Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

Inrättande av mänskliga modeller av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​kan gynna forskning om hjärnans villkor förknippade med BBB misslyckande. Vi beskriver här en förbättrad teknik för framställning av ett kontakt BBB-modell, som tillåter samodling av humana astrocyter och hjärna endotelceller på motsatta sidor av ett poröst membran.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) ​​innefattar ogenomträngliga men anpassnings hjärnkapillärerna som är tätt styr hjärnans miljö. Fel på BBB har antytts i etiologin för många hjärn sjukdomar, skapar ett behov av utveckling av human in vitro BBB: modeller för att hjälpa till kliniskt relevant forskning. Bland de talrika BBB: modeller som hittills beskrivits, en statisk (utan flöde), kontaktar BBB-modellen, där astrocyter och hjärna endotelceller (BEC) är samodlades på motsatta sidor av ett poröst membran, framträdde som ett förenklat ännu giltiga system för att simulera BBB med hög throughput screening kapacitet. Trots den generation av modellen innebär några tekniska utmaningar. Här beskriver vi ett protokoll för framställningen av en kontakt humant BBB-modell med användning av en ny kombination av primära humana BEC och immortaliserade humana astrocyter. Specifikt vi detalj en innovativ metod för cellsådd på inverterade insatser samt ange INSERt färgningsteknik och exemplifiera hur vi använder vår modell för BBB-relaterad forskning.

Introduction

Den BBB är en specialiserad gränssnitt mellan den perifera blodcirkulationen och det centrala nervsystemet, ytterst ansvarig för underhåll av hjärn hemostas. Den innefattar distinkt hjärn mikrovaskulära endotelceller (BEC), vilka funktionellt är påverkade av några cellulära och acellulära komponenter (nedan) för att bilda en tät och dynamisk gateway in i hjärnan. Under fysiologiska förhållanden BBB begränsar passagen av blodceller, plasmakomponenter och skadliga ämnen, som alla potentiellt neurotoxiska, in i hjärnan. Samtidigt byter den BBB selektivt viktiga joner och näringsämnen (glukos och aminosyror) och metaboliska avfallsprodukter mellan hjärnan och cirkulationen att exakt hålla hjärnan miljön 1,2. På senare år har det blivit uppenbart att fel på BBB förekommer i en rad olika kroniska hjärn sjukdomar såsom neurodegenerativa eller inflammationsrelaterade sjukdomar (t.ex. Alzheimers sjukdom och multiple skleros, respektive) 3, samt vid akuta tillstånd som ischemisk stroke 4.

De unika BBB: egenskaperna för hjärnans endotelceller (BEC) till stor del framkallas av sin hjärn miljö 5, och i synnerhet av astrocyter 6,7. Det finns en växande insikt om att andra celltyper, såsom pericyter 8, neuroner och mikroglia 1,3 samt basalmembranet 9, stötta BEC och tillsammans bildar en funktionell enhet benämnd "neurovaskulära apparat" (NVU) som samtidigt par neuronala metaboliska krav till sina levererar kapillärer 10.

Medverkan av BBB i patologiska situationer ligger bakom många försök att utveckla in vitro BBB: modeller för att hjälpa till BBB-relaterad forskning 11,12. Dessa modeller syftar till att härma så nära som möjligt in vivo BBB: egenskaper enligt NVU princip. In vitro 13, människa 14, råtta 15, mus 16, och svin 17,18 ursprung), odlade på ett poröst membran tillsammans med stödjande astrocyter (utför granskats av Deli et al. 2005 11).

Astrocyter kan odlas i icke-kontaktförhållanden på botten av en vävnadsodlingsbrunn, skild från BEC (som odlats på den övre ytan av membranet) av odlingsmediet ännu kommunicerar med BEC via lösliga faktorer 16. I mer avancerade modeller som bättre liknar den anatomiska strukturen av BBB in vivo, är astrocyter bibehålls i kontaktbetingelser och odlades direkt på den motsatta sidan av membranet i nära anslutning till BEC 13,15,17 (figur 1). Denna konfiguration gör att fysisk kontakt mellan BEC och astrocyter, upprättas när astrocyter projektsina processer genom det porösa membranet. Viktigt är att för en sann kontakt inträffa porerna bör ≥ 1 um i diameter, eftersom astrocytiska slut fötter inte kan passera genom mindre porstorlekar (dvs. 0,4 ^ m) 14,15. Noterbart är kontakt BBB: system visats i några studier att vara överlägsna sina beröringsfria motsvarigheter om deras trans endothelial elektriskt motstånd (TEER) och endothelial permeabilitetsvärden av olika spårämnen 13,17,18. En ytterligare dimension av medieflödet har nyligen lagts i ett antal in vitro-BBB: modeller för att tillämpa skjuvkrafter till endotelet för närmare simulering av hjärnans vaskulatur 12,19.

