Summary
혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.
Abstract
혈액 - 뇌 장벽 (BBB)은 밀접 뇌 환경을 제어하지만, 불 투과성 적응할 뇌 모세관을 포함한다. BBB의 실패는 임상 관련 연구를 지원하기 위해 체외 BBB 모델에서 인간의 개발에 대한 필요성을 만들고, 많은 뇌 병변의 원인에 함축되어 있습니다. 지금까지 설명한 여러 BBB 모델 중, (흐름)없이 정적, 성상 세포 및 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs가) 다공성 막의 양측에 동시 배양하는 BBB 모델을 문의 시뮬레이션 단순화 아직 확실한 시스템으로 부상 높은 처리량 검사 능력 BBB. 그럼에도 불구하고 이러한 모델의 생성은 몇 가지 기술적 과제를 제시한다. 여기서 우리는 인간의 기본를 BECs 및 불후의 인간의 성상 세포의 새로운 조합을 이용하여 연락처 인간 BBB 모델의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 특히, 세부 반전 삽입에 세포 파종을위한 혁신적인 방법뿐만 아니라이 inser를 지정T 염색 기술과 우리가 BBB 관련 연구에 대한 우리의 모델을 사용하는 방법을 예시.
Introduction
BBB는 말초 혈액 순환과 뇌 지혈 유지에 결정적인 책임 중추 신경계 사이의 특수한 인터페이스이다. 기능적 뇌에 단단하고 역동적 인 게이트웨이를 형성하기 위해 (아래) 몇 가지 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 영향을하는 별개의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs)를 포함한다. 생리적 조건 하에서 BBB는 뇌에 혈액 세포, 혈장 성분 및 유해 물질, 모든 잠재적 신경 독성의 통과를 제한한다. 병행 BBB 선택적 정확하게 뇌 1,2 환경을 유지하기 위해 뇌와 순환 사이 키 이온 및 영양분 (포도당과 아미노산) 및 대사 노폐물을 교환한다. 최근 몇 년 동안은 BBB의 실패는 신경 퇴행성 염증 관련 질환 (예를 들어, 알츠하이머 질환과 multipl과 같은 만성 뇌 병변의 다양한 발생하는 것을 분명 해지고있다전자는 허혈성 뇌졸중 4와 같은 심각한 상황뿐만 아니라,)는 각각 3 경화증.
뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs)의 독특한 BBB 속성은 크게 자신의 대뇌 환경 (5)에 의해 유도, 특히 성상 세포 6,7로됩니다. 다른 이러한 혈관 주위 세포 08 뉴런과 마이크로 글 1,3 세포 유형뿐만 아니라, 기저막 (9),를 BECs을 지원 기능 유닛이 "신경 혈관 유닛"(NVU)를 지칭 함께 형성하는 성장 이해있어 동시에 부부는 공급 모세 혈관 10 신진 대사 요구를 신경.
병적 인 상황에서 BBB의 참여 BBB 관련 연구 11, 12을 지원하기 위해 관내 BBB 모델의 개발에 많은 시도를 기초. 이 모델은 NVU의 원리에 따라 생체 BBB 특성에 가깝게 모방하는 것을 목표로하고 있습니다. 체외 (13)으로부터, 인간의 14, 쥐 15, 쥐 16, 17, 18 및 돼지 유래) 꽉 접합 형성를 BECs의 단층에 다공성 막에서 배양 함께 지원하는 성상 세포와 의존 광범위 ) 델리 등 2005. (11)에 의해 검토.
성상 세포는 배양액 아무런 가용성 요소 (16)를 통해를 BECs와 통신하여 (막의 상면에 재배)를 BECs 분리 잘 조직 배양의 하단에 비접촉 상태에서 성장 될 수있다. 더 나은 생체 내에서 BBB의 해부학 적 구조를 닮은 고급 모델에서, 성상 세포는 접촉 조건과 직접를 BECs 13,15,17 가까이 (그림 1)에서 멤브레인의 반대편에 배양에 유지됩니다. 이 구성은 설립를 BECs 및 성상 세포 사이에 신체 접촉을 가능하게 할 때 성상 프로젝트다공성 막을 통해 자신의 프로세스. 성상 교세포 최종 피트 작은 기공 크기 (즉, 0.4 μM) (14, 15)을 통과 할 수 있기 때문에 중요한 것은, 발생하는 진정한 담당자의 기공은 직경이 1 ㎛를 ≥해야합니다. 특히, 연락처 BBB 시스템은 자신의 트랜스 내피 전기 저항 (봉사자) 및 각종 추적기 13,17,18의 투과도 값에 대한 비접촉 대응에 우수한 것으로 일부 연구에서 입증됩니다. 미디어 흐름의 또 다른 차원은 최근 뇌 혈관 12, 19의 가까운 시뮬레이션을위한 내피 세포에 전단력을 적용 할 수있는 체외 BBB 모델의 숫자에 추가되었습니다.
