Summary
Celltransplantation representerar en strategi för behandling av retinal degeneration kännetecknas av photoreceptor förlust. Här beskriver vi en metod för berikning av transplanterbara fotoreceptorer och deras subretinal ympning i vuxna möss.
Abstract
Synnedsättning och blindhet på grund av förlusten av näthinnans ljusavkännande celler, dvs. fotoreceptorer, utgör den främsta orsaken till funktionshinder i industrialiserade länder. Ersättning av degenererade fotoreceptorer genom celltransplantation representerar ett möjligt behandlingsalternativ i framtida kliniska tillämpningar. Nyligen genomförda prekliniska studier visade faktiskt att omogna fotoreceptorer, isolerade från neonatalmus näthinnan vid postnatal dag 4, har potential att integreras i den vuxna mus näthinnan efter subretinal transplantation. Donatorceller genererade en mogen fotoreceptormorfologi inklusive inre och yttre segment, en rund cellkropp belägen vid det yttre kärnskiktet och synaptiska terminaler i närheten av endogena bipolära celler. Faktum är att de senaste rapporterna visade att donatorfotoreceptorer funktionellt integreras i de neurala kretsarna hos värdmöss. För en framtida klinisk tillämpning av en sådan cellersättningsmetod måste rena suspensioner av de celler som väljer genereras och placeras i rätt position för korrekt integration i ögat. För berikning av photoreceptor prekursorer bör sortering baseras på specifika cellytans antigener för att undvika genetisk reporter modifiering av donatorceller. Här visar vi magnetiskt associerad cellsortering (MACS) - berikning av transplanterbara stångfotoreceptorprekursorer isolerade från neonatal näthinnan hos fotoreceptorspecifika reportermöss baserade på cellytans markör CD73. Inkubation med anti-CD73 antikroppar följt av mikro-pärla konjugerade sekundära antikroppar tillät anrikning av stång photoreceptor prekursorer av MACS till cirka 90%. I jämförelse med flödescytometri har MACS fördelen att det kan vara lättare att tillämpa på GMP-standarder och att stora mängder celler kan sorteras under relativt korta tidsperioder. Injektion av berikade cell suspensioner i subretinal utrymmet hos vuxna vilda möss resulterade i en 3-faldig högre integrationshastighet jämfört med osorterade cell suspensioner.
Introduction
Vision är en av människans främsta sinnen. Försämring av denna känsla och blindhet är en av de främsta orsakerna till funktionshinder i industrialiserade länder. Den dominerande orsaken till synnedsättning eller blindhet är retinal degeneration, kännetecknad av fotoreceptor cellförlust, eftersom det kan observeras i makuladegeneration, retinitis pigmentosa, kon-rod dystrofi och andra villkor. Hittills är en effektiv terapi för att återställa förlorad syn inte tillgänglig. Under 2006 och 2008 rapporterade två olika laboratorier, oberoende av varandra, en framgångsrik transplantation av stavfotoreceptorprekursorceller till vuxna vilda möss näthinnorna1,2. Således uppstår möjligheten av photoreceptor föregångare celltransplantation också i en degenererad näthinnan, att ersätta urartade fotoreceptorer och återställa vision. Det har faktiskt nyligen visats att sådana transplanterade fotoreceptorprekursorceller framkallar morfologiska kriterier för mogna fotoreceptorer av vildtyp, såsom korrekt utvecklade yttre segment3, synaptiska terminaler i närheten av endogena bipolära celler och en rund cellkropp belägen i det yttrekärnskiktet 2-4, liksom förmågan att integrera funktionellt i värden neurala kretsar5-7. En av huvudprinciperna i denna strategi är användningen av postnatal dag 4 (PN 4, PN0 definieras som födelsedag) unga möss näthinnorna, vilket resulterar i en blandning av olika celltyper för transplantation. På bakgrunden av en framtida terapeutisk tillämpning måste denna blandning renas för fotoreceptorprekursorceller. CD73 har beskrivits som den första cellytan markör specifik för unga fotoreceptorer i näthinnan8-10. Här demonstrerar vi en photoreceptor prekursor cell rening metod baserat på denna cell yta markör och med användning av den magnetiskt associerade cell sortering (MACS) tekniken. MACS kan ha fördelar jämfört med fluorescerande aktiverade cellsorteringstekniker, på grund av snabba sorteringstider och enklare justering av GMP-förhållanden. Vi kunde visa en ~ 90% berikning och en upp till 3-faldig högre integrationshastighet vid transplantation av den berikade befolkningen till subretinalutrymmet i vuxna vilda näthinner. Således är MACS-baserade photoreceptor föregångare cellberikning och subretinal transplantation, tillförlitliga och lovande tekniker för utveckling av en regenerativ terapeutisk strategi för behandling av retinal degeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt bruk och vård av djur uttalande:
Alla djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med EUROPEISKA unionens och Tysklands lagar (Tierschutzgesetz) och följde ARVO:s uttalande om användning av djur i oftalmisk forskning och visionsforskning. Alla djurförsök godkändes av TU Dresdens och Landesdirektion Dresdens djuretiska kommitté (godkännandenummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Innan celldisociation och cellsortering påbörjas
- Etikett tre 15 ml reaktionsrör med: Tvätta (W), Positiv fraktion (+) och Negativ fraktion (-).