Ett tekniskt hinder att övervinna när alstring av en kontakt BBB modell är odling av astrocyter mot tyngdkraften på den abluminala ytan av det porösa membranet. Tidigare protokoll 13,20, där astrocyter helt enkelt seedade i en droppe media ovanpå en iomvandlas insats, tillåts endast korta sådd tider (dvs. 10 min 13 eller 2 tim 20) som fanns i våra händer för att vara otillräckligt för korrekt cellbindning. Med hjälp av denna grundläggande metod, kräver en längre astrocyternas fästperiod konstant övervakning av insatserna genom frekvent öppning av inkubatorn (orsakar variationer i temperatur, pH och fuktighet) och är också benägna att ojämn cell sådd på grund av läckage av media genom porerna, särskilt om porer större än 1 mikrometer används.

Här beskriver vi ett allmänt protokoll för framställning av ett kontakt BBB modell. Vår procedur innehåller en alternativ metod för cellsådd på inverterade insatser, som rör de ovan nämnda begränsningar. Förfarandet medger ostörd vidhäftning av astrocyter på abluminala membranytan, i en jämviktad inkubator under en utsträckt tidsperiod. Som ett resultat, är en likformig ympning av astrocyter kommas vilket ökar barriärkvalitetoch minimerar basala permeabilitet variationer mellan skären.

Eftersom användningen av mänskliga celler är viktigt för mänsklig-relevant forskning 21, vi dessutom visa i denna artikel den specifika användningen av en ny kombination av primära humana BEC och förevigat mänskliga astrocyter för inrättandet av en kontakt mänsklig BBB-modell med en hög throughput screening kapacitet . Eftersom visning av celler på porösa membran kan vara svårt, vi också detalj färgningsteknik som kan bistå i fastställandet av sammanflöde och cellmorfologi på porösa membran. Slutligen, vi exemplifiera hur vår mänskliga BBB-modellen kan användas för att undersöka effekten av vävnad plasminogenaktivator (t-PA) - en koagulering busting enzym som fungerar som ett enda behandlingsalternativ för akut ischemisk stroke - på BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture (3-7 dagar före till BBB Assembly)

1,1. Primära Human Brain mikrovaskulära endotelceller (BEC)

BEC var kommersiellt erhållas. Cellerna producerade av dispas dissociation av normala mänskliga hjärnan cortex vävnad och förutsatt frysta vid passage 3 (<12 populationsfördubblingar).

  1. Substratum: Coat vävnadsodlingskärl med "Attachment Factor" enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Cell underhåll: Underhåll BEC i serum innehållande komplett medium. För experiment, kultur BEC i fullständig serumfritt medium. Behåll cellerna i en fuktad 5% CO2, 21% O2-inkubator vid 37 ° C
    Anmärkning: Som ett alternativ till specialiserade reagens, 0,1% (vikt / volym) gelatin lösning kan fungera som en beläggningsreagens medan DMEM/F-12 kompletterat med 15 mM HEPES, 10% (volym / volym) fetalt kalvserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 50 | ig/ Ml gentamycin, 20 | ig / ml heparin och 20 | ig / ml endotelceller tillväxtsupplement kan användas för BEC underhåll.
  3. Sub-odling för experiment: Split sammanflytande BEC i förhållandet 1:03 till 01:06, beroende på avsedd tid för nästa användning (3-7 dagar). Ändra upprätthållande medium var 3 dagar. Använd BEC upp till 15 passager.

1,2. SVG Human Fetal astrogliala Cell-linje

SVG humana fetala astrogliaceller 22 ursprungligen var härledda från primära kulturer av human fetal hjärna transformerad med replikationsdefekt simianvirus 40.