접촉 BBB 모델을 생성 할 때 극복하는 한 가지 기술적 장애물은 다공성 멤브레인의 abluminal 표면에 중력에 대하여 성상 교세포의 시드이다. 성상 세포는 단순히의 상단에 미디어의 드롭에 씨앗을 품고 있었다 이전 프로토콜 13,20,, 변환 된 삽입, 수 만 짧은 시드 배 적절한 세포 부착에 대한 불충분 우리의 손에서 발견되었다 (즉, 10 분 13 2 시간 20). 이 기본적인 방법을 사용하여, 긴 성상 세포 부착 기간 (온도, pH 및 습도의 변동을 일으키는) 인큐베이터의 빈번한 개폐함에 인서트의 지속적인 모니터링을 필요로 인한 기공을 통한 매체의 누설에도 요철 세포 시딩하는 경향이있다 특히 1 μm의보다 큰 기공을 사용하는 경우.
여기서, 우리는 접촉 BBB 모델의 준비를위한 일반적인 프로토콜을 설명한다. 우리의 절차는 위에서 언급 한 제한 사항을 해결 반전 삽입에 세포 파종을위한 다른 방법을 포함한다. 방법은 장시간 동안, 평형화 인큐베이터에서 abluminal 막 표면 상 교세포의 교란 부착을 허용한다. 결과적으로, 성상 세포의 균일 한 시드가 장벽 품질을 증가시킨다 달성과 인서트 사이의 기초 투자율 변화를 최소화 할 수 있습니다.
인간 세포의 사용은 인간 관련 연구 21 중요하기 때문에, 우리는 또한이 문서에서 인간의 기본를 BECs의 새로운 조합의 특정 사용을 설명하고 높은 처리량 검사 용량 접촉 인간 BBB 모델의 설립을위한 인간의 성상 세포를 불멸 . 다공성 막에 세포를 보는 것은 다공성 막에 합류하고 세포 형태의 결정에 도움을 줄 수 어렵습니다, 우리는 또한 세부 염색 기술이 될 수 있기 때문에. BBB에 - 급성 허혈성 뇌졸중에 대한 유일한 치료 옵션으로 제공하는 응고 파열 효소 - 마지막으로, 우리는 우리 인간의 BBB 모델은 조직 형 플라스 미노 겐 활성제의 영향 (t-PA)를 조사하는 데에 이용 될 수있는 방법을 예시.
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Protocol
1. 세포 배양 (이전 BBB 조립에 3-7 일)
1.1. 차 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs)
를 BECs는 상업적으로 수득 하였다. 세포는 정상적인 인간의 뇌 피질 조직의 디스 파제 해리에 의해 생성 및 통로 (3) (<12 인구 doublings) 냉동 제공되었다.
- 하층 : 제조 업체의 지침에 따라 "첨부 인자"와 코트 조직 문화 선박.
- 세포의 유지 보수 : 혈청이 포함 된 완전한 매체를 BECs을 유지한다. 완전한 무 혈청 배지에서 실험, 문화를 BECs하십시오. 가습 5 % CO 2에서 세포를 유지, 37 ° C에서 21 % O 2 배양기
참고 : DMEM/F-12 15 mM의 HEPES, 10 % (v / v) 소 태아 혈청 (FCS)으로 보충하면서 특수한 시약에 대한 대안으로, 0.1 % (w / v) 젤라틴 용액 도포 시약으로 사용할 수, 2 밀리미터 L-글루타민, 50 μg/ ㎖ 젠타 마이신, 20 ㎍ / ㎖의 헤파린 및 20 ㎍ / ml의 내피 세포 성장 보충 BEC의 유지 보수를 위해 사용될 수있다. - 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:6 1:3 분할 합류를 BECs : 실험에 대한 하위 배양. 3 일마다 유지 보수 매체를 변경합니다. 15 구절를 BECs을 사용합니다.
1.2. SVG 인간 태아 Astroglial 셀 라인
SVG 인간 태아 astroglial 세포 (22)는 원래 복제 결핍 유인원 바이러스 (40)로 형질 전환 된 인간 태아의 두뇌의 차 문화에서 파생되었다.
- 정비 : 20 % (v / v) FCS (그들의 부모 일차 전지 (22)를 유지하는 데 사용되는 동일한 혈청 백분율) 2 ㎜의 L-글루타민, 50 U / ㎖의 페니실린으로 보충 얼의 균형 염 용액과 최소 필수 배지에서 농경 SVG 세포 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신. 가습 된 5 % CO 2, 21 % O 2에서 세포를 유지
- 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:10, 1:5 비율로 분할 합류 SVGs : 실험에 대한 하위 배양. 트립신의 제거로 인해 매체에서 혈청의 높은 내용으로 필요하지 않습니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 최대 20 구절 SVGs를 사용합니다.
