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Bioengineering

विधि रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मानव कोशिका आधारित, संपर्क माडल की तैयारी के लिए बेहतर

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​के मानव मॉडल की स्थापना बीबीबी की विफलता के साथ जुड़े मस्तिष्क की स्थिति में अनुसंधान लाभ उठा सकते हैं. हम यहाँ एक झरझरा झिल्ली के विपरीत दिशा में मानव astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की coculturing परमिट जो एक संपर्क बीबीबी मॉडल, की तैयारी के लिए एक बेहतर तकनीक का वर्णन.

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​कसकर मस्तिष्क पर्यावरण नियंत्रण जो अभेद्य लेकिन अनुकूलनीय मस्तिष्क केशिकाओं शामिल हैं. बीबीबी की विफलता नैदानिक ​​प्रासंगिक अनुसंधान में सहायता करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल में मानव के विकास के लिए एक बनाने की जरूरत है, कई मस्तिष्क विकृतियों के एटियलजि में निहित किया गया है. इस प्रकार अब तक वर्णित अनेक बीबीबी मॉडल के अलावा, (प्रवाह) के बिना एक स्थिर, astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) एक झरझरा झिल्ली के विपरीत दिशा में cocultured रहे हैं जहां बीबीबी मॉडल, संपर्क, अनुकरण के लिए एक सरल अभी तक प्रामाणिक प्रणाली के रूप में उभरा उच्च throughput प्रदर्शन क्षमता के साथ बीबीबी. फिर भी इस तरह के मॉडल की पीढ़ी कुछ तकनीकी चुनौतियां प्रस्तुत करता. यहाँ, हम प्राथमिक मानव BECs और अमर मानव astrocytes के एक उपन्यास संयोजन का उपयोग एक संपर्क मानव बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विशेष रूप से, हम विस्तार उल्टे सम्मिलित करता है पर सेल बोने के लिए एक अभिनव पद्धति के साथ ही INSER निर्दिष्टटी धुंधला तकनीक और हम बीबीबी से संबंधित अनुसंधान के लिए हमारे मॉडल का उपयोग कैसे उदाहरण देना.

Introduction

बीबीबी परिधीय रक्त परिसंचरण और मस्तिष्क रक्तस्तम्भन के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण जिम्मेदार केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, के बीच एक विशेष इंटरफेस है. यह कार्यात्मक मस्तिष्क में एक तंग और गतिशील प्रवेश द्वार के लिए फार्म (नीचे) कुछ सेलुलर और अकोशिकीय घटकों से प्रभावित हैं जो अलग मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (BECs) शामिल हैं. शारीरिक शर्तों के तहत बीबीबी मस्तिष्क में, रक्त कोशिकाओं, प्लाज्मा उपकरणों और हानिकारक पदार्थ, सभी संभावित न्यूरोटौक्सिक के पारित होने पर प्रतिबंध है. समानांतर में, बीबीबी चुनिंदा ठीक मस्तिष्क वातावरण 1,2 बनाए रखने के लिए मस्तिष्क और रक्त परिसंचरण के बीच मुख्य आयनों और पोषक तत्वों (ग्लूकोज और एमिनो एसिड) और चयापचय अपशिष्ट उत्पादों एक्सचेंजों. हाल के वर्षों में यह बीबीबी की विफलता ऐसे neurodegenerative या सूजन से जुड़ी बीमारियों (जैसे अल्जाइमर रोग और multipl के रूप में पुरानी मस्तिष्क विकृतियों की एक किस्म में पाया जाता है कि स्पष्ट होता जा रहा हैई इस्कीमिक स्ट्रोक 4 की तरह गंभीर स्थिति में है और साथ ही,) क्रमश: 3 काठिन्य.

मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) की अनूठी बीबीबी गुण बड़े पैमाने पर उनके मस्तिष्क के माहौल 5 से प्रेरित है, और विशेष रूप से astrocytes 6,7 से कर रहे हैं. अन्य ऐसी pericytes 8, न्यूरॉन्स और microglia 1,3 के रूप में सेल प्रकार,, साथ ही तहखाने झिल्ली 9, BECs समर्थन और एक कार्यात्मक इकाई "neurovascular यूनिट" (NVU) करार दिया साथ कि फार्म एक बढ़ती समझ नहीं है जो एक साथ जोड़ों उनकी आपूर्ति के केशिकाओं 10 के चयापचय की मांग neuronal.

रोग स्थितियों में बीबीबी की भागीदारी बीबीबी से संबंधित अनुसंधान 11,12 में सहायता करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल में विकसित करने के लिए कई प्रयास underlies. इन मॉडलों NVU सिद्धांत के अनुसार विवो बीबीबी विशेषताओं में संभव के रूप में बंद की नकल करना है. इन विट्रो 13 से, मानव 14, चूहे 15, माउस 16, और सुअर 17,18 मूल) तंग जंक्शन के गठन BECs के monolayer पर एक झरझरा झिल्ली पर सुसंस्कृत एक साथ समर्थन astrocytes के साथ भरोसा बड़े पैमाने पर ) डेली एट अल. 2005 11 से समीक्षा की.

Astrocytes संस्कृति के माध्यम से अभी तक घुलनशील कारकों 16 के माध्यम से BECs के साथ संवाद स्थापित करने से (झिल्ली की ऊपरी सतह पर खेती) BECs से अलग अच्छी तरह से एक टिशू कल्चर के नीचे, पर गैर संपर्क परिस्थितियों में उगाया जा सकता है. बेहतर विवो में बीबीबी की शारीरिक संरचना के समान है, जो और अधिक उन्नत मॉडल में, astrocytes संपर्क शर्तों और सीधे BECs 13,15,17 के करीब निकटता (चित्रा 1) में झिल्ली के विपरीत दिशा में सुसंस्कृत में रखा जाता है. यह विन्यास की स्थापना की, BECs और astrocytes के बीच शारीरिक संपर्क में सक्षम बनाता है जब astrocytes परियोजनाझरझरा झिल्ली के माध्यम से उनकी प्रक्रियाओं. Astrocytic अंत फुट छोटे रोमकूप आकार (यानी 0.4 माइक्रोन) 14,15 के माध्यम से पारित नहीं कर सकते क्योंकि महत्वपूर्ण बात है, के लिए होते हैं एक सच संपर्क के लिए pores, व्यास में 1μm ≥ किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, संपर्क बीबीबी प्रणालियों उनके पार endothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) और विभिन्न tracers 13,17,18 के endothelial पारगम्यता मूल्यों के बारे में उनकी गैर संपर्क समकक्षों से बेहतर कुछ अध्ययनों में प्रदर्शन कर रहे हैं. मीडिया के प्रवाह के लिए एक अतिरिक्त आयाम हाल ही में मस्तिष्क vasculature 12,19 के करीब अनुकरण के लिए अन्तःचूचुक को कतरनी बलों को लागू करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल की एक संख्या में जोड़ा गया है.