  1. Underhåll: Kultur SVG-celler i minimalt essentiellt medium med Earles balanserade saltlösning kompletterad med 20% (vol / vol) FCS (samma serum procentsats som används för att bibehålla sina föräldra primära celler 22), 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin. Behåll cellerna i en fuktad 5% CO2, 21% O2
  2. Sub-odling för experiment: Split sammanflytande SVGs i förhållandet 1:05 till 01:10, beroende på avsedd tid för nästa användning (3-7 dagar). Avlägsnande av trypsin är inte nödvändig på grund av den höga halten av serum i mediet. Ändra mediet var 3 dagar. Använd SVGs upp till 20 passager.

2. Montering och samodling av Human In vitro BBB Model (dag 0)

Kommentar: Den människa in vitro kontakt BBB är förberedd enligt publicerade protokoll 13,23, med ändringar.

2,1. Beläggning av Inserts

  1. Placera vävnadskulturinsatser (6,5 mm i diameter med polyester poröst membran, 3 ìm por-storlek) i brunnarna i den medföljande 24-brunnar. Coat den luminala ytan av skären över natt i en fuktad 37 ° C inkubator med råttkollagen I (20 | ig / cm 2; 50 | il av 132 | ig/ Ml kollagen I i 0,02% ättiksyra i Milli-Q-vatten (MQH 2 O)). Tvätta skären en gång (både från den abluminala och luminala sidan) med MQH 2 O för att avlägsna kvarvarande syra.
    OBS: Basement membran av hjärn kapillärer innehåller inga kollagen I, men främst lamininer, kollagen typ IV-isoformer, nidogens och heparansulfatproteoglykaner 9. Av detta skäl har vissa forskare använder beläggningsmedel, såsom kollagen IV, fibronektin 13 eller Matrigel (BD Biosciences) 16 för en mer autentisk BBB modellering.

2.2. Seedning SVGs På undersidan (abluminala) membranyta

  1. Invertera insatsen och försiktigt passa runt kanten av det porösa membranet ett kort stycke av elastiskt silikonslangar ("yttre röret", ~ 10 mm lång, 8 mm innerdiameter, 1,6 mm vägg), vilket skapar i huvudsak en ny väl över den abluminala ytan (Figur 2A).
  2. Undersidan av insatsen needs som skall tätas för att undvika läckage medier. Först bereds en plugg (Figur 2A och 2B) gjorda av ett silikonrör (benämnda "inre röret", ~ 8 mm långa, 3,2 mm innerdiameter, 1,6 mm vägg, fig. 2B), förslöts vid ena änden med en plasttätningskona (~ 3 mm lång, förberedd genom att skära ned i en 0,2 ml polymeraskedjereaktion (PCR) rör; Figur 2B). Denna kon tätar inte bara de interna slang lumen, men också vidgar sin kant för tätare montering i insatsen. Nästa, med hjälp av en steril pincett, sätt in silikon kontakten i luminala hålrum och matar det tills den når upp till ~ 1-2 mm från membranet (Figur 2A).
  3. Därefter utsäde 4 x 10 4 SVG-celler i 200 l SVG underhållsmedium (seInsatser 1.2.2 ovan) direkt in i silikon väl över den abluminala membranytan (figur 2A). Tillåt SVGs vidhäfta under åtminstone 4 h i inkubatorn.
    OBS: För att bibehålla sterilitet transportera de församlade skär in mellan två 6-brunnar (en tallrik inverterad över den andra, Figur 2C) för att minimera exponeringen för ofiltrerad luft under förfarandet. Silikon rör och pluggar tvättas i etanol och autoklaverades för senare användning.
    Obs: Använd pluggar (avsnitt 2.2.2) endast för skär med membran por storlekar större än 1 mikrometer. Membran med pordiameter ≤ 1 mikrometer läcka sällan och kräver endast montering av den externa slangen silikon (avsnitt 2.2.1). Dessutom några andra än kollagenbeläggningsmedel I (se not till avsnitt 2.1) kan förhindra leakiness även genom 3 ìm porer. Bestäm detta empiriskt.
  4. För att övervaka efterlevnaden tillstånd av dina astrocyter, utsäde parallellt ien standard 96-väl en identisk volym av astrocyternas cellsuspension. Denna väl har samma yta som 6,5 mm insatsen (0.33 cm 2) och tillåter enklare visualisering av celler genom faskontrastmikroskopi än insatsen membranet. När du observerar tillräcklig vidhäftning av astrocyte i kontroll 96 brunnar har astrocyterna adekvat följs också på insatsen membranet.
  5. Då astrocyter har tillräckligt anslutit sig på kontroll 96 brunnar, överföra insatsenheterna till vävnadsodling huven (se not ovan) och ta försiktigt bort den yttre slangen och pluggar silikon. Återgå skär till den normala (dvs. upprätt) orientering i de medföljande brunnar innehåller 800 l / brunn av BEC underhåll medium (avsnitt 1.1.2 ovan).