2. 인간의 체외 BBB 모델의 조립 및 공동 배양 (0 일)
의견 체외 접촉 BBB 모델은 인간의 수정, 발행 프로토콜 13, 23에 따라 제조된다.
2.1. 삽입의 코팅
- 공급 된 24 웰 플레이트의 우물에서 조직 문화 삽입 (폴리 에스테르 다공성 막과 직경 6.5 mm, 3 ㎛의 기공 크기)를 놓습니다. 삽입의 코트 내강면
참고 : 뇌의 모세 혈관의 기저막은 콜라겐을 포함하지 I하지만 주로 라미닌, 콜라겐 IV 형의 아형, nidogens 및 헤파 란 황산 프로테오글리칸 9. 이러한 이유로, 몇몇 연구자들은 콜라겐 IV, 피브로넥틴 (13) 또는 매트 리겔 더 확실한 BBB 모델링 (BD 바이오 사이언 시즈) (16)와 같은 코팅제를 사용한다.
2.2. 밑면 (Abluminal) 막 표면에 파종 SVGs
- 삽입 전환 부드럽게 다공성 막 탄력있는 실리콘 튜브의 짧은 조각의 테두리에 맞게, 잘 abluminal 표면 위에 기본적으로 새를 만드는 ( "외부 튜브"~ 10mm 길이, 8mm 내경 1.6 mm 벽) (그림 2A).
- 삽입 니의 밑면DS 미디어 누설을 방지하기 위해 밀봉된다. 플라스틱 밀봉 원뿔 일단 밀봉 먼저, (도 2B;; ~ 8mm 길게, 3.2 mm, 내경 1.6 mm의 벽 "의 내부 튜브"라고) 실리콘 튜브로 이루어지는 플러그 (도 2A 및 2B)을 제조 (~ 3mm 긴; 0.2 ㎖의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 바닥 절삭에 의해 제조;도 2b 참조).이 원뿔 내부 튜브 내강을 밀봉, 또한 인서트에 타이트한 피팅 가장자리 넓혀 아닙니다. 그것은 막에서 최대 - ~ 1-2mm (그림 2A)에 도달 할 때까지 다음, 멸균 집게를 사용하여 내강 공동 사전 그것으로 실리콘 플러그를 삽입합니다.
- 다음, 200 ㎕의 SVG 유지 보수 매체에서 4 × 10 4 SVG 세포 (종자 자체의 ction의 위 1.2.2) 직접 잘 abluminal 막 표면 위의 실리콘 (그림 2A)로. SVGs가 인큐베이터에서 최소 4 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
주 : 무균 두 개의 6 - 웰 플레이트 (다른 것에 반전 한 접시, 그림 2C) 사이에 조립 삽입을 수송 유지하기 위해 절차를 수행하는 동안 여과되지 않은 공기에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 실리콘 튜브 및 플러그는 에탄올에 세척하고 나중에 사용하기 위해 멸균된다.
참고 : 사용 플러그 만 막 기공과 인서트 (2.2.2)이 1 μm의보다 큰 크기. 1 μm의 ≤ 공경 막은 거의 누출되지 않고 외부 실리콘 튜브 (2.2.1) 만 피팅이 필요합니다. 또한, 콜라겐 이외의 코팅제는 I (2.1 절 주 참조)도 3 ㎛의 기공을 통해 leakiness를 방지 할 수 있습니다. 경험적으로이 문제를 확인합니다. - 당신 성상 세포의 부착 상태를 모니터하기 위해, 병렬로 씨앗성상 세포의 세포 현탁액의 표준 96 - 웰 동일한 볼륨. 이 우물은 6.5 mm의 삽입과 같은 표면적 (0.33 cm 2)이며 삽입 막보다 위상차 현미경으로 세포를보다 쉽게 시각화를 허용합니다. 당신이 컨트롤의 성상 세포의 충분한 준수를 관찰하면 96도, 성상 세포가 적절하게 삽입 막에 또한 준수했다.
- 성상 세포는 충분히 96 - 웰 컨트롤에 부착 한 경우, (위의 주 참조) 조직 문화 후드에 삽입 어셈블리를 전송하고 부드럽게 외부 실리콘 튜브 및 플러그를 제거합니다. 800 μL / 잘 BEC 유지 보수 매체 (위의 섹션 1.1.2)을 포함하는 공급 우물에 정상 (즉, 수직) 방향으로 삽입을 반환합니다.
