Summary
Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.
Abstract
Kan-beyin bariyeri (KBB) sıkıca beyin ortamı kontrol geçirmeyen ama uyarlanabilir beyin kılcal damarları oluşur. BBB başarısızlık klinik ile ilgili araştırma yardımcı vitro BBB modellerinde insan gelişimi için bir ihtiyaç yaratarak, birçok beyin patolojilerin etiyolojisinde ima edilmiştir. Şimdiye kadar tarif edilen çok sayıda BBB modelleri arasında, (akış olmadan) statik, astrositler ve beyin endotel hücreleri (BECS) gözenekli zarın karşı tarafında kültüre edilir BBB modeli, iletişim, bir basitleştirilmiş simüle etmek için henüz otantik bir sistem olarak ortaya yüksek veri akışı tarama kapasiteli BBB. Yine bu modelin üretimi birkaç teknik zorluklar sunuyor. Burada, primer insan BECS ve ölümsüzleştirilmiş insan astrosit yeni bir kombinasyonunu kullanan bir kişi insan BBB modelinin hazırlanması için bir protokol açıklar. Özellikle, biz detay ters ekler üzerinde hücre tohumlama için yenilikçi bir yöntem olarak inser belirtmekt boyama teknikleri ve biz BBB-ilgili araştırmalar için bir model kullanmak nasıl örneklemektedir.
Introduction
BBB periferik kan dolaşımı ve beyin hemostazın korunması için hayati sorumlu olan merkezi sinir sistemi arasındaki özel bir arabirimdir. Bu işlevsel beyin içine sıkı ve dinamik bir ağ geçidi oluşturmak için (aşağıda) birkaç hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından etkilenmektedir ki farklı beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BECS) içerir. Fizyolojik koşullar altında, BBB beyin içine, kan hücreleri, plazma komponentleri ve zararlı maddelerin, tüm potansiyel nörotoksik geçişini sınırlandırır. Buna paralel olarak, seçici olarak BBB tam beyin ortamı 1,2 korumak için, beyin ve dolaşım arasında önemli iyonları ve besin (glikoz ve amino asitler) ve metabolik atık ürünler değiştirir. Son yıllarda BBB yetmezliği gibi nörodejeneratif veya enflamatuar ile ilgili hastalıklar (örneğin, Alzheimer hastalığı ve multipl gibi kronik patolojiler beyin, çeşitli oluşur belirgin hale gelmektedire iskemik inme 4 gibi akut koşullarda yanı sıra), sırasıyla, 3, skleroz.
Beyin endotel hücreleri (BECS) benzersiz BBB özellikleri büyük ölçüde onların beyin ortamında 5 ile oluşturulan ve özellikle de 6,7 ile astrositler edilir. Gibi diğer perisitlerin 8, nöronlar ve mikroglia 1,3 gibi hücre tipleri, hem de bazal membran 9, BECS desteklemek ve bir işlevsel birim "nörovasküler birimi" (NVU) olarak adlandırılan, birlikte giderek artan bir anlayış var ki aynı anda çiftler temin kılcal 10 metabolik ihtiyaçları nöronal.
Patolojik durumlarda BBB katılımı BBB-ile ilgili araştırma 11,12 yardımcı vitro BBB modelleri geliştirmek için sayısız girişimde yatmaktadır. Bu modeller NVU prensibine göre vivo BBB özellikleri mümkün olduğu kadar yakın bir taklit eden ve. In vitro 13, 14 insan, sıçan 15, fare 16, ve domuz 17,18 kökenleri) sıkı kavşak oluşturan BECS tek tabaka gözenekli bir zar üzerinde kültüre birlikte destek astrositlerde ile güveniyor yoğun ) Deli vd. 2005 11 tarafından incelendi.
Astrositler kültür ortamı, yine çözünebilir faktörleri ile BECS 16 ile iletişim kurarak (membran üst yüzeyi üzerinde yetiştirilen) BECS ayrılan iyi bir doku kültürü, altındaki temassız şartlarında yetiştirilebilir. Daha iyi in vivo BBB anatomik yapısının benzer daha gelişmiş modellerde, astrositler temas koşulları ve doğrudan BECS 13,15,17 yakın (Şekil 1) 'de zarın karşı tarafında kültürlenir içinde muhafaza edilmiştir. Bu yapılandırma kurulmuş, BECS ve astrositlere arasındaki fiziksel temas sağlar zaman astrocytes projegözenekli membran yoluyla işler. Astrositik sonu-ayak küçük gözenek boyutları (yani 0,4 mikron) 14,15 geçemez beri önemlisi, ortaya gerçek bir temas için gözenekler, çapı 1uM ≥ edilmelidir. Özellikle, iletişim BBB sistemleri, trans-endotel elektriksel direnç (TEER) ve çeşitli izleyiciler 13,17,18 endotel geçirgenliği değerleri konusundaki temassız meslektaşları üstün olduğu bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Ortam akımının ilave bir boyut yakın beyin damar 12,19 arasında yakın bir simülasyon için endotele kesme kuvvetleri uygulamak için in vitro BBB model bir dizi ilave edildi.