2,3. Ympning av BEC i Luminal kammaren ovanför Astrocyter

Seed 2x10 4 BEC i 200 ^ har laddats in i kollagenbelagda luminalyta och returnera otryggrts i inkubatorn.

2,4. Samodling

Coculture de SVG / BEC-seedade skär för 3 dagar i BEC medium utan media förändring innan försöket.

3. Experiment med Human BBB Model (Dag 3)

  1. För att stimulera in vitro BBB: första tvättceller genom att ersätta de abluminala och luminala media med 600 ^ il och 100 | il av serumfritt BEC-medium resp.
  2. Aspirera luminala mediet igen och ersätt med 100 | il av serumfritt medium med stimulerande medel.
    OBS: Om stimulering av abluminala kammaren krävs (för att aktivera in vitro BBB från astrocytisk facket), aspirera abluminala medium och ersätta med 600 ul av serumfritt medium med stimulerande medel.
  3. Testa varje försöksgrupp i tre exemplar (därav, om luminala stimulering utförs, vilket kräver 3 x 100 l, rekommenderar vi att späda re medel till deras slutkoncentrationer i 350 ul av ett serumfritt medium per grupp för att minimera pipetteringsfel mellan brunnar).
  4. Utför standard paracellulära och / eller transcellulära permeabilitet analyser av märkta spårämnen 16,24 (den senare vi använder fluorescein-isotiocyanat (FITC)-konjugerat albumin) och / eller mätning av TEER 13,16,25 som tidigare beskrivits.

För att ta hänsyn till variationer i baslinjen permeabilitet mellan experiment, analysera förändringar i permeabilitet i förhållande till en belagd insats utan celler (som tjänar som referens för maximal permeabilitet) samt till fordons-behandlade gruppen med hjälp av formeln: permeabilitet (% av max) = ( permeabilitet värdet av experimentell insats - medelpermeabiliteten fordonets värde gruppen) / (permeabilitet värdet av blankinsatsen - medelpermeabiliteten fordonets värde gruppen) x 100.

4. Visualisering av celler på porösa membran

nt "> Kommentar: Ofärgade celler på skärs membran är svåra att observera med fas kontrast eller differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi eftersom membranet är helt ogenomskinlig och stör ljustransmission För att hantera denna fråga som vi utvecklat olika färgningsförfaranden av celler på. skär, vilket i hög grad ökar cell utseende på membranet. Generellt fläcka insatsmembran samtidigt fäst vid insatsen, i brunnarna. Membranen bör endast tas bort i slutet av färgningsproceduren för monteringsändamål.

4,1. Hematoxylin Färgning

  1. Fix skär med iskall 4% (vikt / volym) paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) under 20 min. Tvätta en gång i PBS.
  2. Sänk skäret i 0,1% Mayers hematoxylin-lösning under 2 min.
  3. Tvätta försiktigt insatsen med kranvatten (genom att sänka insERT i en bägare innehållande kranvatten och att försiktigt pipettera överskottsvattnet ut). Överför inlägget till Scotts lösning kranvatten (2 g / L NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) för ~ 20 sekunder tills önskad blå färg utvecklas. Tvätta insatsen igen med kranvatten (avsnitt 4.1.3). En valfri eosin fläcken kan införas här genom att doppa insatsen i 1% eosin lösning för 10 sekunder följt av en kranvatten tvätt.
  4. Lufttorka insatsen membranet. Med hjälp av en skalpell (skära runt membrankanten) avlägsna membranet och montera den på en glasplatta för ljusfält avbildning
    Obs: Om di-N-butylphthalateinxylene (DPX) monteringsmedium utnyttjas tvätta insatsen med 100% etanol följt av xylen före demontering och montering av membranet.