2.3. 성상 위의 내강 상공 회의소에를 BECs의 시드
콜라겐 코팅 내강 표면에 200 μL와 INSE을 반환 씨 2 × 4를 BECs인큐베이터에 RTS.
2.4. 공동 배양
실험 전에 미디어의 변화없이 BEC 매체 3 일 SVG / BEC 시드 삽입 공 배양.
3. 인간 BBB 모델 실험 (3 일)
- 각각 600 μL 및 혈청를 BECs 매체의 100 μL로 abluminal 및 내강 미디어를 대체하여 체외 BBB 첫 번째 세척 세포를 자극합니다.
- 다시 내강 매체를 대기음 자극 에이전트와 혈청 배지 100 μL로 교체합니다.
참고 : abluminal 챔버의 자극이 (성상 세포 구획에서 체외 BBB를 활성화하기 위해) 필요한 경우, abluminal 매체를 대기음 및 에이전트를 자극으로 혈청 배지의 600 UL로 교체. - 내강 자극이 3 × 100 μl를 요구하는 수행하는 경우, 따라서 (세중 각 실험 그룹을 테스트, 우리는 다시 희석 권장 우물 사이에 피펫의 오류를 최소화하기 위해 그룹 당 혈청 배지 350 μL)의 최종 농도 에이전트.
- 전술 한 바와 같이 및 / 또는 봉사자 13,16,25 측정 (후자 우리는 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) - 결합 된 알부민을 사용) 표준 세포층 및 / 또는 표시 추적자 16, 24의 세포 횡단 투과성 분석을 수행합니다.
투자율 (최대의 %) = (: 초기 투자율의 변동을 고려하여 실험 사이 (최대 투자율에 대한 참고가) 세포없이 코팅 된 인서트와 식을 이용하여 차량 투여군 투과성 상대적인 변화를 분석 비히클 군의 평균 투과도 값) X 100 - 차량 기 블랭크 인서트) / (투자율 값의 평균 투과도 값 - 투과성 실험 인서트의 값.
4. 다공성 막에 세포의 시각화
NT "> 코멘트 : 삽입 세포막에 흠 세포는 세포막이 매우 불투명하고 빛의 투과를 방해하기 때문에 위상차 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경으로 관찰하기 어려운 우리가 세포의 다양한 염색 절차를 개발 한이 문제를 처리하기 위해. 크게 막에 세포 모양을 향상시킬 수 있습니다. 여전히 우물에서 삽입에 붙어있다. 세포막은 설치 목적을 위해 염색 과정의 끝에서 제거해야합니다 일반적으로 삽입 세포막을 얼룩 삽입.4.1. 헤 마톡 실린 염색
- 20 분, 인산염 완충 생리 식염수 (130 mM의 NaCl을, 10 mM의 나 2 HPO 4, 10 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2 PBS)에서 (w / v)의 파라 포름 알데히드 (PFA) 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다. PBS에 한 번 씻으십시오.
- 2 분 동안 0.1 % 메이어의 헤 마톡 실린 용액에 삽입 잠수함.
- 조심스럽게 기능을 잠수하여 (수돗물로 삽입을 씻어비커에 들어있는 수돗물에 ERT 부드럽게) 과잉의 물을 피펫. 원하는 블루 색상이 개발 될 때까지 20 초 ~를위한 스콧의 수돗물 솔루션 (2 G / L 탄산 수소 나트륨, 20g / L 망초)에 삽입을 전송합니다. 수돗물 (4.1.3)으로 다시 삽입을 씻으십시오. 옵션 에오신 염색은 수돗물 세척 한 다음 10 초 동안 1 % 에오신 용액에 삽입을 찍기에 의해 여기에 도입 될 수있다.
- 삽입 막을 공기 건조. (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 시야의 이미징을위한 유리 슬라이드에 마운트
주 : 디-N-butylphthalateinxylene (DPX) 설치 매체가 활용되는 경우가 막을 제거하고 설치하기 전에 크실렌 다음에 100 % 에탄올로 삽입을 씻어.
4.2. 주사 전자 현미경 (SEM)
- 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 수정 (W / V) 20 분 대한 PBS에 PFA. PBS로 세 번 씻으십시오.
- 30 1 %의 분 (W / V의 세포막을 사후 수정MQH 2 O.에서) 오스뮴
- 물 (4.1.3)에 삽입을 세척하고 (간격 당 10 분 동안 100 % 에탄올로 3 배 후 50 %, 70 %, 5 분 각 90 %) 점점 더 커지고있는 에탄올 그라데이션에 탈수.
- 에탄올 (1시 2분 다음 2시 1분 5 분) : 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 혼합물로 탈수 삽입을 처리합니다.
- 5 분, 건조 된 상태에서 자연 건조 및 저장을위한 100 % HMDS로 삽입을 처리합니다.