Bir kişi BBB modeli oluşturulurken üstesinden gelmek için bir teknik engel gözenekli membranın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositlerin tohumlama olan. Astrocytes sadece bir in üstüne medyanın bir damla ekildi Önceki protokolleri 13,20,verted insert, izin, sadece kısa tohumlama kez doğru hücre eki için yetersiz olması bizim ellerde bulundu (yani 10 dk 13 ya da 2 saat 20). Bu temel yöntemi kullanılarak, daha uzun bir astrosit bağlantı süresi (sıcaklık, pH ve nem dalgalanmalara yol açması) inkübatör sık açılması ile insertlerin sürekli izlenmesi gerekir ve nedeniyle gözeneklerden medya sızıntıya da düzensiz hücre ekimi eğilimli, özellikle 1 um 'den daha büyük gözenekler kullanılması durumunda.
Burada, bir temas BBB modelinin hazırlanması için genel bir protokol açıklar. Bizim prosedür, yukarıda belirtilen sınırlamaları çözen ters ekler, on hücre tohumlama için alternatif bir yöntemi içerir. Bu yöntem uzun bir zaman süresi için, dengelenmiş bir inkübatör içinde, abluminal zar yüzeyi üzerine astrositlerin rahatsız yapışmasını sağlar. Bunun bir sonucu olarak, astrositlerin muntazam bir tohumlama bariyer kalitesini arttırır elde edilirve ekler arasında bazal geçirgenliği varyasyonlar en aza indirir.
İnsan hücrelerinin kullanımı insan ilgili araştırmalar 21 için önemli olduğu için, ilave olarak bu makalede primer insan BECS yeni bir kombinasyonunun özel kullanımını göstermek ve bir yüksek veri akışı tarama kapasiteli bir temas insan BBB Model kurulması için insan astrositler ölümsüzleştirilmiş . Gözenekli membran üzerinde hücrelerin görüntüleme gözenekli membranlar üzerinde birleştiği ve hücre morfolojisi belirlenmesinde yardımcı olabilir zor, daha da ayrıntılı boyama teknikleri olabilir beri. BBB - Akut iskemik inme için bir tek tedavi seçeneği olarak hizmet veren bir pıhtı avı enzim - Nihayet, bizim insan BBB modeli doku tipi plazminojen aktivatörü etkisi (t-PA) incelemek için kullanılabilir nasıl örneklemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre Kültürü (Önceki BBB Kurul'a 3-7 Gün)
1.1. İlköğretim İnsan Beyninin Mikrovasküler Endotel Hücreleri (BECS)
BECS ticari olarak elde edildi. Hücreler, normal insan beyni korteks dokusu dispase ayrışma tarafından üretilen ve geçit 3 (<12 nüfus ikiye katlama) de donduruldu sağlandı.
- Taban: üreticinin talimatlarına göre "Ek Factor" ile Coat doku kültürü gemiler.
- Hücre bakım: serum-içeren komple ortam içinde BECS koruyun. Komple serum serbest ortamda deney, kültür BECS için. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 hücrelerin bakımı, 37 ° C'de% 21 O 2 inkübatör
Not: DMEM/F-12 15 mM HEPES,% 10 (v / v) cenin dana serumu (FCS) ile desteklenmiş iken özel bir tepkin bir alternatif olarak,% 0.1 (a / h) jelatin çözeltisi, bir kaplama maddesi olarak hizmet edebilir; 2 mM L-glutamin, 50 ug/ Ml gentamisin, 20 ug / ml heparin ve 20 ug / ml endotelyal hücre büyüme takviyesi BEC bakımı için de kullanılabilir. - Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:03-1:06 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik BECS: deney için alt-kültürlenmesi. Her 3 günde bir bakım ortamı değiştirin. 15 geçitlerine BECS kullanın.
1.2. SVG İnsan Fetal astroglial hücre hattı
SVG insan fetal astroglial hücreler, 22 orijinal olarak replikasyon-eksikli simian virüs 40 ile transforme edilmiş, insan fetal beyin primer kültürlerden elde edilmiştir.
- Bakım:% 20 (v / v) FCS (ebeveyn birincil hücreler 22 korumak için kullanılan aynı serum yüzde), 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin ve ilave edilmiş Earle dengeli tuz çözeltisi ile en az temel ortam içinde kültür SVG hücrelerin 50 ug / ml streptomisin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2,% 21 O2 hücreleri korumak
- Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:05-1:10 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik SVG lezyonu: deney için alt-kültürlenmesi. Tripsin çıkarılması nedeniyle ortam içinde yüksek serum içeriği gerekli değildir. Her 3 günde bir orta değiştirin. Kadar 20 pasajlara SVG lezyonu kullanın.