4,2. Svepelektronmikroskop (SEM)

  1. Fix skär med iskall 4% (vikt / volym) PFA i PBS under 20 min. Tvätta tre gånger i PBS.
  2. Efter fixera membranen till 30 min i 1% (vikt / volym) Osmiumtetroxid i MQH 2 O.
  3. Tvätta skär i vatten (avsnitt 4.1.3) och dehydrera i en eskalerande etanol-gradient (50%, 70%, 90% under 5 min vardera, sedan 3x med 100% etanol under 10 min per intervall).
  4. Behandla dehydratiserade skär med en blandning av hexametyldisilazan (HMDS): etanol (01:02 sedan 02:01 i 5 min).
  5. Behandla skär med 100% HMDS för 5 min, lufttorka och förvara under torkade betingelser.
  6. Ta bort membranet med användning av en skalpell (skära runt membrankanten). Undersök membran genom svepelektronmikroskopi.

4,3. Immunofluorescens

  1. Fix skär med iskall 4% (vikt / volym) PFA i PBS under 20 min, tvätta en gång i Tris-buffrad saltlösning (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 ^ m filtrerad).
  2. Utför immunfärgning av cellerna på insatsen membranet som tidigare beskrivits 26.
  3. Ta bort membranet med hjälp av en skalpell (skär runt membrankanten) och montera den på en glass glida med fluorescens monteringsmedel. Undersök membran genom fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att skapa en människa, kontakta BBB-modell som vi var tvungna att odla SVGs och BEC på porösa membran med en 3 ìm porstorlek, visat att medge passage av astrocyternas slut fötter för kontakt med endotelceller 14,15,27,28. En schematisk representation av den kompletta kontakt modellen illustreras i Figur 1 (vänster bild). Den största tekniska utmaningen presenteras av ett kontaktsystem är behovet av att seeda astrocyter mot tyngdkraften på abluminala membranets yta. Vi har lyckats med denna uppgift genom att huvudsakligen skapa ett borttagbart silikon väl på toppen av den abluminala membranytan och samtidigt förhindra läckage av media med ett ytterligare silikonplugg införes i den luminala kavitet (fig 2). Metoden tillät en optimal, oavbruten seeding period SVGs (minst 4 timmar), vilket i sin tur blev starkt knutna till den porösa ytan med minimal cellförlust. Indeed, 3 dagar efter ympning både SVGs och BEC appeneared sammanflytande och täckte membranet jämnt, bedömt från bilder av hematoxylin-färgade insatser (se avsnitt 4.1, figur 3A, vänster paneler). Dessutom båda celltyperna bibehålls sina cellspecifika markörer på porösa membran (en diffus färgning mönster av gliafibrillärt surt protein i SVGs 22 och uttryck av von Willebrand-faktor i Wiebel-Palade organ och cytoplasmiska blåsor i BEC, Figur 3A, höger sida) , observerades av immunofluorescens (avsnitt 4.3). Vidare från SEM imaging (avsnitt 4.2) blev det uppenbart att SVGs och BEC var kapabla att växa direkt över membranporerna (Figur 3A, mellersta paneler, pil huvuden), ett fenomen som på konstgjord väg bidrar till den fysiska barriärfunktion in vitro BBB kontakt modeller1 3,28. Funktionellt, i närvaro av SVGs den endoteliala permeabilitetsvärde (Pe) 16,24 av fluorescerande albumin 28 förbättcs ~ 4 gånger i förhållande till BEC ensamt (P <0,01, n = 4), från 0,574 ± 0,199 x 10 -3 till 0,126 ± 0,028 x 10 -3 cm / min utan eller med astrocyter (SVGs), respektive. Dessa albumin Pe resultat är jämförbara med en annan studie med musen BEC med rått C6 gliomceller 29. Vår sådd protokoll framgång tillämpas även på färska isolerade primära mus BEC och primära mus astrocyter odlas på 1 ìm porer. I denna mus kontaktmodell fick vi en rimlig fysisk barriär för den lilla hydrofila spår natriumfluorescein (Pe = 0,83 ± 0,22 x 10 -3 cm / min, n = 3). Därför kan vår sådd metod förlängas för beredning av BBB: modeller från andra arter.