- (막 가장자리 주위에 절단) 메스를 사용하여 막을 제거합니다. 주사 전자 현미경에 의해 세포막을 검사합니다.
4.3. 면역 형광
- (V / W) PBS에 PFA는 20 분 동안, (, 50 MM 트리스 - 염산의 pH 7.6, 154 mM의 염화나트륨, 0.22 μm의 여과 TBS) 트리스 완충 식염수에 한 번 씻어 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다.
- 이전 26 설명한대로 삽입 막에 세포의 면역 염색을 수행합니다.
- (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 AG에 마운트형광 설치 매체와 아가씨 슬라이드. 형광 현미경으로 멤브레인을 검사합니다.
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Representative Results
우리는 내피 세포 14,15,27,28과 접촉 성상 세포의 최종 피트의 통과를 허용하는 것으로 3 ㎛의 기공 크기, 다공성 막에 SVGs과를 BECs을 연마했다 인간, 연락처 BBB 모델을 수립하기 위해. 전체 연락처 모델의 개략도는 그림 1 (그림 왼쪽)에 설명되어 있습니다. 연락처 시스템에 의해 제공되는 주요 기술적 과제는 멤브레인의 abluminal 표면의 중력에 성상을 시드 할 필요가있다. 우리는 내강 공동에 삽입 추가 실리콘 플러그 (그림 2)와 미디어의 누설을 방지하면서 주로 abluminal 막 표면 위에 잘 이동할 수있는 실리콘을 만들어이 작업에 성공했다. 상기 방법은 교대로 강하게 최소 셀 손실 다공성 표면에 부착되었고, 이는 SVGs의 최적 중단 시딩 기간 (적어도 4 시간)를 허용했다. 실제로 3 일 SVGs과를 BECs 응용 프로그램을 모두 포스트 뿌리기합류를 귀있는 헤 마톡 실린 염색 삽입의 이미지에서 판단으로 (4.1 절 참조; 그림 3A, 왼쪽 패널), 균일 막에 덮여있다. 또한, 두 종류의 세포는 다공성 막에 자신의 휴대 특정 마커 (; 그림 3A, 오른쪽 패널 확산 염색 SVGs 22 아교 섬유 성 산성 단백질의 패턴과를 BECs에 Wiebel-Palade 기관 및 세포질 소포에있는 폰 빌레 브란트 인자의 발현을) 유지 , 면역 형광 (4.3 절)에 의해 관찰했다. 또한, SEM 영상에서 (4.2)는 SVGs과를 BECs가 막 기공 (그림 3A, 중간 패널, 화살표 머리), 인위적으로 체외에서 BBB의 물리적 장벽 기능에 기여하는 현상에 직접적으로 성장 할 수 있었다 명백하게되었다 접촉은 3,28를 models1. 기능적으로, SVGs의 존재 형광 알부민 28 impro의 투과도 값 (PE) 16, 24에혼자를 BECs에 VED는 3 ~ 4 배의 상대 (P <0.01, N = 4), 0.574 ± 0.199 10 배 -3 각각없이 또는 성상 세포 (SVGs)와 10 배 -3 cm / 분 0.028 ± 0.126까지. 이 알부민 체육 결과는 쥐 C6 신경 교종 세포 (29) 마우스를 BECs을 사용하여 다른 연구와 비교합니다. 우리의 파종 프로토콜이 성공적으로 또한 기본 마우스를 BECs 1 μm의 기공에 성장 기본 마우스 성상 세포를 갓 고립에 적용 하였다. 이 마우스의 접촉 모델에서 우리는 작은 친수성 추적 나트륨 형광을위한 합리적인 물리적 장벽을 획득 (PE는 = 0.83 ± 0.22 배 -3 cm / 분, N = 3). 따라서, 우리의 파종 방법은 다른 종으로부터 BBB 모델의 제조에 대해 확장 될 수있다.
연락처 BBB 모델의 가장 기본적인 기능은 물리적으로 내피 세포에 문의 멤브레인 기공을 통해 최종 발을 투사하는 성상 세포의 기능입니다. 몇몇 연구는 iDEN 방법으로 주 사형 전자 현미경을 살린tify은 성상 세포와 EC 사이의 접촉은 14,15,27 그럴듯한 것을 원칙의 증거로, 내강 표면에 (성상 세포는 씨앗을 품고있다) abluminal 막 표면에서 전달 프로세스를 성상. 우리가 abluminal 표면에 SVGs 파종 후 SEM에 의해 내강 막을 이미지 한이 연구를 다음과 같습니다. 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 성상 교세포 (SVG) 최종 피트는 접촉이 잠재적으로 SVGs과를 BECs이 차원의 구멍에 시드 사이에 존재할 수있는 확인, 내강 실에 3 ㎛의 구멍을 통과 관찰 할 수있다. 공동으로, 우리의 파종 방법은 간단 효율적이고, 본격적인 접촉 BBB 모델을 얻었다.