2. İnsan In vitro BBB Modelin Montaj ve Coculturing (Gün 0)
Yorum: vitro temas BBB modelinde insan modifikasyonlarla, 13,23 yayınlanmış protokollere göre hazırlanır.
2.1. Eklemelerin Kaplama
- Birlikte 24 oyuklu plakanın kuyularda doku kültür ekleri (polyester gözenekli zar ile, çapı 6.5 mm, 3 um gözenek boyutlu) yerleştirin. Ekler Coat luminal yüzeyi
Not: beyin kılcal damarların bazal membran hiçbir kollajen içeren ben ama esas laminins, kollajen tip IV isoformları, nidogens ve heparan sülfat proteoglikan 9. Bu nedenle, bazı araştırmacılar, kolajen IV, fibronektin 13 ya da daha gerçekçi bir Matrigel BBB modelleme (BD Biosciences) 16 gibi kaplama maddeleri kullanmaktadır.
2.2. Alt tarafı (abluminal) Membran Yüzey üzerinde tohumlama SVG lezyonu
- Ekleme ters çevirin ve yavaşça gözenekli membran elastik silikon boru kısa bir parça jantı etrafında uygun; de ablüminal yüzeyi üzerinde esas olarak yeni bir tane oluşturmak ("dış boru" yaklaşık 10 mm uzunluğunda, 8 mm iç çap, 1.6 mm duvar) (Şekil 2A).
- Insert nee en altds medya kaçağı önlemek için kapalı olması. Plastik bir sızdırmazlık koni ile bir ucunda kapalı, ilk (Şekil 2B;, ~ 8 mm uzunluk, 3.2 mm iç çap, 1.6 mm duvar "iç boru" olarak adlandırılır), bir silikon boru yapılmış bir fiş (Şekil 2A ve 2B) hazırlanması (~ 3 mm uzunluğunda, bir 0.2 ml, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp alt kesim tarafından hazırlandı; Şekil 2B). bu koni iç boru lümen keçe, aynı zamanda ucun içine sıkı montaj için kenar genişletmektedir değil. Bu zardan up-~ 1-2 mm (Şekil 2A) ulaşana kadar Sonraki steril bir forseps kullanarak, lümen boşluğu ve önceden, içine silikon fişini takın.
- Daha sonra, 200 ul SVG bakım ortamı içinde 4 x 10 4 SVG hücreler (tohum seşeklinde gösterilmektedir yukarıda 1.2.2) doğrudan de abluminal zar yüzeyi üzerinde silikon (Şekil 2A) içine. SVG lezyonu inkübatör içinde en az 4 saat boyunca yapışmaya izin verin.
Not: sterilite iki adet 6 oyuklu plakalar içinde (diğer üzerinden ters bir plaka, Şekil 2C) arasında monte ekler taşıma muhafaza etmek için filtre işlemi sırasında havaya maruz kalmasını en aza indirmek için. Silikon borular ve prizler etanol içinde yıkandı ve daha sonra kullanılmak üzere otoklavlanır.
Not: Kullanım fişleri sadece membran gözenek olan uçlar için (bölüm 2.2.2) 1 mikron daha büyük boyutları. 1 mikron ≤ gözenek çaplı membranlar nadiren sızıntı ve dış silikon tüp (bölüm 2.2.1) sadece montaj gerektirir. Buna ek olarak, kollajen dışındaki bazı kaplama maddeleri I (bölüm 2.1 nota bakınız) hatta 3 mikron gözenekleri sayesinde sızmaları engelleyebilir. Ampirik Bu belirleyin. - Da astrositlerin yapışması durumunu izlemek amacıyla, içine paralel olarak tohumastrosit hücre süspansiyonu standart 96 oyuklu özdeş bir hacim. Bu da 6.5 mm uç ile aynı yüzey alanına (0.33 cm 2) sahiptir ve membran çanağının daha faz-kontrast mikroskobu ile görselleştirme hücreleri daha kolay izin verir. Eğer kontrol astrosit yeterli yapışmasını gözlendiğinde 96-kuyu, astrositler yeterince insert zarı da yapıştırılır var.
- Astrocytes yeterince 96-iyi kontrol yapıştığı zaman, (yukarıdaki nota bakınız) doku kültürü kaputu insert derlemeleri aktarmak ve hafifçe dış silikon tüp ve tıpaları çıkarın. 800 ul / oyuk BEC bakım ortamı (yukarıdaki bölüm 1.1.2) ihtiva eden birlikte kuyu içine normal (yani dikey) yöne ekler dönün.
2.3. Astrositler yukarıdaki Lüminal Odası'na BECS ekme
Kollajen kaplı lümen yüzeyi üzerine 200 ul ve böcek ö geri Seed 2x10 4 BECSinkübatör içine rts.
2.4. Coculturing
Deney öncesi medya değişim olmadan BEC ortamda 3 gün boyunca SVG / BEC seribaşı ekler Coculture.
3. İnsan BBB Modeli ile Deneme (Gün 3)
- Sırasıyla 600 ul ve serumsuz BECS ortamın 100 ul ile abluminal ve luminal ortam değiştirerek in vitro BBB birinci yıkama hücrelerini teşvik etmek.
- Yine orta luminal aspire ve uyarıcı maddeler ile serumsuz ortamın 100 ul ile değiştirin.
Not: abluminal odasının uyarılması (astrositik bölmesinden in vitro aktive etmek için BBB) gerekli ise, abluminal ortam aspire ve uyarıcı maddeler bulunan serumsuz ortamın 600 ul ile değiştirin. - Lümen stimülasyon 3 x 100 ul gerektiren, yapılırsa, dolayısıyla (üç nüsha, her deney grubu test, biz yeniden seyreltilmesi tavsiye kuyular arasında pipetleme hataları en aza indirmek için, grup başına, serum içermeyen ortam içinde 350 ul) içinde nihai konsantrasyonlara ajanlar.
- Daha önce tarif edildiği gibi ve / veya TEER 13,16,25 ölçümü (ikincisi için biz floresein izotiosiyanat (FITC)-konjügeli albumin kullanın) standart paraselüler ve / ya da etiketlenmiş izleyici 16,24 arasında transsellüler geçirgenlik deneyleri yapın.
Geçirgenliği (maksimum%) = (: taban geçirgenlik dalgalanmalara hesaba katılması için deneyler arasında, (maksimum geçirgenlik için bir referans olarak hizmet eder) hücreler olmaksızın kaplanmış bir ekleme için ve aşağıdaki formül kullanılarak araçla tedavi edilen gruba geçirgenliği nispetle değişiklikleri analiz araç grubunun ortalama geçirgenlik değeri) X 100 - araç grubu boş ucu) / (geçirgenlik değeri ortalama geçirgenlik değeri - geçirgenlik deneysel ekin değeri.
4. Gözenekli zarlara Hücrelerinin görselleştirme
nt "> Yorum: insert zarlar üzerinde boyanmamış hücrelerin zar oldukça opak ve ışık iletimi engelleyen beri faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ile gözlemlemek zor olan biz hücrelerin çeşitli boyama yöntemleri geliştirmiştir bu konu ile ilgilenmek için. büyük zar üzerinde hücre görünümünü güçlendirmektedir. hala kuyularda, ekin bağlı iken. Zarlar, sadece montaj amaçlar için boyama işlemi sonunda çıkarılmalıdır Genel olarak, uç membranlar leke ekler.4.1. Hematoksilen Boyama
- 20 dakika için, fosfat-tamponlu salin (130 mM NaCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2 PBS) (w / v) paraformaldehit (PFA), buz soğukluğunda% 4 ile ekler düzeltildi. PBS içinde bir kez yıkayın.
- 2 dakika boyunca% 0.1 Mayer hematoksilin çözelti içinde ekleme daldırın.
- Yavaşça ins daldırarak (musluk suyu ile yıkayın elemanınıBir kabı içeren musluk suyunda ert ve hafifçe) fazla suyu dışarı pipetleme. İstenilen mavi renk gelişene kadar 20 sn ~ için Scott'ın musluk suyu çözeltisi (2 g / L NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) için ekleme aktarın. Musluk suyu (bölüm 4.1.3) ile tekrar insert yıkayın. İsteğe bağlı bir eozin boyama, bir musluk suyu yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 1 çözeltisi içinde eosin ekleme daldırılarak burada dahil edilebilir.
- Insert membran hava-kurutun. (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve aydınlık alan görüntüleme için bir cam slayt üzerine monte
Not: di-N-butylphthalateinxylene (DPX) montaj orta kullanıldığı takdirde membran ayrılması ve monte etmeden önce, ksilen, ardından% 100 etanol ile ekleme yıkayın.
4.2. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)
- Buz soğukluğunda% 4 ile uçlar saptamak (ağırlık / hacim) 20 dakika boyunca PBS içerisinde PFA. PBS içinde üç kez yıkayın.
- 30% 1 dakika (w / v için membranlar Post-fixMQH 2 O'da) ozmiyum tetroksit
- , Su (bölüm 4.1.3) içinde uçlar yıkayıp (zaman birimi için 10 dakika boyunca% 100 etanol ile 3 kez daha sonra% 50,% 70, her biri 5 dakika için% 90) giderek artan bir etanol gradyanı içinde kurutmak.
- Etanol (01:02 sonra 02:01 5 dakika boyunca) heksametildisilazan (HMDS) içeren bir karışım ile susuz tedavi ekler.
- 5 dakika, kurutulmuş koşullarında hava-kuru ve mağaza için 100% HMDS'nin ile ekler davranın.
- (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak. Taramalı elektron mikroskobu ile membranlar inceleyin.
4.3. İmmünofloresan
- (W / v) PBS içinde 20 dakika boyunca PFA, (, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 um filtre TBS) Tris-tamponlu tuzlu su içinde bir kez yıkayın buz soğukluğunda% 4 ile uçları düzeltildi.
- 26, daha önce tarif edildiği gibi uç zar üzerinde hücrelerin immün yapın.
- (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve ag üzerine montefloresan montaj ortamına ile kız slayt. Floresan mikroskop ile membran inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu endotel hücreleri 14,15,27,28 ile temas için astrosit uç feet geçişine izin vermek için gösterilen 3 mikron gözenek büyüklüğü ile gözenekli zarlar üzerinde SVG açıklığı ve BECS yetiştirmek için olan bir insan, temas BBB model kurmak için. Tam temas modelinin şematik bir temsili, Şekil 1 (resim sol) 'de gösterilmiştir. Bir iletişim sistemi tarafından sunulan temel teknik sorun, zarın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositler tohum ihtiyacıdır. Biz lümen içine sokulan ek bir silikon fişi (Şekil 2) ile ortam sızmasını önlerken, esas olarak abluminal zar yüzeyi üzerine de, çıkarılabilir bir silikon oluşturarak bu görev bilmiştir. Yöntem, daha sonra güçlü bir minimal hücre kaybı ile gözenekli yüzeye bağlı oldu ki, SVG açıklığı optimal kesintisiz tohumlama süre (en az 4 saat) bırakıldı. Nitekim, 3 gün SVG lezyonu ve BECS uygulaması hem post-ekimkonfluent kulaklı ve hematoksilen-lekeli ekler görüntüleri değerlendirildiği gibi (bkz. bölüm 4.1, Şekil 3A, sol paneller), üniform membran kaplı. Ayrıca, her iki hücre tipleri gözenekli membran üzerinde hücreye özel markörlerin (• Şekil 3A, sağ paneller bir yaygın boyama SVG açıklığı 22 glial fibriler asidik protein deseni ve BECS in Wiebel-Palade organları ve sitoplazmik veziküllerinde von Willebrand faktörü ifade) muhafaza imünofosfor (bölüm 4.3) tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, SEM görüntüleme dan (bölüm 4.2) bu SVG lezyonu ve BECS membran gözenekleri (Şekil 3A, orta paneller, ok başları), yapay in vitro BBB fiziksel bariyer işlevine katkıda bulunan bir olgu üzerinden doğrudan büyüme yeteneğine sahip olduğunu belli oldu iletişim 3,28 modelleri1. İşlevsel olarak, SVG lezyonu varlığında floresan albumin 28 impro endotel geçirgenlik değeri (Pe) 16,24 intek başına BECS için ved-4 katlık göreli bir (P <0.01, n = 4), 0.574 ± 0.199 x10 -3 sırasıyla olmadan ya astrositler (SVG açıklığı) ile x10 -3 cm / dakika 0,028 ± 0,126 arasındadır. Bu albümin Pe sonuçlar sıçan C6 glioma hücreleri 29 ile fare BECS kullanarak başka çalışmada karşılaştırılabilir. Bizim tohumlama protokolü başarılı bir şekilde, aynı zamanda primer fare BECS ve 1 um gözenek üzerinde büyümüş primer fare astrositler taze izole uygulanmıştır. Bu fare iletişim modelinde biz küçük hidrofil izleyici sodyum floresein için makul bir fiziksel bariyer elde (Pe = 0.83 ± 0.22 x10 -3 cm / dk; n = 3). Böylelikle, tohumlama yöntemi diğer türlerden BBB modelleri hazırlanması için uzatılabilir.
Bir kişi BBB modelinin en temel özelliği, fiziksel olarak endotel hücreleri irtibata membran gözenekleri sayesinde onların sonu ayakları proje Astositlerin yeteneğidir. Birkaç çalışmalar kimliklerini için taramalı elektron mikroskobu kullandıhaklı göstermeye çalışıyorlar astrositlerden ve AK arasındaki temas 14,15,27 makul olduğunu ilkesinin bir kanıtı olarak, luminal yüzeye (astrocytes numaralı seribaşı) abluminal membran yüzeyinden geçmesi süreçleri Astrositler. Biz abluminal yüzeyinde SVG lezyonu tohumlama sonra SEM tarafından lümen zarı görüntülü bu çalışmaları takiben. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, astrositik (SVG) end-feet kontakt potansiyel SVG açıklığı ve BECS bu boyutta gözenekleri üzerinde tohumlandı arasında var olabilir teyit luminal bölmesine 3 um gözenekler geçen gözlenebilir. Topluca, bizim tohumlama yöntemi, basit, verimli ve otantik bir iletişim BBB modeli vermiştir.
Biz BBB, t-PA, bir fibrinolitik ajan etkisini araştırmak için insan iletişim BBB modelini kullanmıştır. Makalelerin bir dizi t-PA, akut iskemik inme 30-33 tedavisi için damar içine uygulama sırasında BBB açılmasını teşvik etmek mümkün olabileceğini düşündürmektedir. T-PA ve BBB arasındaki bu etkileşim, t-PA-kaynaklı trombolizle 4,34,35 ile ilişkili kanamaya katkıda bulunmak ve böylece güncel araştırma çabaları için bir konudur olabilir. In vitro Çalışmalarımız t-PA gerçekten bir konsantrasyona (Şekil 4A) 'de olduğu gibi BBB geçirgenliğini artış olduğunu doğruladı ve farmakolojik olarak uygun olan aralık 36,37 her ikisi de, zamana-bağlı şekilde (Şekil 4B). Ayrıca, SVG astrositlerde dramatik morfolojik değişimler gözenekli zarlar t-PA Astrositik tepkiler t-PA-kaynaklı BBB açılmasını altında yatan düşündüren, t-PA (Şekil 4C) maruz yayınlamak görülebiliyor. Kuvvetli ve geniş spektrumlu proteaz plazmin içine -, doğal alt-tabaka - Daha sonraki inceleme t-PA plazminojen aktivasyonu yoluyla astrositleri uyarır belirlenmiştir. Bundan başka, t-PA ve plazmin astrositler sinyalleşme Rho-kinaz (ROCK) ve blokaj aktive ettiği bulunmuştur ROCK yolunun t-PA-kaynaklı BBB açıklığı 28 engelledi. Bu BBB modellerin kullanımı yeni biyolojik süreçler ve tedavi olanaklarının belirlenmesine yol nasıl iyi bir örnektir.
Şekil 1. In vitro BBB modelleri eklemek tabanlı yapılandırmaları. Vitro BBB modellerde (akış olmadan) statik şematik gösterimleri. Temel modellerinde beyin endotel hücreleri (EC, turuncu) (sarı), gözenekli bir zar üzerinde tek başına kültürlenmiştir. Daha gelişmiş yaklaşımlar EC astrositlerde (yeşil) ile kültüre edilir. Astrositler kuyu (sağ) altındaki ya da temas koşulları (sol) 'de gözenekli membranın ablüminal yüzeyi üzerinde, ya da temassız şartlarında yetiştirilebilir.nk "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Bir temas BBB modelinin hazırlanması için abluminal membran yüzeyinde astrosit tohumlama için geliştirilmiş bir yöntem. (A) parçası, ters döner silikon tüp ("dış boru"), kısa bir parçasıdır çevresi etrafında monte edilmiş ve bir silikon fiş monte luminal boşluğu. Bu tertibat abluminal yüzeyinin üzerinde bir kuyu oluşturur ve gözeneklerden sızmasını ortam engeller. Hücreler, kuyu içinde tohumlandı ve (sağ) (B) silikon fiş bir conta konisi ile bir ucunda sızdırmaz silikon tüp ("iç boru") başka bir parça, hazırlanır uzun bir süre için rahatsız yapışmaya bırakıldı ulaşılabilen bu boşluk içine sokulur. (C) sonra, tohumlumonte ekler kontaminasyon riskini en aza indirmek için (bir levha diğeri üzerinde ters) iki adet 6-kuyu plakalar arasında taşınmaktadır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. . Beyin endotel hücreleri (BECS) ve 3 mikron gözenekli zar A) Hematoksilen (sol panel), taramalı elektron mikroskobu (SEM üzerine astrositlerde görselleştirilmesi, abluminal yüzeyinde orta paneller) ve SVG açıklığı immünofloresan görüntüleri (sağ panel) (40.000 coculturing olmadan 3 gün boyunca 3 mikron gözenekli zar () üzerinde yetiştirilen 6.5 mm uç, üst paneller) ve BECS (kollajen 20.000 6,5 mm uç başına I kaplı, luminal yüzey, alt paneller) başına. Her iki hücre tipleri bu sefer fra içinde izdiham ulaşmakme ve zar üzerinde (BECS Sağ paneller için Wiebel-Palade organlarında SVG ve von Willebrand faktörü (vWF) için glial fibriller asidik protein (GFAP)), hücre spesifik işaretleyicileri korumak. Oklar hücre çekirdeği temsil ederken, ayrıca, doğrudan üzerinde büyür ve gözeneklerin karşılamak için her iki hücre türlerine yeteneğini gösteren SEM panellerde başlarını ok. SEM görüntülerinde Ölçek çubukları 25 mikron (üst) veya 20 mikron (alt) temsil eder. Immünfloresans Görüntülerde Ölçek çubukları 40 um temsil. (B) lümen (BEC) abluminal membran yüzeyinde SVG lezyonu (yalnız) yüzey 3d sonrası tohumlama içine 3 mikron gözenekleri geçerek SVG sonu ayakları SEM görüntüleri. Bu görüntüler insan BBB modelinde SVG lezyonu ve BECS arasında gerçek temas gelişme potansiyeli doğrulamak. Ölçek çubukları sağ panelde sol panel ve 12 mikron 6 um temsil. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. BBB geçirgenliğinde doku-tipi plazminojen aktivatörü (t-PA)-aracılık ettiği artışı astrositlerin morfolojik değişiklikler ile tahrik edilir. (A) artan t-PA konsantrasyonları 24 saat sonra değerlendirildi vitro BBB insan ve geçirgenlik luminal odasına ilave edildi Daha sonra abluminal odasına floresan albümin geçişi ile. t-PA, konsantrasyona bağımlı bir şekilde BBB geçirgenliği artmıştır. n = 4-6, tüm gruplar ancak t-PA 10nM, n = 2 için. *** P <0.001, Newman-Keuls post hoc ile ANOVA. (B) t-PA (1 uM) 'de insan luminal bölmesine eklenmiş bir arada diğer tüm gruplara göregeçirgenlik tarhiyat öncesi 8 saat ve 24 saat için BBB vitro. Gösterildiği üzere, t-PA-aracılı BBB açma zaten önemli 8 saat sonrası uyarım (24 saat sonra maksimum% 70,26) ama bir başka artış 24 saat sonra gözlenmiştir. n = 6, *** P <0.001, ** p <sıfıra 0.01compared bir arada Newman-Keuls ile ANOVA post hoc. Hem (A) ve (B), bar / veri noktaları ± SEM. (C) polyester uç zarlarında Hematoksilen-lekeli SVG lezyonu (üst paneller) veya SVG lezyonu (alt panel) taramalı elektron mikrografiğine Temsilcisi parlak alan görüntüleri (3 um gözenek boyutu) bir araç ya da t-PA (1 uM) ile 24 saat sonrası tedavi. Telaffuz t-PA-bağlı morfolojik değişiklikler ve SVG tek tabaka bütünlüğünün bozulması t-PA için astrositik tepkileri BBB geçirgenliği t-PA etkisini altında yatan düşündüren, gözlemlenebilir. Görüntüler, iki bağımsız deneyin temsilcisidir. SEM görüntülerinde Ölçek bar Repre61 mikron (sol) veya 120 mikron (sağda) gönderdi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin patolojileri içine Tıbbi araştırma çok öteleme zorluk çekiyor. Akut iskemik inme alanında, örneğin, hayvan modellerinde büyük söz gösterdi birçok ilaç klinikte 38,39 başarısız oldu. Bu hayal kırıklığı yaratan sonuçlar için nedenleri çeşitlidir ve insan inme senaryo ve hayvan çalışmaları 21 elde edilen sonuçların abartı için klinik öncesi test sistemleri aldatma içerir. Klinik faz klinik öncesi bulgular öngörü değerini artırmak için bir strateji ek geliştirme, insan hücre tabanlı vitro modellerde; Bu yeni ilaçlar ve mekanizmaları tarama için güçlü ve maliyet-etkin araçları sağlamak ve daha iyi bir klinik ile ilgili caddeleri üzerinde duruluyor izin verebilir 21. Bu bağlamda, biz burada detaylı olarak tarif insan ölümsüzleştirdiği astro yeni bir kombinasyonunu kullanan bir insan temas BBB modelinin kurulması için laboratuvarda yürütülen süreçcytes (SVG lezyonu) ve inme ile ilgili olayların incelenmesi için insan primer BECS.
(Akış olmadan) statik şartlar altında, (Şekil 1) en iyi in vivo anatomik yapısını andıran BBB modelleri iletişim ve bariyer özellikleri 13,17,18 üstün olduğu gösterilmiştir. Önemlisi, BECS ve astrositlere arasında gerçek kişi sadece Astrositik uç ayak ve sıkı (daha az geçirgen) BEC monotabakaların 14,15,27 sonraki indüksiyon geçişine izin geniş gözenek çapına (≥ 1 mikron), membranlar üzerinde oluşur. Ancak, daha yüksek gözenek boyutu ile ters uçlar üzerinde astrositlerin tohumlama - bir kontak BBB modeli hazırlanmasında temel teknik eleman - sınırlı bir vasat hacminde ek olarak ters 6.5 mm ilave edilebilir, çünkü bir çift teknik bir engel oluşturmaktadır uçlar (~ 50 ul), zarlar aynı zamanda nedeniyle büyük gözenek çapı orta sızıntı yatkındır. Bu sınırlamalar AST yapabilirsinizrocytic tohumlama garip ve tutarsız.