Den mest grundläggande inslag i en kontakt BBB-modellen är möjligheten för astrocyter att projicera sina slut fötter genom membranporerna att fysiskt kontakt med endotelceller. Några studier som använt sig av svepelektronmikroskop för att identifiera astrocyterna processer som passerar från abluminala membranytan (där astrocyterna är seedade) till luminalytan, som ett bevis på principen att kontakten mellan astrocyter och EC är rimligt 14,15,27. Efter dessa studier har vi avbildas av SEM den luminala membranet efter sådd SVGs på den abluminala ytan. Såsom visas i figur 3B, kan astrocytisk (SVG) slut fötter observeras passerar genom 3 | im porer i det luminala utrymmet, vilket bekräftar att kontakt kan eventuellt finnas mellan SVGs och BEC ympades på porerna i denna dimension. Kollektivt vår seeding metod var enkel, effektiv, och gav en äkta kontakt BBB modell.

Vi har använt vårt mänsklig kontakt BBB-modell för att undersöka effekten av t-PA, ett fibrinolytiskt medel, på BBB. Ett antal artiklar har föreslagit att t-PA kanske kan framkalla öppning av BBB under dess intravenös administrering vid behandling av akut ischemisk stroke 30-33. Denna växelverkan mellan t-PA och den BBB kan bidra till blödningskomplikationer som är förknippade med t-PA-inducerad trombolys 4,34,35 och är således ett föremål för aktuella forskningsinsatserna. Våra studier in vitro bekräftat att t-PA faktiskt ökade permeabilitet intakt BBB på ett koncentrations (Figur 4A) och tidsberoende sätt (Figur 4B), som båda var inom ett farmakologiskt relevanta intervallet 36,37. Vidare skulle dramatiska morfologiska förändringar av SVG astrocyter observeras på de porösa membranen efter exponering för t-PA (Fig. 4C), vilket antyder att astrocytiska svar på t-PA-underligga t-PA-inducerad BBB öppning. Efterföljande undersökning identifierat att t-PA stimulerar astrocyter via aktivering av plasminogen - dess naturliga substrat - i den potenta och bredspektrum proteas plasmin. Vidare har t-PA och plasmin befunnits aktivera Rho-kinas (ROCK) signalering i astrocyter, och blockad av ROCK vägen hindrade t-PA-inducerad BBB öppning 28. Detta är ett bra exempel på hur användningen av BBB: modeller kan leda till identifiering av nya biologiska processer och terapeutiska möjligheter.

Figur 1
Figur 1. För in-baserade konfigurationer av in vitro-BBB: modeller. Schematiska representationer av statisk (utan flöde) in vitro BBB: modeller. I grundmodeller hjärn endotelceller (ECS, orange) odlas ensam på ett poröst membran (gul). I mer avancerade metoderna EC är samodlades med astrocyter (grön). Astrocyter kan odlas antingen i icke-kontaktförhållanden, på botten av brunnen (till höger), eller på den abluminala ytan av det porösa membranet i kontaktförhållanden (vänster).nk "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. En förbättrad metod för astrocyt ympning på den abluminala membranytan för framställning av en kontakt BBB modell. (A) Insatsen är inverterad, en kort bit silikonslang ("yttre röret") är monterad runt dess omkrets och en silikonpropp inpassad i den luminala kaviteten. Denna anordning skapar en väl ovanpå abluminala ytan och förhindrar material från att läcka genom porerna. Celler kan ympas i brunnen och fick vidhäfta ostörd under utsträckta tidsperioder (till höger) (B) Den silikon kontakten är framställda från en annan bit av silikonslang ("inre röret"), förslöts vid ena änden med en tätande kona som sätts in i dess hålighet. (C) När seedade, denmonterade skär transporteras mellan två 6-brunnar (en platta inverterad över den andra) för att minimera risken för kontaminering. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Visualisering av hjärnans endotelceller (BEC) och astrocyter på en 3 ^ m poröst membran A) Hematoxylin (vänstra panelen), svepelektronmikroskop (SEM,. Mellanpaneler) och immunfluorescensbilder (högra fälten) av SVGs (på den abluminala ytan, 40000 per 6,5 mm insats, krönskivor) och BEC (20.000 per 6,5 mm insert på kollagen I belagda, luminal yta, bottenplåtar) odlas på en 3 um poröst membran i 3 dagar (utan samodling). Båda celltyper når sammanflödet inom denna tid framig och underhålla sina cellspecifika markörer (gliafibrillärt surt protein (GFAP) för SVG och von Willebrands faktor (vWF) i Wiebel-Palade organ för BEC, höger sida) på membranet. Pilhuvuden i SEM paneler ytterligare visa förmågan hos båda celltyperna för att direkt växa över och täcka porerna, medan pilarna representerar cellkärnor. Skalstrecken på SEM-bilder representerar 25 um (överst) eller 20 | am (botten). Skala barer på immunofluorescens bilder representerar 40 um. (B) SEM-bilder av SVG slut fötter passerar genom 3 ìm porer i luminala (BEC) yta 3d eftersådd av SVGs (enbart) på abluminala membranytan. Dessa bilder validera potentialen för utveckling av verklig kontakt mellan SVGs och BEC i vår mänskliga BBB-modell. Skalstrecken representerar 6 um på den vänstra panelen och 12 um på den högra panelen. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 1, vänstra panelen.