우리는 BBB에서, t-PA, 혈전 용해 에이전트의 효과를 탐구하는 우리 인간의 접촉 BBB 모델을 사용했다. 기사의 숫자는 t-PA는 급성 허혈성 뇌졸중 30-33의 치료를 위해 자사의 정맥 내 투여시 BBB의 개방을 유도 할 수 있습니다 것을 제안했습니다. t-PA와 BBB 사이의 상호 작용은 t-PA에 의한 혈전 4,34,35과 관련된 출혈 합병증에 기여하고, 따라서 현재의 연구 노력에 대한 될 수 있습니다. 체외에서 우리의 연구는 t-PA는 참으로 농도 (그림 4A)에 그대로 BBB의 투과성을 증가 확인 및 약리학 관련 범위 (36, 37)에서 모두 있었다 시간 의존적으로 (그림 4B). 또한, SVG의 성상 세포의 극적인 형태 학적 변화는 다공성 막을 t-PA에 성상 세포 반응은 t-PA에 의한 BBB 개방을 기초 것을 제안, t-PA (그림 4C)에 대한 노출을 게시에 관찰 할 수 있습니다. 강력하고 광범위한 스펙트럼 단백질 분해 효소 플라스에 - 자연 기판 - 후속 조사는 t-PA는 플라스 미노 겐 활성화를 통해 성상 세포를 자극하는 것을 확인했다. 또한, t-PA 및 플라스는 성상 세포에 신호 RHO-키나제 (ROCK)과 봉쇄를 활성화하는 것으로 확인되었다 ROCK 경로의 t-PA에 의한 BBB의 개구부 (28)를 방지. 이 BBB 모델의 활용은 새로운 생물학적 과정 및 치료 기회의 식별로 이어질 수있는 방법의 좋은 예입니다.
그림 1. 체외 BBB 모델의 삽입 기반의 구성. 체외 BBB 모델에서 (흐름)없이 정적의 도식 표현. 기본 모델에서 뇌 혈관 내피 세포 (내피, 오렌지) (노란색) 다공성 막에 혼자 배양. 고급의 접근 방식의 내피는 성상 세포 (녹색)와 공 배양된다. 성상은 잘 (오른쪽)의 바닥에, 또는 접촉 조건 (왼쪽)의 다공성 멤브레인의 abluminal 표면에, 어느 비 접촉 조건에서 재배 할 수있다.NK "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 접촉 BBB 모델의 제조 abluminal 막 표면 성상 세포 시딩을위한 개선 된 방법. (A) 삽입은 반전 실리콘 호스 ( "외부 튜브")의 짧은 조각은 그 둘레에 조립되며, 실리콘 플러그에 끼워 내강의 공동. 이 어셈블리는 abluminal 표면 위에 잘 만들고 구멍을 통해 유출되는 미디어를 방지 할 수 있습니다. 셀 웰에 시딩 (오른쪽) (B) 실리콘 플러그 밀봉 콘 일단 밀봉 실리콘 호스 ( "내부 튜브")의 다른 조각,로부터 제조되는 장시간 동안 교란되지 않은 접착을 허용 할 수있는 그 구멍에 삽입됩니다. (C)는 일단 시드조립 삽입은 오염의 위험을 최소화하기 위해 (한 접시가 다른 것에 반전) 두 개의 6 - 웰 플레이트 사이에 전송된다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. . 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs)와 3 ㎛의 다공성 막 A) 헤 마톡 (왼쪽 패널), 주사 전자 현미경 (SEM에 성상 세포의 시각화, abluminal 표면에 중간 패널) 및 SVGs의 면역 형광 이미지 (오른쪽 패널) (40,000 공동 배양없이 3 일 동안 3 μm의 다공성 막 ()에 성장 6.5 mm 삽입, 상단 패널)과를 BECs (콜라겐 20,000 6.5 mm 당 삽입 I-코팅, 내강 표면, 바닥 패널) 당. 두 세포 유형이 시간 FRA 내에서 합류에 도달저와는 막에 (를 BECs 오른쪽 패널 Wiebel-Palade 기관에서 SVG 및 폰 빌레 브란트 인자 (vWF가)에 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)) 자신의 휴대 특정 마커를 유지한다. 화살표는 세포 핵을 나타내는 동안 더 직접 위에 성장 및 기공을 커버하기 두 세포 유형의 기능을 보여주는 SEM 패널에 헤드 화살표. SEM 이미지에 스케일 바는 25 μm의 (상단) 또는 20 μm의 (아래)를 나타냅니다. 