2. Retina Dissociation
- Halshugg PN 4-valparna med en sax.
- Skölj valparna i huvudet inom kort i 70% etanol följt av tvättning i PBS.
- Överför huvudet till kall HBSS och enucleate ögat (upprepa detta steg för alla huvuden). För att enucleate, öppna ögonlocken och fixera ögat med böjda tångar vid optiknerven. Dra sedan försiktigt ut ögat ur omloppsbanan.
- Efter att ha lockat alla ögon, isolera näthinnan: introducera en sluten sax i synnerven och öppna bladen. Peal RPE/chorid ut. Ta bort linserna och blodkärlen med böjda tångar.
- Överför de isolerade näthinnan till ett 1,5 ml reaktionsrör som innehåller papainlösningen (tillhandahålls av papain dissociation kit).
- Inkubera näthinnan i papainlösningen i 30-60 min i ett vattenbad eller en skakapparat (400 varv/min) vid 37 °C.
- Medan näthinnein inkuberar i papainlösningen, pipett 1 ml ovomucoid lösning på ett 15 ml reaktionsrör (etikett "1").
- Tillsätt 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl äggobasoidlösning (tillhandahålls av satsen) + 520 μl EBSS till ett 15 ml reaktionsrör (etikett "2").
- Efter papain inkubation, överför papainlösningen som innehåller de delvis smälta näthinnan till reaktionsröret "2".
- Använd en brandpolerad pipett, utför mekanisk dissociation (10x upp och ner).
- Pipett enkelcellig suspension till reaktionsrör "1". Försök att generera 2 lager genom att försiktigt lägga cellupphängningen ovanpå äggoomucoidlösningen.
- Centrifugera i 5 min vid 300 x g (cirka 1 300 varv/min).
- Kassera supernaten och återanvänd cellerna i 500 μl MACS-buffert.
3. Cellsortering med magnetisk tillhörande cellsortering (MACS)
- Tillsätt X μl råtta anti-CD73-antikroppar till 500 μl för att uppnå en slutlig koncentration på 10 μg/ml.
- Inkubera 5 min på is.
- Fyll reaktionsröret på 15 ml till 10 ml med MACS-buffert och centrifugera det i 5 minuter med en hastighet av 300 x g.
- Ta bort supernaten.
- Återanvänd pelleten i 480 μl MACS-buffert och tillsätt 120 μl getantiråtta IgG-mikrober.
- Inkubera 15 min på is; agitera inte, skaka eller blanda det.
- Fyll reaktionsröret på 15 ml till 5 ml med MACS-buffert och centrifugera det i 5 minuter vid 300 x g.
- Eftersom reaktionsröret är centrifugerad:
- Justera en LS-kolumn i magnetstativet.
- Placera förförstredelsefiltret ovanpå LS-kolumnen.
- Hydrera förförstubskningsfiltret och LS-kolonnen med 3 ml MACS-buffert och samla MACS-bufferten i tvättröret (W).
- Ta bort supernaten.
- Återanvänd pelleten i 500 μl MACS-buffert.
- Ladda 500 μl cellfjädringen i filtret, tillsätt sedan 1 ml MACS-buffert till filtret och samla in den negativa fraktionen i det negativa fraktionen (-) reaktionsröret.
