kan sammenlignes med FAC-sorterte celler transplantert for å være vert for netthinne av andre grupper4,6,10. Konsistent i alle disse studiene er at de transplanterte cellene forblir på injeksjonsstedet, definert av den bullous frittliggende verts netthinnen, og ikke migrerer bort. Noen integreres i verts netthinnen (dvs. ytre kjernefysisk lag), og noen forblir i subretinal plass3. I tillegg har det blitt vist at fordelingen av donorceller på integrasjonsstedet avhenger av typen musemodell som brukes5. Det ble ikke påvist akutte tegn på avvisning av vert/transplantat i transplantasjoner mellom C57BL/6J-mus.
Figur 1. Samlet ordning for subretinal transplantasjon av MACS renset fotoreseptor forløpere til voksen mus netthinne. Donorceller fra PN 4 Nrl-GFP-valper er isolert, etterfulgt av CD73-basert MAC-sortering og transplantert i det subretinaale rommet til museverts netthinner. Klikk her for å vise større figur.
Figur 2. Berikelse av transplanterbare fotoreseptorer av MACS. Cellefjæringen generert fra alle innsamlede PN4 netthinner inkuberes med primær rotte anti-CD73 antistoffer etterfulgt av vask og inkubasjon med anti-rotte antistoffer konjugert med mikrober. Ubundne antistoffer vaskes bort. Celleopphenget går gjennom en LS-kolonne som er forbundet med et magnetisk stativ. Celler som er bundet av antistoffer forblir festet til kolonnen mens de resterende cellene blir eluted og samlet (CD73-negativ brøkdel). Til slutt fjernes LS-kolonnen fra magnetstativet, og de resterende cellene blir eluted og samlet (CD73-positiv brøkdel). Klikk her for å vise hele filmen.
Figur 3. Analyse av Nrl-GFP positiv celleberikelse etter CD73-basert MAC-sortering. (A) Før sortering inneholdt den første populasjonen av donorceller 30,4% av Nrl-GFP positive celler. Etter MAC-sortering kan det oppdages en berikelse av GFP-positive celler i CD73+-brøken (86,9 %) mens CD73-brøken bare inneholdt lave mengder GFP+-celler (9,9 %). (B) Representativt bilde som viser resultatet av CD73-basert MAC-sortering av PN4 Nrl-GFP-celler. 1 million celler fra hver brøkdel ble belagt på lamininbelagte deksler. Celler ble fikset 4 timer etter plating med 4% PFA i 10 min. Cellene ble farget med DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole, 1:20,000). En betydelig berikelse av GFP-positive celler i CD73+ fraksjonen ble observert sammenlignet med inngangsfraksjonen eller CD73-fraksjonen. Klikk her for å vise større figur.
Figur 4. Subretinal injeksjon. Skjematisk tegning av transplantasjonsprosessen inn i voksenmus netthinnen. Nålen settes inn gjennom et hull i ora serrata, navigeres gjennom glasslegemet ved å unngå å berøre linsen og plasseres ved netthinnen under visuell kontroll. Ved forsiktig dytting blir nålen slått gjennom netthinnen og plassert i subretinalrommet. Til slutt injiseres cellefjæringen nøye under visuell kontroll ved å evaluere løsningen.