면역 형광 이미지에 스케일 바는 40 μm의를 나타냅니다. (B) 내강 (BEC) abluminal 막 표면에 SVGs (혼자)의 표면 3 차원 포스트 시드로 3 ㎛의 구멍을 통과하는 SVG 말 피트의 SEM 이미지를. 이러한 이미지는 우리 인간의 BBB 모델 SVGs과를 BECs 사이의 진정한 접촉의 개발에 대한 가능성을 확인합니다. 스케일 바는 오른쪽 패널의 왼쪽 패널과 12 μm의에 6 μm의를 대표하는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. BBB 투과성 조직 형 플라스 미노 겐 활성제 (t-PA) - 매개 증가는 성상 세포의 형태 학적 변화에 의해 구동된다. (A)이 증가 t-PA의 농도는 24 시간을 평가 하였다 체외 BBB에서 인간과 투자율의 내강 실에 추가 된 나중에 abluminal 실에 형광 알부민의 통과로. t-PA는 농도 의존적으로 BBB 투과성을 증가시켰다. N = 4-6 모든 그룹 만 t-PA는 10nm, N = 2. *** P <0.001 뉴먼-Keuls와 ANOVA는 사후. (B) t-PA (1 μM)가에서 인간의 내강 실에 추가 된 하나의 방법으로 다른 그룹에 비해침투성 평가하기 전에 8 시간 및 24 시간 동안 BBB를 체외. 도시 된 바와 같이, t-PA-매개 BBB 개방은 이미 상당한 8 시간 포스트 자극 (24 시간에서 최대의 70.26 %)했지만, 추가 증가는 24 시간에 관찰되었다. N = 6, *** P <0.001, ** P <제로 0.01compared 하나의 방법으로 뉴먼-Keuls와 ANOVA 사후. 모두 (A)와 (B), 바 / 데이터 포인트는 ± SEM을 의미 나타냅니다. (C) 폴리 에스테르 삽입 막에 헤 마톡 염색 SVGs (상단 패널) 또는 SVGs (아래 패널)의 주사 전자 현미경의 대표 시야 이미지 (3 ㎛의 기공 크기) 차량 또는 t-PA (1 μM)와 24 시간 후 처리. 발음 t-PA에 의한 형태 학적 변화와 SVG 단층의 무결성을 중단 t-PA에 성상 세포 반응은 BBB 투과성에 t-PA의 효과를 기초 것을 제안, 관찰 할 수있다. 이미지는 두 개의 독립적 실험의 대표이다. SEM 이미지에 스케일 바는 repre61 μm의 (왼쪽) 또는 120 μm의 (오른쪽)를 보냈다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
뇌 병변에 의료 연구는 많은 번역 어려움을 겪고있다. 급성 허혈성 뇌졸중의 영역에서, 예를 들어, 동물 모델에서 큰 약속을 보여 많은 약물 클리닉 (38, 39)에 실패했습니다. 실망스러운 결과에 대한 이유는 다양하며 인간의 스트로크 시나리오 및 동물 연구 (21)에서 얻어진 결과의 과장에 임상 테스트 시스템의 부정이 (가) 있습니다. 임상 단계에 임상 연구 결과의 예측을 개선하는 한 가지 전략은 추가 개발 인간의 셀 기반 체외 모델에서, 이러한 새로운 약물 및 메커니즘 심사를위한 강력하고 비용 효율적인 툴을 제공하고 더 나은 임상 적으로 관련 도로에 초점을 허용 할 수 있습니다 21. 이 맥락에서, 우리는 여기에 상세하게 설명 인간의 불후의 천체의 새로운 조합을 이용하여 인간의 접촉 BBB 모델의 설립을위한 우리의 실험실에서 수행하는 프로세스cytes (SVGs)과 뇌졸중 관련 현상의 검사에 대한 인간의 차를 BECs.
(흐름)없이 정적 조건에서 (그림 1) 가장 생체 해부 구조를 닮은 BBB 모델에 연락하여 자신의 배리어 특성 13,17,18에서 우수한 것으로 나타나있다. 중요한 것은,를 BECs 및 성상 세포 사이의 진정한 접촉은 성상 교세포 말 피트와 엄격한 (이하 투과성) BEC 단층 14,15,27 이후의 유도의 통과를 허용 큰 구멍 직경 (≥ 1 μm의)와 세포막에 발생합니다. 그러나, 높은 기공 크기 반전 인서트에 교세포의 시딩 - 접촉 BBB 모델의 제조에 핵심 기술 요소 - 제한된 매체 볼륨 외에 반전 6.5 mm에 첨가 될 수 있기 때문에, 이중 기술적 도전을 제시 삽입 (~ 50 UL), 멤브레인 인해 그들의 큰 기공 직경 매체의 누설하는 경향이 있습니다. 이러한 제한은 AST를 만들 수있다rocytic 파종 어색하고 일관성.
3 ㎛의 기공으로 반전 삽입에 성상 세포를 파종을위한 우리의 혁신적인 기술이 프로 시저에 대한 간단하면서도 효과적인 솔루션을 제공합니다. abluminal 표면 위에 잘 제거, 불 침투성 실리콘을 만들면 우리는 매우 성공적으로 다공성 막에 부착하는 성상 세포의 능력을 향상. 이것은 abluminal 표면 성상 세포의 균일 한 성장을 가능하게하고 수 (예를 들어, BBB (28)에 5 개의 서로 다른 플라스 미노 겐 - 활성화 제의 효과를 특별히 최근 수행 스크리닝) 많은 실험적 파라미터의 동시 스크리닝 인서트 다수의 재현성 제제. 따라서, 단순에도 불구하고, 우리는 극적으로이 연락처 BBB 모델을 사용하여 우리의 연구의 처리량과 품질을 개선하기 위해 우리의 방법을 발견했다. 우리의 성상 세포의 파종 방법의 제한은 얇은 항구 삽입 (10 μ 수동으로 추가 처리를위한 필요 조건m 두께) 막. 과도하거나 거친 취급 마이크로 눈물 막에 손상을 줄 수 있습니다. 조립 / 분해가 최소한의 힘으로 수행 할 가지고 따라서, 부드럽고 유연한 실리콘 튜브의 사용은 필수적이다.
전반적인 개념에 관해서는, 우리 인간의 BBB 모델은 원래 인간의 기본 세포를 활용 이전에 설명 된 프로토콜 14,23 기반으로 설립되었다. BBB 모델링에 대한 자신의 우수성에도 불구하고, 인간의 기본 뇌 세포의 고용의 한 가지 단점은 정기적으로 차를 BECs 및 성상 세포 및 / 또는 상업적를 얻는데 필요한 비용을 정기적으로 생산을 위해 살아있는 인간의 뇌 조직에 액세스 할 수 없다는 것입니다. 많은 BBB 모델이 성공적으로 (쥐 C6 신경 교종 세포 (29) 예를 들어) 불후의 성상과 기본 성상 세포를 대체하기 때문에, 소설, 인간 BBB 모델링을위한 풍부하고 비용 효율적인 옵션으로 SVG의 성상 (22)을 사용하는 것이 합리적이었다. 에 SVGs의 능력긍정적 원칙적으로 BBB 연구에 대한 자신의 적합성을 검증 BEC 장벽 기능에 영향을 미친다. 반면에, 우리는 생체 내 1,2,9에서 BBB에서의 중요한 역할에 대한 우리의 BBB 모델에 기본를 BECs을 유지하기로 결정했습니다. 중요한 것은, 차를 BECs의 장기간 배양은 역 분화하고 그들의 BBB 특정 표현형의 저하가 발생할 수 있습니다. 이것은 참으로 알부민에 대한 다소 높은 투과도 값으로 우리의 시스템에 분명 할 수있다. 이러한 이유로, 우리는 고려의 높은 기저 투과성을 가지고, 주로 상대 패션 28 (그림 4)에서 우리의 모델을 사용하고 있습니다. 매우 타이트 인간 BEC 단분자막을 원하는 경우 장벽 기능은 더욱 이러한 글루코 코르티코이드 코르티손 (17) 또는 포스 포 디에스 테라 제 억제제 (13)와 고리 형 AMP 등의 화학 물질의 첨가에 의해 향상 될 수있다. 그러한 hCMEC/D3 세포주 40 불멸화를 BECs 인간은 또한 더 나은 TI를 유지하는 능력에 대해 사용될 수있다시간이 지남에 GHT 접합. 그러나, BEC 세포 라인은 종종 낮은 통로 차를 BECs (41, 42)에 비해 감소 장벽의 자질을 표시하고 신중하기 때문에 다른 잠재적 인 변화 (세포 표면 수용체, 즉 변형 된 표현)으로 간주해야합니다.
공동으로, (SVGs의 고용 즉) 성상 세포의 종류와 성상 세포 파종 프로토콜에 상당한 개선의 우리의 수정은 재현, 조립하기 쉽고 확실한 사람의 연락처 BBB 모델의 생성 결과. 마음에 한계가 베어링,이 시스템은 우리가 여기에서 28 예시 된 바와 같이, 급성 허혈성 뇌졸중뿐만 아니라 체외 조사를위한 유용한 도구 역할을 할뿐만 아니라 BBB의 변조를 포함하는 여러 가지 다른 뇌 병변의 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (허가 번호 606658)에서 RLM에게 수여 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
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