- Lägg sedan till 3 x 3 ml MACS-buffert i kolumnen för att tvätta bort celler som inte är bundna till kolumnen
- När dessa 9 ml är genom LS-kolonnen, ta bort kolonnen från magnetstativet och installera den ovanpå det positiva fraktionen (+) reaktionsröret.
- Ladda snabbt in 5 ml MACS-buffert i LS-kolumnen och lägg kolven i LS-kolumnen och tryck ner den tills hela bufferten är genom kolumnen.
- Centrifugera reaktionsröret som innehåller den positiva fraktionen i 5 min vid 300 x g.
- Ta bort supernatanten, återanvänd i 500 μl MACS-buffert och håll vid 4 °C.
- Räkna den totala mängden celler med hjälp av en gemensam cellräkningsenhet.
- Förbered en cellupphängning från den positiva sorterade fraktionen som innehåller 2 x 105 celler/μl i MACS-buffert och förvara vid 4 °C
4. Transplantation av MAC-sorterade fotoreceptorprekursorceller i musretin
- Se till att ha alla följande lösningar klara: 1 ml steril PBS eller HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steril avjoniserad H2O, alikvoter av cellfjädringsfraktionerna vid 4 °C.
- Söv den vuxnamusen (dvs. 2-4 månader gammal) med en intraperitoneal injektion av medetomidinhydroklorid (0,01 mg/10 g kroppsvikt), ketamin (0, 75 mg/10 g kroppsvikt). Gör sedan en subkutan injektion av Buprenorfin (0,05 mg/kg kroppsvikt) för smärtlindring.
- Vidga elever med en droppe fenylefrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fixera musen i mushuvudhållaren och placera den under stereomikroskopet.
- Applicera en droppe visidisk gel för att förhindra torkning av ögat.
- Gör ett litet hål vid gränsen mellan sclera respektive hornhinnan (ora serrata)med en steril 30 G 1/2 i nål.
- Skär en gemensam täckbild i små (ca 5 mm x 5 mm) bitar med en diamantpenna, placera en av dessa bitar ovanpå hornhinnan, vilket möjliggör direkt visualisering av näthinnan.
- Spola den presteriliserade mikrolitersprutan flera gånger med avjoniserat vatten.
- Ladda mikrolitersprutan med 1 μl cellfjädring, direkt nål tangentiellt genom bindhinnan och skleran och placera under visuell kontroll i näthinnans nasala halva.
- Slå försiktigt ett hål i näthinnan tills du når det subretinala utrymmet, injicera cellupphängningen i det subretinala utrymmet.
- Observera den bullous avlossningen av näthinnan, som ska vara enhetlig, som täcker cirka 1/4 av näthinnans utrymme utan blödning.
- Dra försiktigt tillbaka sprutan, näthinnehålet tätas automatiskt.
- Spola mikrolitersprutan flera gånger med avjoniserat vatten.
- Släpp musen från huvudhållaren.
- Vakna musen genom att injicera atipamozolehydroklorid för återföring av medetomidinhydroklorideffekten.
- Placera musen för väckningstid i varm mörk kammare (ca 25 °C).
- De följande 2 dagarna efter transplantationen ska Buprenorfin (0, 05 mg/kg kroppsvikt) administreras genom subkutan injektion på morgonen och på eftermiddagen för smärtlindring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma förmågan hos stångfotoreceptorer att integreras i mus näthinnan användes en musreporterlinje, där GFP drivs av neurala näthinnan leucin dragkedja (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl är den tidigaste markören för stavfotoreceptorer som börjar sitt uttryck på E12.5 under hela vuxenlivet, vilket möjliggör en specifik märkning av donatorstångsfotoreceptorceller.
PN 4 Nrl-GFP valpar halshöggs och ögonen var enucleated. Näthinnorna isolerades och dissocierades sedan med hjälp av den metod som beskrivs ovan. Den resulterande cellupphängningen sorterades sedan med CD73-baserade MACS (figurerna 1 och 2). Efter MAC-sortering analyserade vi anrikningen som uppnåtts under denna procedur.
Som visas i figur 3Ainnehöll den ursprungliga cellupphängningen (input) 30,4 % GFP-positiva celler, dvs. stångfotoreceptorer. Efter CD73-baserad MAC-sortering observerades en berikning på upp till 86,9% i den CD73-positiva fraktionen (CD73+) av flödescytometri. I cd73-negativa fraktionen (CD73-) upptäcktes endast 9,9% av alla celler positivt för GFP (figur 3A). Berikningen av Nrl-GFP-positiva celler efter CD73-baserade MACS visualiseras dessutom efter plätering in vitro (Figur 3B).
Efter MAC-sortering snurrades donatorcellerna i den CD73-positiva fraktionen ner och återanvändes till en slutlig koncentration på 200 000 celler/μl. Denna cellupphängning användes vidare för transplantation i det subretinala utrymmet för värdhinnan av vildtyp (figur 4). Tre till fyra veckor efter transplantation, värd näthinnan var fasta, isolerade och sektionerade. Flera donatorceller integrerade i värdarnas yttre nukleära skikt och förvärvade morfologin hos mogna fotoreceptorer med lokalisering av cellkroppen i det yttre kärnskiktet och bildandet av synaptiska sfäruler och inre segment (figur 5). Detaljerade bilder har publicerats tidigare av vår grupp3,8 som visar ett resultat jämförbart med FAC-sorterade celler transplanterade för att vara värd näthinnan av andragrupper 4,6,10. Konsekvent i alla dessa studier är att de transplanterade cellerna stannar på injektionsstället, definierat av den bullous fristående värd näthinnan, och migrerar inte bort. Vissa integreras i värd näthinnan(dvs. yttre kärnskikt), och vissa förblir i det subretinala utrymmet3. Dessutom har det visat sig att fördelningen av givarceller på integrationsplatsen beror på vilken typ av musmodell som används5. Inga akuta värd/transplantat avstötning tecken upptäcktes i transplantationer mellan C57BL/6J möss.
Figur 1. Övergripande system för subretinal transplantation av MACS renad photoreceptor prekursorer i vuxna mus näthinnan. Donatorceller från PN 4 Nrl-GFP valpar isoleras, följt av CD73-baserad MAC-sortering och transplanteras till det subretinala utrymmet för mus värd näthinnorna. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Anrikning av transplanterbara fotoreceptorer av MACS. Cell suspension genereras från alla insamlade PN4 näthinneband inkuberas med primära råtta anti-CD73 antikroppar följt av tvätt och inkubation med antikroppar mot råtta konjugeras med mikrober. Obundna antikroppar tvättas bort. Cellupphängningen passerar genom en LS-kolumn som är ansluten till ett magnetiskt stativ. Celler som är bundna av antikroppar förblir fästa vid kolumnen medan de återstående cellerna elueras och samlas in (CD73-negativ fraktion). Slutligen avlägsnas LS-kolumnen från magnetstativet och de återstående cellerna elueras och samlas in (CD73-positiv fraktion). Klicka här om du vill se hela filmen.
Figur 3. Analys av Nrl-GFP positiv cellberikning efter CD73-baserad MAC-sortering. A)Före sorteringen innehöll den ursprungliga populationen av donatorceller 30,4 % av nrl-GFP-positiva celler. Efter MAC-sortering kunde en berikning av GFP-positiva celler detekteras i CD73+ fraktionen (86,9%) medan CD73-fraktionen endast innehöll låga mängder GFP+-celler (9,9 %). B)Representativ bild som visar resultatet av CD73-baserad MAC-sortering av PN4 Nrl-GFP-celler. 1 miljon celler från varje fraktion pläterades på lamininbelagda täcken. Cellerna var fasta 4 timmar efter plätering med 4% PFA i 10 min. Cellerna var färgade med DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole, 1:20,000). En betydande berikning av GFP-positiva celler i CD73 + fraktionen observerades jämfört med ingångsfraktionen eller CD73- fraktionen. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Subretinal injektion. Schematisk ritning av transplantationsprocessen i den vuxna mus näthinnan. Nålen sätts in genom ett hål i ora serrata,navigeras genom det viteriska utrymmet genom att undvika att röra linsen och placeras vid näthinnan under visuell kontroll. Genom skonsam pressning stansas nålen genom näthinnan och placeras i det subretinala utrymmet. Så småningom injiceras cellupphängningen noggrant under visuell kontroll genom att utvärdera lösgöringsprocessen.
Figur 5. Integration av transplanterade fotoreceptorceller. Representativ bild som visar integrerade CD73-baserade MACS sorterade PN4 Nrl-GFP celler efter transplantation i den vuxna mus näthinnan. Transplanterade photoreceptor prekursorer integreras korrekt i det yttre kärnskiktet (ONL) och generera mogna photoreceptor morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal transplantation av photoreceptor prekursor celler representerar ett tillförlitligt verktyg för att uppnå integration av dessa ljuskänsliga celler i värd näthinnan i betydande antal1,2. Detta kan göra det möjligt att inrätta en cellterapi för behandling av retinal degenerativa sjukdomar i framtiden6. Donatorpopulationen av celler, för närvarande isolerad från PN 4 näthinnan, är en blandning av olika celltyper, från vilken endast photoreceptor prekursorceller integreras efter subretinal injektion. Genom att använda CD73-baserad MAC-sortering kan andelen fotoreceptorer inom donatorcellsupphängningen ökas till ≈ 90% vilket möjliggör en cirka 3-faldig högre integrationshastighet i värdhinnan av vildtyp jämfört med den osorterade cellpopulationen8. I jämförelse med flödescytometri har MACS fördelen av ett snabbt sorteringsförfarande och att det kan vara relativt enkelt att tillämpa på GMP-standarder. Rening av transplanterbara fotoreceptorer är av särskilt intresse mot bakgrund av de senaste fördelarna för in vitro-generationen av fotoreceptorer från pluripotenta stamceller12-14. Kulturer av differentierade pluripotenta stamceller består av olika celltyper som gör tillgången till specifika sorteringsförfaranden till en nödvändig förutsättning för deras framtida användning i celltransplantationsterapier.
Enligt MACS-reningsproceduren är flera punkter anmärkningsvärda, vilket säkerställer ett arbetsflöde utan större störningar. Ju högre antalet näthinner som ska sorteras, desto mer tid behövs för matsmältningen. Efter matsmältningen, under sorteringsproceduren, måste aggregering av celler undvikas. Detta sker företrädesvis före tillsats av den sekundära antikroppen och under inkubationen. I detta fall måste aggregatet avlägsnas omedelbart med en pipett. Under eluering av MACS-buffert medan du samlar in den MACS-negativa fraktionen är det absolut nödvändigt att inte lägga till mer än 3 ml till kolumnen. Trycket från bufferten till kolonnen blir för högt om mer buffert än 3 ml tillsätts. Detta stör antikroppens bindning till cellerna och sänker sorteringseffektiviteten. När du tar bort kolumnen från magnetstativet för att börja samla den MACS-positiva fraktionen måste det här steget göras snabbt. 5 ml MACS-buffert bör tillsättas i kolumnen så snabbt som möjligt. Dessutom ska dyket sättas och tryckas snabbt tills hela bufferten är genom kolumnen. Det är inte nödvändigt att oroa sig för det applicerade trycket. MACS-bufferten är isoton och kan varieras. Det är möjligt att använda FACS-buffert, cellkulturmedium, PBS, EBSS eller HBSS. Buffertens sterilitet kan uppnås genom filtrering genom ett filtermembran på 0,4 μm.
Efter berikning av MACS, en framgångsrik transplantation av donatorceller till subretinal utrymmet kan uppnås genom att hålla följande punkter i åtanke. Eftersom fotoreceptorceller verkar vara mycket känsliga för behandling ex vivo, är det inte tillrådligt att hålla dem på 4 °C längre än nödvändigt. Fortsätt för transplantation så fort som möjligt. När injektionsnålen sätts in i ögongloben är det viktigt att undvika att vidröra linsen eftersom den relativt vassa metallnålen kan skada linsen vilket resulterar i induktion av linsinducerad druvhinneinflammation. Det sista steget på vägen till subretinalutrymmet, näthinnans penetration, är avgörande. Eftersom det inte visuellt kan observera om det subretinala utrymmet uppnås är det viktigt att utveckla en känsla för rätt tryck och vävnadsresistens. För att testa, om nålhuvudet är korrekt placerat, kan en liten volym appliceras och avlossningen av näthinnan vid nålhuvudet noggrant observeras. Om en rund, bullous avlossning utan blödning bildas, är positionen korrekt och resten av lösningen kan appliceras noggrant. Under injektionen ska nålen förbli i sitt läge för att undvika ytterligare skador på vävnaden. Näthinnans hål som skapas av injektionsnålen förseglas av sig själv om nålen dras långsamt tillbaka. Hela proceduren bör göras på minimal tid för att undvika ytterligare stress och skador på djuret. Under transplantation tenderar cellupphängningen att klumpa ihop sig och blockera mikrolitersprutan. Om detta händer föreslås en utspädning av cellupphängningen med steril PBS eller HBSS. En annan möjlighet att övervinna detta problem är att lägga till 1 μl DNAse I till cellupphängningen, för att lösa UPP DNA-klumpar från döda celler, som tenderar att limma levande celler tillsammans.
Detta protokoll är begränsat till magnetisk sortering av celler. Därför kan cellerna sorteras för endast en markör per sorteringsrunda. I jämförelse med flödescytometri, där celler kan sorteras med olika markörer (inklusive fysiologiska egenskaper samt olika cellytans markörer) samtidigt, är detta en stor nackdel med denna teknik. När sorteringen för olika markörer på kort tid behövs kan flödescytometri vara den bättre lösningen. Sortering för fluorescerande egenskaper hos celler, som transgeniskt uttrycktA GFP eller andra livscellsmarkörer är inte heller möjlig med denna teknik. Det är för närvarande begränsat till användning av cellytans antikroppar som kan konjugeras med magnetiska pärlor. Denna teknik skulle dock kunna skalas upp baserat på den tekniska utrustning som används.
Eftersom Miltenyi Biotec för närvarande är den enda leverantören av magnetiska cellsorteringsverktyg finns det inget alternativ tillgängligt hittills. För celldisociation kan andra enzymer än papain(dvs. trypsin) användas. Observera att vårt labb uppnådde de bästa resultaten med papain, eftersom detta verkar vara det mest milda dissociationsenzymet i våra händer. Tidsfönstret för papain matsmältning (30-60 min) är variabel. Under denna tid fönster uppnåddes optimal matsmältning i vårt labb. Kortare eller längre inkubationstid kan vara nödvändig beroende på provstorlek, provkvalitet och enzym som används. Individuell testning föreslås.
Med tanke på att macs i ett steg inte når renhetsnivåer så höga som flödescytometri, kan en eventuell ytterligare tillämpning av denna teknik vara negativ sortering av oönskade och potentiella skadliga celler. Där kan cellfraktionen positiv för en viss cellytamarkör men inte av intresse sorteras ut, vilket gör att bråkdelen av intresset isoleras i flödet igenom. Detta kan göras i förväg eller efter ett positivt sorteringssteg och möjliggör ytterligare diskriminering av celler med hjälp av olika cellytans markörer samt avlägsnande av oönskade celler, som matarskiktsceller eller odifferentierade celler från pluripotenta stamcellskulturer med sin potentiella tumörgena risk. Därför kan MACS vara lämpligt för rening av fotoreceptorer från ES- eller iPS-cellkulturer i möjliga framtida terapeutiska tillämpningar eftersom det representerar en mild, snabb och enkel behandling för rening av stora mängder odlade celler. MACS kan enkelt tillämpas på GMP-förhållanden eftersom detaljerna i sorteringssteg, dvs. mekanik, vätskor och procedurer reduceras jämfört med flödescytometri. Det är anmärkningsvärt att MACS redan rutinmässigt används i kliniska prövningar för berikning av celler från blod eller benmärg. Intressant nog kan MACS till och med appliceras på celler när det inte finns någon lämplig cellytamarkör, genom att genetiskt införa en ytmarkör för att göra cellerna "kompetenta" för efterföljande magnetisk cellsortering steg15.
Sammanfattningsvis representerar MACS ett pålitligt och snabbt verktyg för att berika photoreceptor prekursorceller med hjälp av cellytan markörer för transplantation studier. Dessutom är det en lättanvändbar metod för framtida kliniska applikationer som kräver GMP-villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Anand Swaroop för att ha tillhandahållit Nrl-GFP-möss, Jochen Haas för teknisk support och Sindy Böhme och Emely Lessmann för djurhållning.
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, CRTD Seed Grant Program, SFB 655 och ProRetina e.V. digs-BB Graduate Program Dresden och Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