Figur 4
Figur 4. vävnadstyp plasminogenaktivator (t-PA)-medierad ökning av BBB permeabiliteten drives av morfologiska förändringar hos astrocyter. (a) ökning av t-PA-koncentrationer tillsattes till den luminala kammaren hos human in vitro-BBB och permeabilitet bestämdes 24 tim senare genom passage av fluorescerande albumin i abluminala kammaren. t-PA ökade BBB permeabiliteten på ett koncentrationsberoende sätt. n = 4-6 för alla grupper, men t-PA 10 nM, där n = 2. *** P <0,001 jämfört med alla andra grupper genom en envägs ANOVA med Newman-Keuls-(B) t-PA (1 | iM) tillsattes till den luminala kammaren hos människa i efterhand.vitro BBB för 8 timmar och 24 timmar innan permeabilitet bedömning. Såsom visas, var t-PA-förmedlad BBB öppning redan betydande 8 h efter stimulering (70,26% av det maximala vid 24 h), men en ytterligare ökning observerades vid 24 tim. n = 6, *** P <0,001, ** P <0.01compared till noll genom en envägs ANOVA med Newman-Keuls post hoc. I både (A) och (B), barer / datapunkter representerar medelvärde ± SEM. (C) Representativa ljus-fält bilder av Haematoxylin-färgade SVGs (topp paneler) eller svepelektronmikrofotografier av SVGs (bottenplåtar) på polyester Inlägg membran (3 ^ m porstorlek) 24 timmar efter behandling med vehikel eller t-PA (1 | iM). Kan observeras Uttalade t-PA-inducerade morfologiska förändringar och avbrott i SVG-monoskiktet integritet, vilket antyder att astrocytiska svar på t-PA som ligger bakom effekten av t-PA på BBB-permeabilitet. Bilder är representativa för två oberoende experiment. Skala barer på SEM-bilder represkickade 61 um (till vänster) och 120 nm (höger). Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medicinsk forskning om hjärnans sjukdomar lider mycket translationell svårigheter. Inom området akut ischemisk stroke, till exempel många läkemedel som visade mycket lovande i djurmodeller misslyckades på kliniken 38,39. Orsakerna till dessa nedslående resultat är varierande och innefattar otrohet av de prekliniska testsystem till den mänskliga stroke scenariot och överskattning av resultat från djurstudier 21. En strategi för att förbättra det prediktiva värdet av prekliniska resultat till klinisk fas är ytterligare utveckling av human cellbaserade in vitro-modeller, dessa kan ge potenta och kostnadseffektiva verktyg för screening av nya läkemedel och mekanismer och möjliggöra bättre fokus på kliniskt relevanta vägar 21. I detta sammanhang beskrev vi i detalj här processen genomförs i vårt laboratorium för att upprätta en mänsklig kontakt BBB-modell som använder en ny kombination av mänsklig förevigat astrocyter (SVGs) och humana primära BEC för granskning av strokerelaterade fenomen.

Under statiska förhållanden (utan flöde), kontakta BBB: modeller (Figur 1) liknar mest den vivo anatomiska struktur och visar sig vara överlägsen i sina barriäregenskaper 13,17,18. Huvudsakligen sker riktig kontakt mellan BEC och astrocyter endast på membran med större pordiameter (≥ 1 mm), som tillåter passage av astrocytiska slut fötter och därpå följande induktion av stramare (mindre genomsläppliga) BEC monolager 14,15,27. Men odling av astrocyter på inverterade skär med större porstorlek - kärnan tekniska inslag i utarbetandet av en kontakt BBB-modellen - innebär en dubbel teknisk utmaning, eftersom utöver den begränsade medelhög volym, som kan läggas till de inverterade 6,5 mm inserts (~ 50 ul), membranen är också benägna att läckage av mediet på grund av deras stora pordiameter. Dessa begränsningar kan göra astrocytic sådd tafatt och inkonsekvent.