3 mikron gözenekleri ile ters ekler üzerinde astrositleri tohumlama için yenilikçi tekniği bu işlem için basit ama etkili bir çözüm sunuyor. Abluminal yüzeyinin üzerinde de taşınabilir, geçirimsiz bir silikon oluşturarak büyük ölçüde başarılı bir gözenekli membrana yapıştırmak için astrositleri yeteneğini geliştirilmiştir. Bu ablüminal yüzeyinde astrosit tek tip büyüme sağlayan ve izin verir (örneğin, BBB 28 beş farklı plazminojen aktifleştirici etkisinin Yakın zamanda gerçekleştirilen tarama) bir çok deneysel parametrelerin aynı anda tarama için uçlar arasında bir sayıda tekrarlanabilir hazırlanması. Bu nedenle, sadeliği rağmen, biz ölçüde bu iletişim BBB modeli kullanarak bizim araştırma verimini ve kalitesini artırmak için bir yöntem buldu. Bizim Astrosit tohumlama yönteminin bir sınırlama ince liman ekler, (10 μ ekstra elle kullanım için gerekliliktirm kalınlığında) membranlar. Aşırı veya kaba işleme mikro gözyaşları ve membran zarar verebilir. Montaj / demontaj minimum kuvvet ile yapılması gereken olduğu gibi Dolayısıyla, yumuşak ve esnek bir silikon boru kullanımı gereklidir.
Kendi genel amaçları ile ilgili olarak, insan BBB model başlangıçta primer insan hücreleri kullanılan, daha önce tarif edilen protokol 14,23 göre kurulmuştur. BBB modelleme için kendi üstünlüğüne rağmen, birincil insan beyin hücrelerinin istihdamında bir dezavantajı rutin birincil BECS ve astrositlerden ve / veya ticari olarak elde dahil maliyetinin düzenli üretimi için canlı bir insan beyin dokusunun erişmek için yetersizliğidir. Birçok BBB modellerinin başarıyla (sıçan C6 glioma hücreleri 29 ile örneğin) ölümsüzleştirdi astrositlerde ilköğretim astrositleri yerine bu yana, bir roman, insan BBB modelleme için bol ve düşük maliyetli bir seçenek olarak SVG astrositlere 22 istihdam makul. Için SVG açıklığı yeteneğiolumlu prensipte BBB çalışmaları için onların uygunluğunu valide BEC bariyer fonksiyonunu etkileyebilir. Buna karşılık, biz vivo 1,2,9 yılında BBB kritik rolü için bizim BBB modelinde birincil BECS tutmak için seçti. Önemli bir şekilde, birincil BECS uzun süreli kültürlenmesi de-farklılaşma ve BBB özgü fenotip bozulmasına neden olabilir. Bu, gerçekten de albümin için oldukça yüksek bir endotelyal geçirgenlik değerleri ile sistemimizde belirgin olabilir. Bu nedenle, biz dikkate onun yüksek bazal geçirgenliği alarak, çoğunlukla göreceli bir şekilde 28 (Şekil 4) bizim modelini kullandık. Çok sıkı bir insan BEC tek tabaka isteniyorsa bariyer fonksiyonu, bundan başka, glukokortikoid hidrokortizon 17 ya da 13, fosfodiesteraz inhibitörleri siklik AMP gibi kimyasal ilavesi ile iyileştirilebilir. Bu tür hCMEC/D3 hücre hattı 40 gibi ölümsüzleştirilmiş insan Becs, aynı zamanda daha iyi ti muhafaza etme kabiliyetleri için hesaplanan olabilirzamanla GHT kavşaklar. Yine de, BEC hücre hatları, genellikle, düşük geçiş birincil BECS 41,42 kıyasla azaltılmış bariyer önem taşır ve dikkatli bir şekilde, çünkü diğer potansiyel değişiklikler (hücre-yüzeyi reseptörlerinin yani değişmiş ekspresyonu) arasında dikkate edilmesi gerekmektedir.
Toplu olarak, (SVG açıklığı yani iş) astrositik hücre tipi ve astrosit tohum protokole önemli bir iyileşme yanı modifikasyonu üretilebilir, montajı kolay ve otantik insan temas BBB modeli elde edilmesiyle sonuçlanmıştır. Akılda sınırlamaları taşıyan bu sistem, biz burada 28 örneklediği gibi, akut iskemik inme değil sadece in vitro incelenmesi için yararlı bir araç olarak hizmet değil, aynı zamanda BBB modülasyonu içeren diğer birçok beyin patolojileri olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (hibe # 606658) den RLM verilen hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
References
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
- Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
- Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
- Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
- Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
- Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
- Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
- Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
- Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
- Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
- Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
- Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
- Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
- Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
- Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
- Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
- Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
- Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
- Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
- Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
- Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
- Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
- Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).