Figur 5. Integrasjon av transplanterte fotoreseptorceller. Representativt bilde som viser integrert CD73-basert MACS sortert PN4 Nrl-GFP celler etter transplantasjon i voksen mus netthinnen. Transplanterte fotoreseptorforløpere integreres riktig i det ytre kjernefysiske laget (ONL) og genererer moden fotoreseptormorfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal transplantasjon av fotoreseptorforløperceller representerer et pålitelig verktøy for å oppnå integrasjon av disse lysfølsomme cellene i verts netthinner i betydelige tall1,2. Dette kan tillate etablering av en celleterapi for behandling av retinal degenerative sykdommer i fremtiden6. Donorpopulasjonen av celler, for tiden isolert fra PN 4 netthinner, er en blanding av forskjellige celletyper, hvorfra bare fotoreseptorforløpercellene integreres etter subretinal injeksjon. Ved å bruke CD73-basert MAC-sortering kan andelen fotoreseptorer i donorcellefjæringen økes til ≈ 90 % som tillater en omtrent 3 ganger høyere integrasjonshastighet i villtype verts netthinner sammenlignet med den usorterte cellepopulasjonen8. Sammenlignet med strømningscytometri har MACS fordelen av en rask sorteringsprosedyre, og at den kan brukes relativt enkelt på GMP-standarder. Rensing av transplanterbare fotoreseptorer er av spesiell interesse for lys av nylige fordeler for in vitro-generasjonen av fotoreseptorer fra pluripotente stamceller12-14. Kulturer av differensierte pluripotente stamceller består av forskjellige celletyper, noe som gjør tilgjengeligheten av spesifikke sorteringsprosedyrer til en viktig forutsetning for fremtidig bruk i celletransplantasjonsterapier.
I følge MACS-renseprosedyren er flere punkter bemerkelsesverdige, noe som sikrer en arbeidsflyt uten store forstyrrelser. Jo høyere antall netthinner som skal sorteres, jo mer tid er nødvendig for fordøyelsen. Etter fordøyelsen, under sorteringsprosedyren, må aggregering av celler unngås. Dette skjer fortrinnsvis før tilsetning av sekundært antistoff og under inkubasjonen. I dette tilfellet må aggregatet fjernes umiddelbart med en pipette. Under elution av MACS-buffer mens du samler MACS-negativ brøkdel, er det absolutt nødvendig å ikke legge til mer enn 3 ml i kolonnen. Buffertrykket til kolonnen vil være for høyt hvis mer buffer enn 3 ml tilsetts. Dette vil forstyrre bindingen av antistoffet til cellene og senker sorteringseffektiviteten. Når du fjerner kolonnen fra magnetstativet for å begynne å samle den MACS-positive fraksjonen, må dette trinnet gjøres raskt. 5 ml MACS-buffer bør legges til kolonnen så raskt som mulig. Også stupet skal settes og trykkes raskt til hele bufferen er gjennom kolonnen. Det er ikke nødvendig å bekymre seg for det påførte trykket. MACS-bufferen er isotonisk og kan varieres. Det er mulig å bruke FACS-buffer, cellekulturmedium, PBS, EBSS eller HBSS. Bufferens sterilitet kan oppnås ved å filtrere gjennom en 0,4 μm filtermembran.
Etter berikelse fra MACS kan en vellykket transplantasjon av donorceller til subretinalrommet oppnås ved å huske på følgende punkter. Siden fotoreseptorceller ser ut til å være svært følsomme for behandling ex vivo, er det ikke tilrådelig å holde dem på 4 °C lenger enn nødvendig. Fortsett for transplantasjon så fort som mulig. Når du setter injeksjonsnålen inn i øyebollet, er det viktig å unngå å berøre linsen, da den relativt skarpe metallnålen kan skade linsen som resulterer i induksjon av linseindusert uveitt. Det siste trinnet på vei til det subretinaale rommet, penetrasjonen av netthinnen, er avgjørende. Siden det ikke visuelt kan observeres om subretinalrommet nås, er det viktig å utvikle en følelse for riktig trykktrykk og vevsmotstand. For å teste, hvis nålehodet er plassert riktig, kan et lite volum påføres og løsningen av netthinnen ved nålehodet bør observeres nøye. Hvis en rund, bullous løsrivelse uten blødning dannes, er stillingen riktig og resten av løsningen kan påføres nøye. Under injeksjonen bør nålen forbli i sin posisjon for å unngå ytterligere skade på vevet. Netthinnehullet som skapes av injeksjonsnålen, forsegles av seg selv hvis nålen trekkes sakte tilbake. Hele prosedyren bør gjøres på minimal tid som mulig for å unngå ytterligere stress og skade på dyret. Under transplantasjon har celleopphenget en tendens til å klumpe og blokkere mikrolitersprøyten. Hvis dette skjer, foreslås en fortynning av cellefjæringen ved hjelp av steril PBS eller HBSS. En annen mulighet til å overvinne dette problemet er å legge til 1 μl DNAse I til cellefjæringen, for å oppløse DNA-klumper fra døde celler, som har en tendens til å lime levende celler sammen.
Denne protokollen er begrenset til den magnetiske sorteringen av celler. Derfor kan cellene bare sorteres for én markør per sorteringsrunde. Sammenlignet med strømningscytometri, hvor celler kan sorteres ved hjelp av forskjellige markører (inkludert fysiologiske egenskaper samt forskjellige celleoverflatemarkører) samtidig, er dette en stor ulempe ved denne teknikken. Når sorteringen for forskjellige markører i et kort tidsvindu er nødvendig, kan strømningscytometri være den bedre løsningen. Også sortering for fluorescerende egenskaper av celler, som transgenisk uttrykt GFP eller andre livscellemarkører er ikke mulig med denne teknikken. Det er for tiden begrenset til bruk av celleoverflate antistoffer som kan konjugeres med magnetiske perler. Likevel kan denne teknikken skaleres opp basert på det tekniske utstyret som brukes.
Siden Miltenyi Biotec for tiden er den eneste leverandøren av magnetiske cellesorteringsverktøy, er det ikke noe alternativ tilgjengelig til dags dato. For celledissosiasjon kan andre enzymer enn papain (dvs. trypsin) brukes. Vær oppmerksom på at laboratoriet vårt oppnådde de beste resultatene med papain, siden dette ser ut til å være det mest milde dissosiasjonsenzymet i våre hender. Tidsvinduet for papain fordøyelse (30-60 min) er variabelt. I denne tiden ble optimal fordøyelse oppnådd i laboratoriet vårt. Kortere eller lengre inkubasjonstid kan være nødvendig avhengig av prøvestørrelse, prøvekvalitet og enzymet som brukes. Individuell testing foreslås.
Gitt at enkeltsteg MACS ikke når renhetsnivåer så høye som strømningscytometri, kan en mulig videre anvendelse av denne teknikken være negativ sortering av uønskede og potensielle skadelige celler. Der kan cellefraksjonen positiv for en gitt celleoverflatemarkør, men ikke av interesse sorteres ut, slik at brøkdelen av interessen er isolert i gjennomstrømningen. Dette kan gjøres på forhånd eller etter et positivt sorteringstrinn og tillater ytterligere diskriminering av celler ved hjelp av forskjellige celleoverflatemarkører, samt fjerning av uønskede celler, som materlagceller eller uavklarte celler fra pluripotente stamcellekulturer med potensiell tumorgen risiko. Derfor kan MACS være egnet for rensing av fotoreseptorer fra ES- eller iPS-cellekulturer i mulige fremtidige terapeutiske applikasjoner, da det representerer en mild, rask og enkel behandling for rensing av høye mengder dyrkede celler. MACS kan enkelt brukes på GMP-forhold siden detaljene i sorteringstrinn, det vil si mekanikk, væsker og prosedyrer reduseres sammenlignet med strømningscytometri. Det er bemerkelsesverdig at MACS allerede rutinemessig brukes i kliniske studier for berikelse av celler fra blod eller benmarg. Interessant nok kan MACS til og med brukes på celler når ingen passende celleoverflatemarkør er til stede, ved å genetisk introdusere en overflatemarkør for å gjøre cellene "kompetente" for etterfølgende magnetisk cellesortering trinn15.
Oppsummert representerer MACS et pålitelig og raskt verktøy for å berike fotoreseptorforløperceller ved hjelp av celleoverflatemarkører for transplantasjonsstudier. I tillegg er det en lett anvendelig metode for fremtidige kliniske applikasjoner som krever GMP-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi liker å takke Anand Swaroop for å ha gitt Nrl-GFP mus, Jochen Haas for teknisk støtte, og Sindy Böhme og Emely Lessmann for husdyrhold.
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, CRTD Seed Grant Program, SFB 655 og ProRetina e.V. stiftelse, DIGS-BB Graduate Program Dresden, og Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