Vår innovativa teknik för sådd astrocyter på inverterade skär med 3 ìm porer erbjuder en enkel men effektiv lösning för detta förfarande. Genom att skapa en löstagbar, ogenomtränglig silikon väl ovanpå den abluminala ytan vi förbättrats avsevärt astrocyterna förmåga att framgångsrikt hålla fast vid det porösa membranet. Detta möjliggör jämn tillväxt av astrocyter på abluminala ytan och medger reproducerbar beredning av ett stort antal insatser för samtidig screening av många experimentella parametrar (t.ex. vår nyligen utfört screening av effekten av fem olika plasminogen-aktivatorer på BBB 28). Därför, trots sin enkelhet, hittade vi vårt sätt att dramatiskt förbättra genomströmningen och kvaliteten på vår forskning med denna kontakt BBB-modell. En begränsning hos vår astrocyt seeding metod är kravet på extra manuell hantering av insatserna som hyser tunn (10 μm tjock) membran. Överdriven eller ovarsam hantering kan orsaka mikro-tårar och skador på membran. Därför är användningen av mjuka och flexibla silikonslangar nödvändigt eftersom montering / demontering måste utföras med minimal kraft.

När det gäller dess övergripande koncept, blev vår mänskliga BBB-modell som bygger på en tidigare beskrivna protokoll 14,23 som ursprungligen utnyttjade primära humana celler. Trots sin överlägsenhet till BBB-modellering är en nackdel i anställning av primära mänskliga hjärnceller oförmågan att rutinmässigt komma levande mänsklig hjärnvävnad för regelbunden produktion av primära BEC och astrocyter och / eller kostnaderna för att kommersiellt få dem. Eftersom många BBB: modeller med framgång ersätta primära astrocyter med förevigade astrocyter (t.ex. med en råtta C6 gliomceller 29), var det rimligt att använda SVG astrocyter 22 som en roman, riklig och kostnadseffektivt alternativ för human BBB-modellering. Förmågan hos SVGs tillpositivt påverka den BEC barriärfunktion validerats i princip deras lämplighet för BBB: studier. Däremot valde vi att hålla primära BEC i vår BBB-modell för sin avgörande roll i BBB in vivo 1,2,9. Viktigt kan långvarig odling av primära BEC leda till de-differentiering och försämring av deras BBB-specifik fenotyp. Det kan visserligen vara tydlig i vårt system genom en ganska hög endothelial permeabilitetsvärden för albumin. Därför har vi använt vår modell främst i ett relativt sätt 28 (Figur 4), med beaktande av dess upphöjda basala permeabilitet. Om en mycket snäv humana BEC monoskiktet är önskvärd barriärfunktion kan förbättras ytterligare genom tillsats av kemikalier såsom glukokortikoiden hydrokortison 17 eller cyklisk AMP med fosfodiesterashämmare 13. Odödliggjorda humana BEC, såsom hCMEC/D3 cellinjen 40, skulle också kunna användas för deras förmåga att bättre bibehålla tiGHT korsningar över tiden. Ändå BEC cellinjer visar ofta minskad barriäregenskaper jämfört med låg-passage primär BEC 41,42 och måste beaktas noggrant på grund av andra potentiella förändringar (dvs. förändrat uttryck av receptorer på cellytan).

Kollektivt vår modifiering av astrocytisk celltyp (dvs. anställning av SVGs) och den betydande förbättring av astrocyternas seeding-protokollet gav generering av en reproducerbar, enkel att montera och äkta mänsklig kontakt BBB-modell. Med tanke på dess begränsningar, kan systemet fungera som ett användbart verktyg för in vitro-undersökning inte bara av akut ischemisk stroke, eftersom vi exemplifieras här 28, men också av flera andra hjärn patologier som involverar modulering av BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie har finansierats av bidrag som beviljats ​​till RLM från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (bidrag # 606.658).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Tags

Bioteknik Blod-hjärnbarriären modell cellodling astrocyter hjärn endotelceller insert membran
Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter