Summary
El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.
Abstract
La deficiencia visual y la ceguera debidas a la pérdida de las células sensoras de luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representan la principal razón de discapacidad en los países industrializados. El reemplazo de fotorreceptores degenerados por el trasplante de la célula representa una opción posible del tratamiento en usos clínicos futuros. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduros, aislados de la retina neonatal del ratón en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrarse en la retina adulta del ratón después del trasplante subretinal. Las células dispensadoras de aceite generaron una morfología madura del fotorreceptor incluyendo segmentos internos y externos, un cuerpo de la célula redonda situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticos en gran proximidad a las células bipolares endógenas. De hecho, informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes se integran funcionalmente en los circuitos neuronales de los ratones huésped. Para un uso clínico futuro de tal acercamiento del reemplazo de la célula, las suspensiones purificadas de las células de la opción tienen que ser generadas y ser colocadas en la posición correcta para la integración apropiada en el ojo. Para el enriquecimiento de los precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética de las células donantes. Aquí mostramos la clasificación de células asociadas magnéticas (MACS) - enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla trasplantables aislados de la retina neonatal de ratones reporteros específicos de fotorreceptores basados en el marcador de superficie celular CD73. La incubación con los anticuerpos anti-CD73 seguidos por los anticuerpos secundarios conjugados micro-grano permitió el enriquecimiento de los precursores del fotorreceptor de la barra por los MACS al aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, macs tiene la ventaja de que puede ser más fácil de aplicar a los estándares GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en períodos de tiempo relativamente cortos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretinal de ratones adultos de tipo salvaje resultó en una tasa de integración 3 veces mayor en comparación con las suspensiones celulares no clasificadas.
Introduction
La visión es uno de los principales sentidos de los seres humanos. El deterioro de este sentido y la ceguera son una de las principales razones de la discapacidad en los países industrializados. La causa predominante para la debilitación de la visión o la ceguera es la degeneración retiniana, caracterizada por la pérdida de la célula del fotorreceptor, pues puede ser observada en la degeneración macular, el pigmentosa de la retinitis, la distrofia de la cono-barra, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportaron, independientes entre sí, un trasplante exitoso de células precursoras de fotorreceptores de varilla en retinas adultas de ratones de tipo salvaje1,2. Así, surge la posibilidad de trasplante de células precursoras de fotorreceptores también en una retina degenerada, para reemplazar los fotorreceptores degenerados y restaurar la visión. De hecho, se ha demostrado recientemente, que tales células precursoras de fotorreceptores trasplantados provocan criterios morfológicos de fotorreceptores maduros de tipo salvaje, como segmentos externos correctamente desarrollados3,terminales sinápticos en estrecha proximidad a las células bipolares endógenas y un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa2-4,así como la capacidad de integrarse funcionalmente en los circuitos neuronales del huésped5-7. Uno de los principios fundamentales de esta estrategia es el uso de retinas de ratones jóvenes postnatales de día 4 (PN 4, PN0 se define como día de nacimiento), lo que resulta en una mezcla de diferentes tipos de células para trasplante. En el fondo de una futura aplicación terapéutica, esta mezcla tiene que ser purificada para las células precursoras de fotorreceptores. CD73 se ha descrito como el primer marcador de superficie celular específico para fotorreceptores jóvenes en la retina8-10. Aquí, se demuestra un método de purificación de células precursoras de fotorreceptores basado en este marcador de superficie celular y con el uso de la técnica de clasificación de células asociadas magnéticamente (MACS). Macs podría tener ventajas en comparación con las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescentes, debido a los tiempos de clasificación rápidos y el ajuste más fácil a las condiciones GMP. Podríamos demostrar un enriquecimiento del ~90% y un índice más alto de la integración del hasta 3 dobleces al trasplantar la población enriquecida al espacio subretinal en el salvaje-tipo adulto retinas. Así, el enriquecimiento macs-basado de la célula del precursor del fotorreceptor y el trasplante subretinal, son técnicas confiables y prometedoras para el desarrollo de una estrategia terapéutica regenerativa para el tratamiento de la degeneración retiniana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de uso ético y cuidado de los animales:
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las leyes de la Unión Europea y Alemania (Tierschutzgesetz) y se adhirieron a la Declaración arvo para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la TU Dresden y la Landesdirektion Dresden (número de aprobación: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar la disociación de celdas y la clasificación de celdas
- Etiquete tres tubos de reacción de 15 ml con: Lavado (W), Fracción positiva (+) y Fracción negativa (-).
2. Disociación de la retina
- Decapitar los cachorros PN 4 usando una tijera.
- Enjuague la cabeza de las crías en breve en etanol al 70% seguido de lavado en PBS.
- Transfiera la cabeza a HBSS frío y enuclee el ojo (repita este paso para todas las cabezas). Para enuclear, abra los párpados y fije el ojo con fórceps curvos en la región del nervio óptico. A continuación, tire del ojo con cuidado fuera de la órbita.
- Después de enucleating todos los ojos, aislar la retina: introducir una tijera cerrada en el nervio óptico y abrir las cuchillas. Peal el RPE/chorid hacia fuera. Retire las lentes y los vasos sanguíneos con fórceps curvos.
- Transfiera las retinas aisladas a un tubo de reacción de 1,5 ml que contenga la solución de papaína (proporcionada por el kit de disociación de papaína).
- Incubar las retinas en la solución de papaína durante 30-60 min en un baño de agua o agitadora (400 rpm) a 37 °C.
- Mientras las retinas se incuban en la solución de papaína, pipetear 1 ml de solución ovomucoide a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "1").
- Añadir 60 μl de DNasa I (10 mg/ml) + 60 μl de solución ovomucoide (proporcionada por el kit) + 520 μl de EBSS a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "2").
- Después de la incubación de la papaína, transferir la solución de papaína que contiene las retinas parcialmente digeridas al tubo de reacción "2".
- Utilizando una pipeta pulida contra fuego, realizar la disociación mecánica (10x arriba y abajo).
- Pipetear la suspensión unicelular al tubo de reacción "1". Trate de generar 2 capas colocando suavemente la suspensión celular en la parte superior de la solución ovomucoide.
- Centrífuga durante 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).
- Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 500 μl de buffer MACS.
3. Clasificación de celdas mediante clasificación de celdas asociadas magnéticas (MACS)
- Añadir X μl de anticuerpo anti-CD73 de rata a los 500 μl para lograr una concentración final de 10 μg/ml.
- Incubar 5 min sobre hielo.
- Llene el tubo de reacción de 15 ml a 10 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a una velocidad de 300 x g.
- Retire el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 480 μl macs buffer y añadir 120 μl de cabra anti-rata IgG microperlas.
- Incubar 15 min sobre hielo; no agitarlo, agitarlo ni mezclarlo.
- Llene el tubo de reacción de 15 ml a 5 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a 300 x g.
- Como el tubo de reacción se centrifuga:
- Ajuste una columna LS en el soporte magnético.
- Coloque el filtro de preseparación encima de la columna LS.
- Hidrate el filtro de preseparación y la columna LS con tampón MACS de 3 ml y recoja el tampón MACS en el tubo de lavado (W).
- Retire el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 500 μl macs tampón.
- Cargue la suspensión de celda de 500 μl en el filtro, luego agregue un tampón MACS de 1 ml al filtro y recoja la fracción negativa en el tubo de reacción de fracción negativa (-).
- A continuación, agregue 3 x 3 ml de búfer MACS a la columna para lavar las celdas que no están unidas a la columna
- Una vez que estos 9 ml estén a través de la Columna LS, retire la columna del soporte magnético e instálela encima del tubo de reacción de fracción positiva (+).
- Cargue rápidamente 5 ml de búfer MACS en la columna LS y coloque el émbolo en la columna LS y presione hacia abajo hasta que todo el búfer esté a través de la columna.
- Centrifugar el tubo de reacción que contiene la fracción positiva durante 5 min a 300 x g.
- Retire el sobrenadante, resuspend en 500 μl de tampón MACS y manténgalo a 4 °C.
- Cuente la cantidad total de celdas que utilizan un dispositivo de recuento de celdas común.
- Preparar una suspensión celular a partir de la fracción clasificada positiva que contenga 2 x 105 células/μl en tampón MACS y conservarla a 4 °C
4. Trasplante de células precursoras de fotorreceptores clasificadas por MAC en la retina del ratón
- Asegúrese de tener todas las siguientes soluciones listas: 1 ml de PBS estéril o HBSS, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml de H2O desionizado estéril, alícuotas de las fracciones de suspensión celular a 4 °C.
- Anestesiar el ratón adulto(es decir, 2-4 meses de edad) con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), ketamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Luego haga una inyección subcutánea de buprenorfina (0.05 mg/kg de peso corporal) para aliviar el dolor.
- Dilatar las pupilas con una gota de Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5%.
- Fije el ratón en el soporte de la cabeza del ratón y colótelo bajo microscopio estéreo.
- Aplique una gota de gel visídico para evitar el secado del ojo.
- Hacer un pequeño agujero en el borde entre esclerótica y córnea (respectivamente ora serrata)usando un estéril 30 G 1/2 en aguja.
- Corte un portaobjetos de cubierta común en piezas pequeñas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando una pluma de diamante, coloque una de estas piezas en la parte superior de la córnea, permitiendo la visualización directa de la retina.
- Enjuague la jeringa de microlitro presterilizada varias veces con agua desionizada.
- Cargue la jeringa de microlitro con 1 μl de suspensión celular, dirija la aguja tangencialmente a través de la conjuntiva y la esclerótica y colóquela bajo control visual en la mitad nasal de la retina.
- Perforar suavemente un agujero en la retina hasta llegar al espacio subretinal, inyectar la suspensión celular en el espacio subretinal.
- Observe el desprendimiento bullar de retina, que debe ser uniforme, cubriendo aproximadamente 1/4 del espacio retiniano sin ningún sangrado.
- Retire la jeringa suavemente, el agujero de la retina se sella automáticamente.
- Enjuague la jeringa del microlitro varias veces con agua desionizada.
- Suelte el ratón del soporte de la cabeza.
- Despertar el ratón mediante la inyección de clorhidrato de atipamozol para la reversión del efecto de clorhidrato de medetomidina.
- Coloque el ratón para la hora de despertar en una cámara oscura cálida (aproximadamente 25 °C).
- Los próximos 2 días después del trasplante, la buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) debe administrarse mediante inyección subcutánea por la mañana y por la tarde para aliviar el dolor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores de varilla para integrarse en la retina del ratón, se utilizó una línea de reportero de ratón, en la que la GFP es impulsada por el promotor de la cremallera de leucina de la retina neural (Nrl, Nrl-GFP)11. Nrl es el marcador más temprano de fotorreceptores de varilla que comienza su expresión en E12.5 a lo largo de la edad adulta, lo que permite un etiquetado específico de las células fotorreceptoras de varilla donante.
Los cachorros de PN 4 Nrl-GFP fueron decapitados y los ojos enucleated. Las retinas entonces fueron aisladas y disociadas usando el método descrito arriba. La suspensión celular resultante se ordenó utilizando MACS basados en CD73 (Figuras 1 y 2). Después de la clasificación mac, se analizó el enriquecimiento logrado durante este procedimiento.
Como se muestra en la Figura 3A,la suspensión celular inicial (Input) contenía células positivas para GFP al 30,4%, es decir. fotorreceptores de varilla. Después de la MAC-clasificación de CD73-based, un enriquecimiento de hasta 86,9% en la fracción de CD73-positive (CD73+) fue observado por cytometry de flujo. En la fracción CD73 negativa (CD73-) sólo el 9,9% de todas las células fueron detectadas positivamente para GFP(Figura 3A). El enriquecimiento de las células positivas de Nrl-GFP después de MACS basados en CD73 se visualiza adicionalmente después del revestimiento in vitro (Figura 3B).
Después de la clasificación MAC, las células donantes en la fracción CD73-positiva se giraron hacia abajo y se resuspendieron a una concentración final de 200.000 células/μl. Esta suspensión celular se utilizó además para el trasplante en el espacio subretinal de las retinas huésped de tipo salvaje (Figura 4). Tres a cuatro semanas que seguían el trasplante, las retinas del anfitrión fueron fijadas, aisladas y seccionados. Varias células donantes se integraron en la capa nuclear externa de los huéspedes y adquirieron la morfología de fotorreceptores maduros con localización del cuerpo celular en la capa nuclear externa y formación de esferulas sinápticas y segmentos internos(Figura 5). Las imágenes detalladas han sido publicadas anteriormente por nuestro grupo3,8 mostrando un resultado comparable con las células clasificadas por FAC trasplantadas a las retinas del huésped por otros grupos4,6,10. Consistente en todos estos estudios es, que las células trasplantadas permanecen en el sitio de la inyección, definido por la retina del huésped desprendido bullar, y no migran lejos. Algunos se integran en la retina del huésped(es decir, la capa nuclear externa), y algunos permanecen en el espacio subretiniano3. Además, se ha demostrado, que la distribución de las células donantes en el sitio de integración depende del tipo de modelo de ratón utilizado5. No se detectó ningunas muestras agudas del rechazo del anfitrión/del injerto en trasplantes entre los ratones de C57BL/6J.
Figura 1. Esquema total del trasplante subretinal de los precursores purificados MACS del fotorreceptor en retina adulta del ratón. Las células dispensadoras de aceite de los cachorros de PN 4 Nrl-GFP se aíslan, seguidos por CD73-based MAC-clasificación y trasplantados en el espacio subretinal de las retinas del anfitrión del ratón. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 2. Enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables por MACS. La suspensión celular generada a partir de todas las retinas PN4 recogidas se incuba con anticuerpos primarios anti-CD73 de rata seguidos de lavado e incubación con anticuerpos anti-rata conjugados con microperlas. Los anticuerpos no unidos se eliminan. La suspensión de la célula se pasa a través de una LS-columna que está conectada con un soporte magnético. Las células que están unidas por anticuerpos permanecen unidas a la columna mientras que las células restantes se eluden y se recogen (fracción CD73 negativa). Finalmente, la columna LS se retira del soporte magnético y las células restantes se eluden y se recogen (fracción CD73 positiva). Haga clic aquí para ver la película completa.
Figura 3. Análisis del enriquecimiento celular positivo de Nrl-GFP después de la CLASIFICACIÓN MAC basada en CD73. (A)Antes de clasificar, la población inicial de células donantes contenía el 30,4% de las células positivas de Nrl-GFP. Después de mac-clasificación, un enriquecimiento de células GFP-positivas se podía detectar en la fracción de CD73+ (86,9%) mientras que la fracción CD73- contenía sólo cantidades bajas de células GFP+ (9,9%). (B)Imagen representativa que demuestra el resultado de la clasificación MAC basada en CD73 de las células PN4 Nrl-GFP. 1 millón de células de cada fracción fueron plateadas en los coverslips laminin-revestidos. Las células fueron fijadas 4 horas después de la galjanoplastia con el 4% PFA por el minuto 10. Las células fueron manchadas con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 1:20.000). Un enriquecimiento significativo de células GFP-positivas en la fracción de CD73+ fue observado cuando estaba comparado a la fracción de entrada o a la fracción de CD73-. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 4. Inyección subretinal. Dibujo esquemático del proceso del trasplante en la retina adulta del ratón. La aguja se inserta a través de un agujero en la ora serrata,se navega por el espacio vitrial evitando tocar la lente y se coloca en la retina bajo control visual. Al empujar suavemente, la aguja se perfora a través de la retina y se coloca en el espacio subretiniano. Eventualmente, la suspensión celular se inyecta cuidadosamente bajo control visual mediante la evaluación del proceso de desprendimiento.
Figura 5. Integración de células fotorreceptoras trasplantadas. Imagen representativa que representa las células PN4 Nrl-GFP integradas de MACS basadas en CD73-based después del trasplante en la retina adulta del ratón. Los precursores de fotorreceptores trasplantados se integran correctamente en la capa nuclear externa (ONL) y generan morfología de fotorreceptores maduros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas del huésped en números significativos1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro6. La población donante de células, actualmente aislada de las retinas PN 4, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células precursoras del fotorreceptor se integran después de la inyección subretiniana. Mediante el uso de la clasificación MAC basada en CD73, la proporción de fotorreceptores dentro de la suspensión de células donantes puede aumentarse a ≈ 90% que permite una tasa de integración aproximadamente 3 veces mayor en las retinas del huésped de tipo salvaje en comparación con la población celular no clasificada8. En comparación con la citometría de flujo, MACS tiene la ventaja de un procedimiento de clasificación rápida y que puede ser relativamente fácil de aplicar a los estándares GMP. La purificación de fotorreceptores trasplantables es de interés específico a la luz de las recientes ventajas para la generación in vitro de fotorreceptores a partir de células madre pluripotentes12-14. Los cultivos de células madre pluripotentes diferenciadas se componen de diversos tipos de células, lo que hace que la disponibilidad de procedimientos de clasificación específicos sea un requisito previo esencial para su uso futuro en terapias de trasplante de células.
De acuerdo con el procedimiento de purificación MACS, varios puntos son dignos de mención, lo que garantiza un flujo de trabajo sin mayores perturbaciones. Cuanto mayor sea el número de retinas a clasificar, más tiempo se necesita para su digestión. Después de la digestión, durante el procedimiento de clasificación, se debe evitar la agregación de células. Esto ocurre preferiblemente antes de la adición del anticuerpo secundario y durante su incubación. En este caso, el agregado tiene que ser removido inmediatamente con una pipeta. Durante la elución del buffer MACS mientras se recoge la fracción MACS-negativa, es absolutamente necesario no añadir más de 3 ml a la columna. La presión del tampón sobre la columna será demasiado alta si se añade más de 3 ml. Esto perturbará la unión del anticuerpo a las células y reduce la eficiencia de clasificación. Al retirar la columna del soporte magnético para comenzar a recoger la fracción MACS-positiva, este paso tiene que hacerse rápidamente. Los 5 ml de búfer MACS deben añadirse a la columna lo más rápido posible. Además, la inmersión debe colocarse y presionarse rápidamente hasta que todo el búfer esté a través de la columna. No es necesario preocuparse por la presión aplicada. El buffer MACS es isotónico y puede ser variado. Es posible utilizar buffer FACS, medio de cultivo celular, PBS, EBSS o HBSS. La esterilidad del tampón se puede lograr filtrando a través de una membrana de filtro de 0,4 μm.
Después del enriquecimiento por macs, un trasplante acertado de células dispensadoras de aceite al espacio subretinal se puede alcanzar teniendo presentes los puntos siguientes. Dado que las células fotorreceptoras parecen ser muy sensibles al tratamiento ex vivo, no es aconsejable mantenerlas en 4 °C más de lo necesario. Proceda al trasplante lo más rápido posible. Al insertar la aguja de inyección en el globo ocular, es importante evitar tocar la lente, ya que la aguja de metal relativamente afilada podría dañar la lente, lo que resulta en la inducción de la uveítis inducida por la lente. El último paso en el camino hacia el espacio subretiniano, la penetración de la retina, es crucial. Puesto que no puede observar visualmente si el espacio subretinal está alcanzado es importante desarrollar una sensación para la presión de empuje correcta y la resistencia del tejido. Para probar, si la cabeza de la aguja se coloca correctamente, se podría aplicar un pequeño volumen y el desprendimiento de la retina en la cabeza de la aguja debe observarse cuidadosamente. Si se está formando un desprendimiento redondo y bullar sin sangrado, la posición es correcta y el resto de la solución se puede aplicar con cuidado. Durante la inyección, la aguja debe permanecer en su posición para evitar un mayor daño al tejido. El orificio retiniano creado por la aguja de inyección se sellará por sí mismo si la aguja se retrae lentamente. Todo el procedimiento debe realizarse en el mínimo tiempo posible para evitar más estrés y daño al animal. Durante el trasplante, la suspensión celular tiende a agrupar y bloquear la jeringa de microlitro. Si esto sucede, se sugiere una dilución de la suspensión celular usando PBS estéril o HBSS. Otra posibilidad para superar este problema es añadir 1 μl de DNAse I a la suspensión celular, para disolver los grupos de ADN de las células muertas, que tienden a pegar las células vivas entre sí.
Este protocolo se limita a la clasificación magnética de las células. Por lo tanto, las celdas se pueden ordenar para un solo marcador por ronda de ordenación. En comparación con la citometría de flujo, donde las células podrían clasificarse utilizando diferentes marcadores (incluyendo propiedades fisiológicas, así como diferentes marcadores de superficie celular) al mismo tiempo, esta es una desventaja importante de esta técnica. Siempre que se necesite la clasificación de diferentes marcadores en una ventana de tiempo corta, la citometría de flujo podría ser la mejor solución. También, la clasificación para las propiedades fluorescentes de células, como GFP transgenically expresado u otros marcadores de la célula de la vida no es posible con esta técnica. Actualmente está restringido al uso de anticuerpos de la superficie celular que se pueden conjugar con perlas magnéticas. No obstante, esta técnica podría ampliarse en función del equipo técnico utilizado.
Dado que Miltenyi Biotec es actualmente el único proveedor de herramientas de clasificación de células magnéticas, no hay ninguna alternativa disponible hasta la fecha. Para la disociación celular, se podrían utilizar otras enzimas distintas de la papaína(es decir, tripsina). Cabe destacar que nuestro laboratorio logró los mejores resultados con papaína, ya que esta parece ser la enzima de disociación más suave en nuestras manos. La ventana de tiempo de la digestión de la papaína (30-60 min) es variable. En esta ventana de tiempo se logró una digestión óptima en nuestro laboratorio. Puede ser necesario un tiempo de incubación más corto o más largo dependiendo del tamaño de la muestra, la calidad de la muestra y la enzima utilizada. Se sugieren pruebas individuales.
Dado que el MACS de un solo paso no alcanza niveles de pureza tan altos como la citometría de flujo, una posible aplicación adicional de esta técnica podría ser la clasificación negativa de células dañinas no deseadas y potenciales. Allí, la fracción de celda positiva para un marcador de superficie de celda dado pero no de interés se puede resolver, dejando la fracción de interés aislada en el flujo a través. Esto podría hacerse por adelantado o después de un paso de clasificación positivo y permite una mayor discriminación de las células que utilizan diferentes marcadores de superficie celular, así como la eliminación de células no deseadas, como las células de la capa alimentadora o las células indiferenciadas de cultivos de células madre pluripotentes con su riesgo tumorogénico potencial. Por lo tanto, el MACS podría ser adecuado para la purificación de fotorreceptores de cultivos celulares DE ES o iPS en posibles aplicaciones terapéuticas futuras, ya que representa un tratamiento suave, rápido y simple para la purificación de altas cantidades de células cultivadas. Macs podría aplicarse fácilmente a las condiciones GMP ya que los detalles de los pasos de clasificación, es decir, la mecánica, los fluidos y los procedimientos se reducen en comparación con la citometría de flujo. Cabe destacar, que macs ya se utiliza rutinariamente en ensayos clínicos para el enriquecimiento de las células de la sangre o la médula ósea. Curiosamente, el MACS puede incluso aplicarse en células cuando no hay un marcador de superficie celular adecuado, introduciendo genéticamente un marcador de superficie para que las células sean "competentes" para los pasos posteriores de clasificación de células magnéticas15.
En resumen, macs representa una herramienta fiable y rápida para enriquecer las células precursoras de fotorreceptores utilizando marcadores de superficie celular para estudios de trasplante. Además, es un método fácilmente empleable para futuras aplicaciones clínicas que requieren condiciones GMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Nos gusta agradecer a Anand Swaroop por proporcionar ratones Nrl-GFP, Jochen Haas por soporte técnico y Sindy Böhme y Emely Lessmann por la cría de animales.
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, el CRTD Seed Grant Program, el SFB 655 y el ProRetina e.V. fundación, el DIGS-BB Graduate Program Dresden, y la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