एक संपर्क बीबीबी मॉडल पैदा जब काबू पाने के लिए एक तकनीकी बाधा झरझरा झिल्ली के abluminal सतह पर गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ astrocytes के बोने है. Astrocytes बस एक में से शीर्ष पर मीडिया की एक बूंद में वरीयता प्राप्त थे जहाँ पिछले प्रोटोकॉल 13,20,verted डालने की अनुमति, केवल कम बोने बार उचित सेल लगाव के लिए अपर्याप्त होने के लिए हमारे हाथ में पाए गए जो (यानी 10 मिनट 13 या 2 घंटा 20). इस बुनियादी विधि का प्रयोग, एक लंबे समय तक astrocyte लगाव अवधि (तापमान, पीएच और नमी में उतार चढ़ाव के कारण) इनक्यूबेटर के लगातार उद्घाटन द्वारा आवेषण की लगातार निगरानी की आवश्यकता है और, कारण छिद्रों के माध्यम से मीडिया के रिसाव को भी असमान सेल बोने की संभावना है, खासकर 1 माइक्रोन से बड़ा pores कार्यरत रहे हैं.

यहाँ, हम एक संपर्क बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारी प्रक्रिया से ऊपर उल्लेख किया सीमाओं जो पते उल्टे सम्मिलित करता है, पर सेल बोने के लिए एक वैकल्पिक तरीका भी शामिल है. विधि समय की एक विस्तारित अवधि के लिए, एक equilibrated इनक्यूबेटर में, abluminal झिल्ली सतह पर astrocytes की अबाधित पालन परमिट. नतीजतन, astrocytes के एक समान बोने बाधा गुणवत्ता बढ़ जाती है जो हासिल की हैऔर आवेषण के बीच बेसल पारगम्यता विविधताओं को कम करता है.

मानव कोशिकाओं का उपयोग मानव प्रासंगिक अनुसंधान 21 के लिए महत्वपूर्ण है, हम इसके अतिरिक्त इस लेख में प्राथमिक मानव BECs के एक उपन्यास संयोजन की विशिष्ट उपयोग का प्रदर्शन और एक उच्च throughput प्रदर्शन क्षमता के साथ एक संपर्क मानव बीबीबी मॉडल की स्थापना के लिए मानव astrocytes अमर . झरझरा झिल्ली पर कोशिकाओं के देखने झरझरा झिल्ली पर संगम और सेल आकारिकी के निर्धारण में सहायता कर सकते हैं, जो मुश्किल है, हम भी विस्तार धुंधला तकनीक हो सकता है. बीबीबी पर - तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए एकमात्र इलाज के विकल्प के रूप में कार्य करता है जो एक थक्का को ख़त्म एंजाइम - अंत में, हम अपने मानव बीबीबी मॉडल ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक का प्रभाव (टी पीए) की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि कैसे उदाहरण देना.

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Protocol

1. सेल संस्कृति (पिछले बीबीबी सभा को 3-7 दिनों)

1.1. प्राथमिक मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (BECs)

BECs व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया. कोशिकाओं को सामान्य मानव मस्तिष्क प्रांतस्था ऊतक के dispase हदबंदी द्वारा उत्पादित और बीतने 3 (<12 जनसंख्या दोहरीकरण) पर जमे हुए प्रदान किया गया.

  1. बुनियाद: निर्माता के निर्देशों के अनुसार "संलग्नक फैक्टर" के साथ कोट ऊतक संस्कृति वाहिकाओं.
  2. सेल के रखरखाव: सीरम युक्त पूरा मध्यम में BECs बनाए रखें. पूरा सीरम मुक्त माध्यम में प्रयोग, संस्कृति BECs लिए. एक humidified 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने, 37 डिग्री सेल्सियस पर 21% ओ 2 इनक्यूबेटर
    नोट: DMEM/F-12 15 मिमी HEPES, 10% (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक जबकि विशिष्ट अभिकर्मकों के लिए एक विकल्प के रूप में, 0.1% (w / v) जिलेटिन समाधान एक कोटिंग अभिकर्मक के रूप में काम कर सकते हैं, 2 मिमी एल glutamine, 50 ग्राम/ एमएल gentamycin, 20 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन और 20 माइक्रोग्राम / एमएल endothelial कोशिकाओं के विकास को पूरक बीईसी रखरखाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. अगले उपयोग के लिए करना समय (3-7 दिन) के आधार पर, 1:03-01:06 के अनुपात में विभाजित मिला हुआ BECs: प्रयोग के लिए उप संवर्धन. हर 3 दिन रखरखाव मध्यम बदलें. 15 अंश तक BECs ऊपर का प्रयोग करें.

1.2. एसवीजी मानव भ्रूण astroglial सेल लाइन

एसवीजी मानव भ्रूण astroglial कोशिकाओं 22 मूल प्रतिकृति की कमी बंदर का वायरस 40 के साथ बदल मानव भ्रूण के मस्तिष्क के प्राथमिक संस्कृतियों से प्राप्त किए गए.

  1. रखरखाव: 20% (v / v) एफसीएस (उनके पैतृक प्राथमिक कोशिकाओं 22 बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया वही सीरम प्रतिशत), 2 मिमी एल glutamine, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और साथ पूरक अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम में संस्कृति एसवीजी कोशिकाओं 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन. एक humidified 5% सीओ 2, 21% ओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने
  2. अगले उपयोग के लिए करना समय (3-7 दिन) के आधार पर, 1:05-01:10 के अनुपात में विभाजित मिला हुआ SVGs: प्रयोग के लिए उप संवर्धन. Trypsin के हटाने की वजह से मध्यम में सीरम के उच्च सामग्री की आवश्यकता नहीं है. हर 3 दिन मध्यम बदलें. ऊपर से 20 अंश तक SVGs का प्रयोग करें.

2. मानव में इन विट्रो बीबीबी मॉडल के विधानसभा और Coculturing दिवस (0)

टिप्पणी: इन विट्रो संपर्क बीबीबी मॉडल में मानव संशोधनों के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल 13,23 के अनुसार तैयार किया जाता है.

2.1. इंसर्ट की कोटिंग

  1. आपूर्ति 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में ऊतक संस्कृति आवेषण (पॉलिएस्टर झरझरा झिल्ली के साथ व्यास में 6.5 मिमी, 3 माइक्रोन रोमकूप आकार) रखें. आवेषण के कोट luminal सतह रात भर चूहे कोलेजन के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मैं (20 माइक्रोग्राम / 2 सेमी, 132 ग्राम की 50 μl/ मिलीलीटर कोलेजन मिल्ली क्यू पानी में 0.02% एसिटिक एसिड में मैं (MQH ओ 2)). अवशिष्ट एसिड को दूर करने के MQH 2 हे के साथ (abluminal और luminal ओर से दोनों) एक बार सम्मिलित करता धो लें.
    नोट: मस्तिष्क नलिकाओं के तहखाने झिल्ली कोई कोलेजन हैं मैं, लेकिन मुख्य रूप से laminins, कोलेजन प्रकार चतुर्थ isoforms, nidogens, और हेपारन सल्फेट proteoglycans 9. इस कारण से, कुछ शोधकर्ताओं ने ऐसे कोलेजन चतुर्थ, फ़ाइब्रोनेक्टिन 13, या Matrigel एक अधिक प्रामाणिक बीबीबी मॉडलिंग के लिए (बी.डी. बायोसाइंसेज) के रूप में 16 कोटिंग एजेंट का उपयोग.

2.2. Underside (abluminal) झिल्ली सतह पर सीडिंग SVGs

  1. सम्मिलित पलटना और धीरे झरझरा झिल्ली लोचदार सिलिकॉन टयूबिंग के एक छोटे से टुकड़े के रिम के आसपास फिट, अच्छी तरह से abluminal सतह से ऊपर अनिवार्य रूप से एक नया बनाने, ("बाहरी ट्यूबिंग" ~ 10 मिमी लंबे, 8 मिमी आंतरिक व्यास, 1.6 मिमी दीवार) (2A चित्रा).
  2. सम्मिलित nee के नीचेडी एस मीडिया रिसाव से बचने के लिए सील किया जाना है. एक प्लास्टिक की सील शंकु के साथ एक छोर पर सील, सबसे पहले, (चित्रा 2B; ~ 8 मिमी लंबे, 3.2 मिमी आंतरिक व्यास, 1.6 मिमी दीवार "आंतरिक ट्यूबिंग" कहा जाता है) एक सिलिकॉन टयूबिंग से बना एक प्लग (2A चित्रा और 2 बी) को तैयार (~ 3mm लंबे, एक 0.2 मिलीलीटर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब के नीचे काटने से तैयार, चित्रा 2 बी). इस शंकु आंतरिक ट्यूबिंग लुमेन जवानों, लेकिन यह भी डालने में तंग फिटिंग के लिए अपनी धार चौड़ी न केवल. यह झिल्ली से ऊपर से ~ 1-2 मिमी (2A चित्रा) तक पहुँच जाता है जब तक अगला, एक बाँझ संदंश का उपयोग, luminal गुहा और अग्रिम में यह सिलिकॉन प्लग डालें.
  3. अगला, 200 μl एसवीजी रखरखाव मध्यम में 4 एक्स 10 4 एसवीजी कोशिकाओं (बीज एसईction ऊपर 1.2.2) सीधे अच्छी तरह से abluminal झिल्ली सतह से ऊपर सिलिकॉन (2A चित्रा) में. SVGs इनक्यूबेटर में कम से कम 4 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति.
    नोट: बाँझपन दो 6 अच्छी तरह प्लेटें (दूसरे के ऊपर उल्टे एक थाली, चित्रा -2) के बीच में इकट्ठे आवेषण के परिवहन बनाए रखने के लिए प्रक्रिया के दौरान अनफ़िल्टर्ड हवा के लिए जोखिम को कम करने के लिए. सिलिकॉन ट्यूब और प्लग इथेनॉल में धोया और बाद में उपयोग के लिए autoclaved कर रहे हैं.
    नोट: का प्रयोग करें प्लग केवल झिल्ली ताकना साथ आवेषण के लिए (धारा 2.2.2) 1 माइक्रोन से बड़ा आकार. 1 माइक्रोन ≤ ताकना व्यास के साथ झिल्ली शायद ही कभी रिसाव और बाहरी सिलिकॉन टयूबिंग (धारा 2.2.1) का उचित ही आवश्यकता होती है. इसके अलावा, कोलेजन के अलावा अन्य कुछ कोटिंग एजेंट मैं (धारा 2.1 के लिए नोट देखें) भी 3 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से leakiness रोक सकता है. अनुभव से यह निर्धारित करते हैं.
  4. आपके astrocytes के पालन स्थिति की निगरानी करने के लिए आदेश में, में समानांतर में बीजastrocyte सेल निलंबन का एक मानक 96 अच्छी तरह से एक समान मात्रा. यह अच्छी तरह से 6.5 मिमी डालने के रूप में एक ही सतह क्षेत्र (0.33 सेमी 2) है और डालने झिल्ली से चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की आसान दृश्य परमिट. आप नियंत्रण में astrocyte का पर्याप्त पालन निरीक्षण 96 अच्छी तरह से, astrocytes पर्याप्त रूप से सम्मिलित झिल्ली को भी पालन किया है.
  5. Astrocytes पर्याप्त 96 अच्छी तरह से नियंत्रण में पालन किया है, जब (ऊपर देखें नोट) टिशू कल्चर हुड के लिए सम्मिलित विधानसभाओं हस्तांतरण और धीरे बाहरी सिलिकॉन टयूबिंग और प्लग हटा दें. 800 μl / अच्छी तरह से बीईसी रखरखाव मध्यम (ऊपर खंड 1.1.2) युक्त आपूर्ति कुओं में सामान्य (यानी ईमानदार) ओरिएंटेशन में सम्मिलित करता लौटें.

2.3. Astrocytes ऊपर Luminal चैंबर में BECs की सीडिंग

कोलेजन में लिपटे luminal सतह पर 200 μl में और INSE लौटने बीज 2x10 4 BECsइनक्यूबेटर में RTS.

2.4. Coculturing

प्रयोग से पहले मीडिया परिवर्तन के बिना बीईसी मध्यम में 3 दिनों के लिए एसवीजी / बीईसी वरीयता प्राप्त आवेषण coculture.

3. मानव बीबीबी मॉडल के साथ प्रयोग (3 दिन)

  1. क्रमशः 600 μl और सीरम मुक्त BECs माध्यम के 100 μl, साथ abluminal और luminal मीडिया की जगह से इन विट्रो बीबीबी पहले धो कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए.
  2. फिर luminal मध्यम Aspirate और उत्तेजक एजेंटों के साथ सीरम मुक्त माध्यम के 100 μl के साथ बदलें.
    नोट: abluminal चैम्बर की उत्तेजना (astrocytic डिब्बे से इन विट्रो बीबीबी सक्रिय करने के लिए) की आवश्यकता है, तो abluminal मध्यम aspirate और एजेंटों उत्तेजक के साथ सीरम मुक्त माध्यम के 600 उल के साथ बदलें.
  3. Luminal उत्तेजना 3 x 100 μl की आवश्यकता है, जो प्रदर्शन किया है, तो इसलिए (तीन प्रतियों में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह टेस्ट, हम फिर से गिराए करने की अनुशंसा कुओं के बीच pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए समूह प्रति सीरम मुक्त माध्यम के 350 μl) में अपने अंतिम सांद्रता के लिए एजेंट.
  4. पहले से वर्णित के रूप में और / या तीर 13,16,25 की माप (उत्तरार्द्ध के लिए हम fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) संयुग्मित एल्बुमिन उपयोग) मानक paracellular और / या लेबल tracers 16,24 के transcellular पारगम्यता assays के प्रदर्शन.

पारगम्यता (अधिकतम%) = (: आधारभूत पारगम्यता में उतार चढ़ाव के लिए खाते में प्रयोगों के बीच, (अधिक से अधिक पारगम्यता के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है जो सेल) के बिना एक लेपित डालने के लिए और सूत्र का उपयोग वाहन का इलाज समूह के लिए पारगम्यता सापेक्ष में परिवर्तन का विश्लेषण वाहन समूह की औसत पारगम्यता मूल्य) एक्स 100 - वाहन समूह रिक्त डालने का) / (पारगम्यता मूल्य के औसत पारगम्यता मूल्य - पारगम्यता प्रयोगात्मक डालने के लिए मूल्य.

4. झरझरा झिल्ली पर कोशिकाओं के दृश्य

NT "> टिप्पणी: सम्मिलित झिल्ली पर बेदाग कोशिकाओं झिल्ली काफी अपारदर्शी है और प्रकाश संचरण के साथ हस्तक्षेप के बाद चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि हम पर कोशिकाओं के विभिन्न धुंधला प्रक्रियाओं विकसित इस मुद्दे से निपटने के लिए. बहुत झिल्ली पर सेल उपस्थिति बढ़ाने के जो. अभी भी कुओं में सम्मिलित करने के लिए संलग्न है. झिल्ली ही बढ़ते प्रयोजनों के लिए धुंधला प्रक्रिया के अंत में हटा दिया जाना चाहिए आम तौर पर, सम्मिलित झिल्ली दाग ​​सम्मिलित करता है,.

4.1. Hematoxylin धुंधला

  1. 20 मिनट के लिए, फॉस्फेट बफर खारा (130 मिमी NaCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 10 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 7.2 पीबीएस) में (w / v) paraformaldehyde (पीएफए) ठंडा 4% के साथ सम्मिलित करता है ठीक करें. पीबीएस में एक बार धोएं.
  2. 2 मिनट के लिए 0.1% मेयर hematoxylin समाधान में डालने डूब.
  3. धीरे आईएनएस submerging द्वारा (नल के पानी के साथ सम्मिलित धोनेएक बीकर युक्त पानी के नल में ईआरटी और धीरे) अतिरिक्त पानी बाहर pipetting. वांछित नीले रंग विकसित तक 20 सेकंड ~ के लिए स्कॉट के नल पानी के घोल (2 जी / एल 3 NaHCO, 20 जी / एल MgSO 4) को सम्मिलित स्थानांतरण. नल का पानी (धारा 4.1.3) के साथ फिर से डालने धो लें. एक वैकल्पिक eosin दाग एक नल के पानी से धोने के द्वारा पीछा किया 10 सेकंड के लिए 1% eosin समाधान में डालने सूई से यहाँ पेश किया जा सकता है.
  4. सम्मिलित झिल्ली हवा शुष्क. (झिल्ली किनारे के आसपास काटने) एक स्केलपेल का उपयोग झिल्ली को हटा दें और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए एक गिलास स्लाइड पर माउंट
    नोट: DI-N-butylphthalateinxylene (dpx) बढ़ते मध्यम से उपयोग किया जाता है, तो झिल्ली को दूर करने और बढ़ते से पहले xylene द्वारा पीछा 100% इथेनॉल के साथ सम्मिलित धो लो.

4.2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM)

  1. ठंडा 4% के साथ सम्मिलित करता है ठीक करें (w / v) 20min के लिए पीबीएस में पीएफए. पीबीएस में तीन बार धोएं.
  2. 30 1% में न्यूनतम (w / वी के लिए झिल्ली परसर्गMQH 2 ओ में) आज़मियम tetroxide
  3. पानी (धारा 4.1.3) में सम्मिलित करता है और धो (अंतराल प्रति 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ 3x तो 50%, 70%, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 90%,) एक तना इथेनॉल ढाल में निर्जलीकरण.
  4. इथेनॉल (1:2 तब 02:01 5 मिनट के लिए): hexamethyldisilazane (HMDS) के मिश्रण के साथ निर्जलित आवेषण समझो.
  5. 5 मिनट, शुष्क परिस्थितियों में हवा शुष्क और दुकान के लिए 100% HMDS साथ सम्मिलित करता समझो.
  6. (झिल्ली किनारे के आसपास काटने) एक स्केलपेल का उपयोग झिल्ली निकालें. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा झिल्ली जांच करते हैं.

4.3. Immunofluorescence

  1. (W / v) पीबीएस में पीएफए ​​20 मिनट के लिए, (50 मिमी Tris-एचसीएल 7.6 पीएच, 154 मिमी NaCl, 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर्ड टीबीएस) Tris बफर खारा में एक बार धोने ठंडा 4% के साथ सम्मिलित करता है ठीक करें.
  2. पहले 26 में वर्णित के रूप में सम्मिलित झिल्ली पर कोशिकाओं के immunostaining प्रदर्शन करना.
  3. (झिल्ली किनारे के आसपास काटने) एक स्केलपेल का उपयोग झिल्ली निकालें और एजी पर माउंटप्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम के साथ लड़की स्लाइड. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली जांच करते हैं.

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Representative Results

हम endothelial कोशिकाओं 14,15,27,28 के साथ संपर्क के लिए astrocyte अंत फुट के पारित होने की अनुमति के लिए दिखाया गया है एक 3 माइक्रोन रोमकूप आकार, साथ झरझरा झिल्ली पर SVGs और BECs खेती करने के लिए किया था एक मानव, संपर्क बीबीबी मॉडल स्थापित करने के लिए आदेश में. पूरी संपर्क मॉडल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 (चित्रण बाएं) में सचित्र है. एक संपर्क प्रणाली द्वारा प्रस्तुत मुख्य तकनीकी चुनौती झिल्ली की abluminal सतह पर गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ astrocytes बीज की जरूरत है. हम luminal गुहा में डाला एक अतिरिक्त सिलिकॉन प्लग (चित्रा 2) के साथ मीडिया के रिसाव को रोकने, जबकि मुख्य abluminal झिल्ली सतह के शीर्ष पर अच्छी तरह से एक हटाने योग्य सिलिकॉन बनाने के द्वारा इस कार्य में सफल हुए हैं. विधि बदले में दृढ़ता से कम से कम सेल हानि के साथ झरझरा सतह से जुड़ी बन गया है, जो SVGs की एक इष्टतम, निर्बाध बोने की अवधि (कम से कम 4 घंटे) की अनुमति दी है. दरअसल, 3 दिन SVGs और BECs app दोनों के बाद बोनेमिला हुआ कान और hematoxylin से सना हुआ आवेषण की छवियों से न्याय के रूप में (खंड 4.1 देखें, चित्रा 3 ए, बाएं पैनल), समान झिल्ली को कवर किया. इसके अतिरिक्त, दोनों प्रकार की कोशिकाओं झरझरा झिल्ली पर उनके सेल विशिष्ट मार्कर (चित्रा 3 ए, सही पैनल एक फैलाना धुंधला SVGs 22 में glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन के पैटर्न और BECs में Wiebel-Palade निकायों और cytoplasmic vesicles में वॉन Willebrand कारक की अभिव्यक्ति) बनाए रखा , immunofluorescence (धारा 4.3) से मनाया. इसके अलावा, SEM इमेजिंग से (धारा 4.2) यह SVGs और BECs झिल्ली pores (चित्रा 3, मध्य पैनल, तीर सिर), कृत्रिम रूप से इन विट्रो बीबीबी की शारीरिक बाधा समारोह के लिए योगदान देता है जो एक घटना पर सीधे बढ़ती में सक्षम थे कि स्पष्ट हो गया संपर्क 3,28 models1. कार्यात्मक, SVGs की उपस्थिति फ्लोरोसेंट एल्बुमिन 28 impro के endothelial पारगम्यता मूल्य (पे) 16,24 मेंअकेले BECs को वेद ~ 4 गुना रिश्तेदार (पी <0.01, n = 4), 0.574 ± 0.199 X10 -3 क्रमशः, बिना या astrocytes (SVGs) के साथ X10 -3 सेमी / मिनट 0.028 ± 0.126 करने से. ये albumin पे परिणाम चूहा सी 6 glioma कोशिकाओं 29 के साथ माउस BECs का उपयोग कर एक और अध्ययन करने के लिए तुलना कर रहे हैं. हमारे बोने प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक भी प्राथमिक माउस BECs और 1 माइक्रोन pores पर हो प्राथमिक माउस astrocytes हौसले से पृथक करने के लिए लागू किया गया था. इस माउस संपर्क मॉडल में हम छोटे हाइड्रोफिलिक ट्रेसर सोडियम fluorescein के लिए एक उचित शारीरिक बाधा प्राप्त (PE = 0.83 ± 0.22 X10 -3 सेमी / मिनट, n = 3). इसलिए, हमारे बोने विधि अन्य प्रजातियों से बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

एक संपर्क बीबीबी मॉडल की सबसे बुनियादी सुविधा शारीरिक रूप से endothelial कोशिकाओं से संपर्क करने के लिए झिल्ली छिद्रों के माध्यम से अपने अंत फुट परियोजना के लिए astrocytes की क्षमता है. कुछ अध्ययनों से पहचान करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल कियाtify astrocytes और चुनाव आयोग के बीच संपर्क 14,15,27 प्रशंसनीय है कि सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, luminal सतह के लिए (astrocytes वरीयता प्राप्त कर रहे हैं) abluminal झिल्ली सतह से गुजरती हैं जो प्रक्रियाओं astrocytes. हम abluminal सतह पर SVGs बोने के बाद SEM द्वारा luminal झिल्ली imaged इन अध्ययनों के बाद. चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, astrocytic (एसवीजी) अंत पैर कि संपर्क संभावित SVGs और BECs इस आयाम का pores पर वरीयता प्राप्त के बीच मौजूद कर सकते हैं पुष्टि luminal डिब्बे में 3 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से गुजर मनाया जा सकता है. सामूहिक रूप से, हमारे बोने विधि, सरल कुशल था, और एक प्रामाणिक संपर्क बीबीबी मॉडल झुकेंगे.

हम बीबीबी पर, टी पीए, एक fibrinolytic एजेंट के प्रभाव का पता लगाने के लिए हमारे मानव संपर्क बीबीबी मॉडल का उपयोग किया है. लेख के एक नंबर टी पीए तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक 30-33 के इलाज के लिए अपनी नसों में प्रशासन के दौरान BBB के उद्घाटन के लिए प्रेरित करने में सक्षम हो सकता है सुझाव दिया है कि. T-पीए और BBB के बीच यह बातचीत टी पीए प्रेरित थ्रंबोलाइसिस 4,34,35 के साथ जुड़े खून बह रहा जटिलताओं के लिए योगदान और इस प्रकार वर्तमान अनुसंधान के प्रयासों के लिए एक विषय है हो सकता है. इन विट्रो में हमारी पढ़ाई टी पीए वास्तव में एक एकाग्रता (चित्रा -4 ए) में बरकरार बीबीबी की पारगम्यता वृद्धि की पुष्टि की है कि और एक औषधीय प्रासंगिक श्रृंखला 36,37 भीतर दोनों थे जो समय पर निर्भर ढंग से (चित्रा 4 बी),. इसके अलावा, एसवीजी astrocytes के नाटकीय morphological परिवर्तन झरझरा झिल्ली टी पीए को astrocytic प्रतिक्रियाओं टी पीए प्रेरित बीबीबी उद्घाटन आबाद, सुझाव है कि टी पेंसिल्वेनिया (चित्रा 4C) के लिए जोखिम पोस्ट पर मनाया जा सकता है. शक्तिशाली और व्यापक स्पेक्ट्रम प्रोटीज plasmin में - अपनी प्राकृतिक सब्सट्रेट - बाद में जांच टी पीए plasminogen की सक्रियता के माध्यम से astrocytes को उत्तेजित करता है कि पहचान की. इसके अलावा, टी पीए और plasmin astrocytes में संकेत रो-kinase (रॉक), और नाकाबंदी को सक्रिय पाए गए रॉक मार्ग के टी पीए प्रेरित बीबीबी उद्घाटन 28 को रोका. इस बीबीबी मॉडल का उपयोग उपन्यास जैविक प्रक्रियाओं और चिकित्सीय अवसरों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का एक अच्छा उदाहरण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. इन विट्रो बीबीबी मॉडल की डालें आधारित विन्यास. विट्रो बीबीबी मॉडल में (प्रवाह) के बिना स्थिर योजनाबद्ध अभ्यावेदन. बुनियादी मॉडल में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (ईसीएस, नारंगी) (पीले) एक झरझरा झिल्ली पर अकेले सुसंस्कृत हैं. अधिक उन्नत दृष्टिकोण ईसीएस astrocytes (हरा) के साथ cocultured रहे हैं. Astrocytes अच्छी तरह से (दाएं) के तल पर, या संपर्क शर्तों (बाएं) में झरझरा झिल्ली के abluminal सतह पर, या तो गैर संपर्क परिस्थितियों में उगाया जा सकता है.एन.के. "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक संपर्क बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए abluminal झिल्ली सतह पर astrocyte बोने के लिए एक बेहतर तरीका है. (ए) डालें, उलटा है सिलिकॉन टयूबिंग ("बाहरी ट्यूबिंग") के एक छोटे टुकड़े इसकी परिधि के चारों ओर इकट्ठा होता है और एक सिलिकॉन प्लग में लगाया luminal गुहा. इस विधानसभा abluminal सतह के शीर्ष पर एक अच्छी तरह से बनाता है और छिद्रों के माध्यम से लीक से मीडिया को रोकता है. कोशिकाओं को अच्छी तरह में वरीयता प्राप्त और (सही) (बी) सिलिकॉन प्लग एक सील शंकु के साथ एक छोर पर सील सिलिकॉन टयूबिंग ("आंतरिक ट्यूबिंग") का एक टुकड़ा, से तैयार किया जाता है समय की विस्तारित अवधि के लिए undisturbed पालन करने की अनुमति दी जा सकती है जो इसके गुहा में डाला जाता है. (सी) एक बार, वरीयता प्राप्तइकट्ठे आवेषण संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए (एक थाली दूसरे पर औंधा) दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों के बीच में ले जाया जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. . मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) और एक 3 माइक्रोन झरझरा झिल्ली ए) Hematoxylin (बाएं पैनल), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM पर astrocytes के विजुअलाइजेशन; abluminal सतह पर मध्यम पैनल) और SVGs की immunofluorescence छवियों (सही पैनल) (40,000 coculturing बिना 3 दिनों के लिए एक 3 माइक्रोन झरझरा झिल्ली () पर हो 6.5 मिमी डालें, शीर्ष पैनल) और BECs (कोलेजन पर 20,000 6.5 प्रति मिमी डालने मैं लिपटे, luminal सतह, नीचे पैनल) प्रति. दोनों प्रकार के सेल इस समय FRA भीतर संगम तक पहुँचनेमुझे और झिल्ली पर (BECs, सही पैनल के लिए Wiebel-Palade निकायों में एसवीजी और वॉन Willebrand कारक (vWF) के लिए glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP)) अपने सेल विशिष्ट मार्करों बनाए रखें. तीर सेल नाभिक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि आगे, सीधे ऊपर बढ़ने और pores कवर करने के लिए दोनों प्रकार की कोशिकाओं की क्षमता दिखाने SEM पैनल में सिर तीर. SEM छवियों पर स्केल सलाखों 25 माइक्रोन (ऊपर) या 20 माइक्रोन (नीचे) का प्रतिनिधित्व करते हैं. Immunofluorescence छवियों पर स्केल सलाखों 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) luminal (बीईसी) abluminal झिल्ली सतह पर SVGs (लड़का) की सतह 3 डी पद बोने में 3 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से गुजर एसवीजी अंत फुट की छवियों SEM. ये चित्र हमारे मानव बीबीबी मॉडल में SVGs और BECs के बीच सच्चा संपर्क के विकास के लिए क्षमता को मान्य. स्केल सलाखों सही पैनल पर बाईं पैनल और 12 माइक्रोन पर 6 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

1, बाएं पैनल चित्रा देखें.

चित्रा 4
चित्रा 4. बीबीबी पारगम्यता में ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (टी पीए) की मध्यस्थता वृद्धि astrocytes के morphological परिवर्तन से प्रेरित है. (ए) बढ़ाकर टी पीए सांद्रता 24 घंटा मूल्यांकन किया गया था विट्रो बीबीबी में मानव और पारगम्यता की luminal चेंबर में जोड़ा गया बाद में abluminal चेंबर में फ्लोरोसेंट एल्बुमिन के पारित होने के द्वारा. T-पीए एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से बीबीबी पारगम्यता वृद्धि हुई है. एन = 4-6 सभी समूहों लेकिन टी पीए 10nm, जहाँ n = 2 के लिए. *** पी <0.001 न्यूमैन-Keuls साथ एनोवा पद अस्थायी. (बी) टी पेंसिल्वेनिया (1 माइक्रोन) में मानव की luminal चैम्बर के लिए जोड़ा गया है एक तरह से अन्य सभी समूहों की तुलनापारगम्यता मूल्यांकन से पहले 8 घंटा और 24 घंटे के लिए बीबीबी विट्रो. दिखाया गया है, टी पीए की मध्यस्थता बीबीबी खोलने पहले से ही पर्याप्त 8 घंटे बाद उत्तेजना (24 घंटे में अधिकतम 70.26%) था, लेकिन एक और वृद्धि 24 घंटा में मनाया गया. एन = 6, *** 0.001 <पी, पी ** <शून्य करने के लिए 0.01compared एक तरह से न्यूमैन-Keuls साथ एनोवा पद अस्थायी. दोनों में (ए) और (बी), सलाखों / डाटा अंक ± SEM मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं. (सी) पॉलिएस्टर डालने झिल्ली पर Haematoxylin से सना हुआ SVGs (शीर्ष पैनल) या SVGs (नीचे पैनल) की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (3 माइक्रोन रोमकूप आकार) वाहन या टी पेंसिल्वेनिया (1 माइक्रोन) के साथ 24 घंटे इलाज के बाद. उच्चारण टी पीए प्रेरित morphological परिवर्तन और एसवीजी monolayer अखंडता के विघटन टी पीए को astrocytic प्रतिक्रियाओं बीबीबी पारगम्यता पर टी पीए का प्रभाव कायम करना, सुझाव है कि देखा जा सकता है. छवियाँ दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. SEM छवियों पर स्केल सलाखों प्रतिनिधि61 माइक्रोन (बाएं) या 120 माइक्रोन (दाएं) भेजा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

मस्तिष्क विकृतियों में चिकित्सा अनुसंधान बहुत translational कठिनाई ग्रस्त है. तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, पशु मॉडल में महान वादा दिखाया जो कई दवाओं क्लिनिक 38,39 पर विफल रही है. इन निराशाजनक परिणामों के कारणों विविध रहे हैं और मानव स्ट्रोक परिदृश्य और जानवरों के अध्ययन में 21 से प्राप्त परिणामों की overstatement को preclinical परीक्षण प्रणाली की बेवफाई में शामिल हैं. नैदानिक ​​चरण के लिए preclinical निष्कर्षों का भविष्य कहनेवाला मूल्य में सुधार करने के लिए एक रणनीति के अतिरिक्त विकास है मानव कोशिका आधारित इन विट्रो मॉडल में, इन उपन्यास दवाओं और तंत्र स्क्रीनिंग के लिए शक्तिशाली और लागत प्रभावी उपकरण उपलब्ध कराने और बेहतर नैदानिक ​​प्रासंगिक रास्ते पर ध्यान केंद्रित अनुमति दे सकता है 21. इस संदर्भ में, हम विस्तार में यहाँ वर्णित मानव अमर एस्ट्रो के एक उपन्यास संयोजन का उपयोग एक मानव संपर्क बीबीबी मॉडल की स्थापना के लिए हमारी प्रयोगशाला में किए गए प्रक्रियाcytes (SVGs) और स्ट्रोक से संबंधित घटना की जांच के लिए मानव प्राथमिक BECs.

(प्रवाह) के बिना स्थिर शर्तों के तहत, चित्रा (1) सबसे अच्छा vivo में शारीरिक संरचना के समान बीबीबी मॉडल से संपर्क करने और उनके गुण बाधा 13,17,18 में बेहतर होना दिखाया गया है. महत्वपूर्ण बात है, BECs और astrocytes के बीच सच्चा संपर्क केवल astrocytic अंत फुट और सख्त (कम पारगम्य) बीईसी monolayers 14,15,27 के बाद प्रेरण के पारित होने की अनुमति जो बड़ा ताकना व्यास (≥ 1 माइक्रोन), के साथ झिल्ली पर होता है. हालांकि, उच्च छेद के आकार के साथ उल्टे आवेषण पर astrocytes के बोने - एक संपर्क बीबीबी मॉडल की तैयारी में कोर तकनीकी तत्व - सीमित मध्यम मात्रा के अलावा उल्टे 6.5 मिमी करने के लिए जोड़ा जा सकता है के बाद से, एक डबल तकनीकी चुनौती प्रस्तुत सम्मिलित करता है (~ 50 उल), झिल्ली भी कारण उनके बड़े ताकना व्यास को मध्यम से रिसाव होने का खतरा है. इन सीमाओं AST कर सकते हैंrocytic बोने अजीब और असंगत.

3 माइक्रोन pores के साथ उल्टे आवेषण पर astrocytes बोने के लिए हमारे नवीन तकनीक इस प्रक्रिया के लिए एक सरल अभी तक प्रभावी समाधान प्रदान करता है. Abluminal सतह के शीर्ष पर अच्छी तरह से एक हटाने योग्य, अभेद्य सिलिकॉन बना कर हम बहुत सफलतापूर्वक झरझरा झिल्ली का पालन करने astrocytes 'क्षमता में सुधार हुआ. इस abluminal सतह पर astrocytes के समान विकास के लिए सक्षम बनाता है और अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, बीबीबी 28 पर पांच अलग plasminogen-activators के प्रभाव के बारे में हमारी हाल ही में प्रदर्शन किया स्क्रीनिंग) कई प्रयोगात्मक मापदंडों के एक साथ जांच के लिए सम्मिलित करता है की एक बड़ी संख्या के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तैयारी. इसलिए, अपनी सादगी के बावजूद, हम नाटकीय रूप से इस संपर्क बीबीबी मॉडल का उपयोग हमारे शोध के throughput और गुणवत्ता में सुधार करने के लिए हमारे विधि पाया. हमारे astrocyte बोने विधि की एक सीमा पतली बंदरगाह जो सम्मिलित करता है, (10 μ की अतिरिक्त पुस्तिका निपटने के लिए आवश्यकता हैमीटर मोटी) झिल्ली. अत्यधिक या किसी न किसी से निपटने सूक्ष्म आँसू और झिल्ली को नुकसान हो सकता है. विधानसभा / disassembly न्यूनतम बल के साथ प्रदर्शन किया जाना है के रूप में इसलिए, नरम और लचीला सिलिकॉन टयूबिंग का उपयोग आवश्यक है.

अपनी समग्र अवधारणा के बारे में, हमारे मानव बीबीबी मॉडल मूल रूप से प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग किया है, जो एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 14,23 के आधार पर स्थापित किया गया था. बीबीबी मॉडलिंग के लिए अपनी श्रेष्ठता के बावजूद प्राथमिक मानव मस्तिष्क की कोशिकाओं के रोजगार में एक कमी नियमित प्राथमिक BECs और astrocytes और / या व्यावसायिक रूप से उन्हें प्राप्त करने में शामिल लागत का नियमित उत्पादन के लिए जीना मानव मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करने की अक्षमता है. कई बीबीबी मॉडल को सफलतापूर्वक (एक चूहा सी 6 glioma कोशिकाओं 29 के साथ उदाहरण के लिए) अमर astrocytes साथ प्राथमिक astrocytes स्थानापन्न के बाद से, यह एक उपन्यास, मानव बीबीबी मॉडलिंग के लिए प्रचुर मात्रा में और लागत प्रभावी विकल्प के रूप में एसवीजी astrocytes 22 को रोजगार के लिए उचित था. को SVGs की क्षमतासकारात्मक के सिद्धांत में बीबीबी पढ़ाई के लिए उनकी उपयुक्तता मान्य बीईसी बाधा समारोह प्रभावित करते हैं. इसके विपरीत, हम विवो 1,2,9 में बीबीबी में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए हमारे बीबीबी मॉडल में प्राथमिक BECs रखने के लिए चुना है. महत्वपूर्ण बात है, प्राथमिक BECs के लंबे समय तक संवर्धन डे भेदभाव और उनके BBB-विशिष्ट फेनोटाइप की गिरावट हो सकती है. यह वास्तव में एल्बुमिन के लिए एक नहीं बल्कि उच्च endothelial पारगम्यता मूल्यों से हमारे सिस्टम में स्पष्ट हो सकता है. इस कारण से, हम खाते में अपने बुलंद बेसल पारगम्यता ले रही है, मुख्य रूप से एक रिश्तेदार फैशन 28 (चित्रा 4) में हमारे मॉडल का इस्तेमाल किया है. एक बहुत तंग मानव बीईसी monolayer वांछित है बाधा समारोह आगे इस तरह glucocorticoid hydrocortisone 17 या फॉस्फोडाइस्टरेज़ inhibitors 13 के साथ चक्रीय एएमपी के रूप में रसायनों के अलावा द्वारा सुधार किया जा सकता है. ऐसे hCMEC/D3 सेल लाइन 40 के रूप में अमर मानव BECs, भी बेहतर तिवारी बनाए रखने के लिए उनकी क्षमता के लिए नियोजित किया जा सकता हैसमय के साथ ght जंक्शनों. फिर भी, बीईसी सेल लाइनों अक्सर कम बीतने के प्राथमिक BECs 41,42 की तुलना में कम बाधा गुणों को प्रदर्शित करने और ध्यान से क्योंकि अन्य संभावित परिवर्तन (सेल सतह रिसेप्टर्स की यानी बदल अभिव्यक्ति) से विचार किया जाना चाहिए.

सामूहिक रूप से, (SVGs का रोजगार IE) astrocytic सेल प्रकार और astrocyte बोने प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त सुधार के हमारे संशोधन एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, आसानी से इकट्ठा और प्रामाणिक मानव संपर्क बीबीबी मॉडल की पीढ़ी में हुई. मन में अपनी सीमाएं असर, इस प्रणाली हम यहाँ 28 उदाहरण के रूप में, तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक की न केवल इन विट्रो जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा, लेकिन यह भी बीबीबी की मॉडुलन शामिल कई अन्य मस्तिष्क विकृतियों के कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुदान # 606,658) से RLM के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

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जैव अभियांत्रिकी अंक 81 रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल सेल संस्कृति astrocytes मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं डालने झिल्ली
विधि रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मानव कोशिका आधारित, संपर्क माडल की तैयारी के लिए बेहतर
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Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

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